디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 낮은 농도에서 미생물 측정

이 실험의 전반적인 목표는 디지털 홀로그램 현미경을 사용하여 매우 낮은 수준에서 미생물을 검출하는 것을 입증하는 것입니다. 이 기술은 기존의 광학 현미경보다 더 민감하며 박테리아 거동에 대한 실시간 정보를 제공합니다. 이 방법은 물에서 병원성 유기체를 찾거나 얼음 위성에서 태양계 내의 생명을 찾는 것과 같은 생물학 및 우주론 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 DHM이 체적 기법이라는 것인데, 이는 물리적으로 다시 초점을 맞출 필요 없이 샘플에서 3차원 정보를 즉시 캡처할 수 있다는 것을 의미합니다. 이 기술의 의미는 낮은 박테리아 농도를 감지하는 능력 때문에 혈류 또는 뇌척수액 감염의 진단으로 확장됩니다. 이 절차를 시작하려면 실험 당일에 0.6에서 0.7 범위로 예상되는 박테리아 마스터 배양물의 분광 광도계 판독을 수행합니다.

그런 다음 마스터 배양 샘플을 채취하고 Petroff-Hausser 계수 챔버를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 모두 계수합니다. 마이크로피펫을 사용하여 희석되지 않은 배양액의 10마이크로리터 샘플을 챔버로 옮깁니다. 위상차를 사용하여 고건조 대물 현미경으로 이미지화합니다.

그런 다음 박테리아를 최소 20개의 제곱으로 세고 평균을 냅니다. 농도를 20제곱의 평균에 희석 계수를 곱한 값으로 계산합니다. 살아있는 세포만 열거하려면 20마이크로리터의 박테리아 용액을 다른 웰로 옮기고 180마이크로리터의 식염수로 희석하여 선택한 각 박테리아 샘플을 멸균 0.9% 식염수로 연속 희석합니다.

가장 낮은 농도가 밀리리터당 3개의 셀에 대해 약 10이 될 때까지 절차를 반복합니다. 다음으로, 최소 2개의 희석액에서 100마이크로리터의 샘플을 취하여 적절한 고체 매체 플레이트에 플레이트합니다. 멸균 스프레더로 펴고 각 희석액을 최소 3회 반복합니다.

그 후, 하룻밤 동안 또는 군체가 자랄 때까지 적절한 온도에서 배양하십시오. 그런 다음 식민지를 세십시오. 군체 형성 단위를 계산하고 반복실험에 대해 평균을 구합니다.

이 절차에서는 DHM을 위한 마스터 배양을 연속적으로 희석하고 용융성 배지 플레이트에서 CFU의 DHM 후 계수를 수행합니다. 박테리아를 운동성을 촉진하지만 세포 분열을 억제하는 최소 배지 25ml로 희석하여 실험 중에 세포 농도가 눈에 띄게 변하지 않도록 합니다. 멸균 주사기를 사용하여 DHM 비디오를 녹화하려면 약 10ml의 관심 희석액을 끌어들입니다.

그런 다음 멸균 피팅과 튜브를 사용하여 주사기를 DHM 시료 챔버에 연결합니다. 주사기 펌프를 사용하여 주사기에서 시료 챔버를 통해 시료를 지속적으로 흐르게 합니다. 샘플이 샘플 챔버를 통해 흐를 때 적절한 프레임 속도로 홀로그램을 연속적으로 획득합니다.

전체 10ml의 샘플이 DHM을 통해 흐를 수 있도록 충분한 시간을 허용합니다. 실험 중에 박테리아가 성장하거나 죽지 않도록 하려면 멸균 스프레더로 펴서 사용한 DHM 이미지 캡처 후 100마이크로리터의 농축 배지 플레이트를 접종합니다. 그런 다음 군체를 세기 전에 24시간 동안 적절한 온도에서 배양하십시오.

정확한 세포 수를 갖는 것은 검출 한계를 정량적으로 결정하는 데 필수적입니다. 보정된 마이크로피펫을 사용하여 모든 희석을 세심하게 수행하고 Petroff-Hausser 챔버에서 광학 밀도, 도금 및 직접 계수로 모든 계수를 확인하는 것이 중요합니다. 획득한 홀로그램 비디오에서 박테리아 존재에 대한 데이터를 분석하려면 먼저 이미지를 32비트 형식으로 변환하여 매체 빼기 필터링을 수행합니다.

그런 다음 중앙값 픽셀 값을 계산합니다. 마지막으로, 각 픽셀에서 이 중앙값을 빼서 홀로그램에서 고정된 아티팩트를 제거합니다. 그런 다음 가시 영역 링과 초점이 맞는 셀의 수를 수동으로 계산합니다.

각 홀로그램 시리즈에는 타임스탬프 파일이 함께 제공됩니다. 타임스탬프 파일을 사용하여 이미지가 캡처된 시점에 펌핑된 샘플의 총량을 계산합니다. 그런 다음, 검출된 총 세포 수를 이미징된 샘플의 총 부피로 나누어 세포 밀도를 계산합니다.

정확한 통계를 위해 평균 5-10프레임. 이 플롯은 365마이크로미터 x 365마이크로미터 x 1밀리미터의 샘플 부피를 기반으로 시야당 예측된 셀을 보여줍니다. 시야당 세포 수가 1 미만으로 떨어지는 농도의 경우 검출을 위해 여러 이미지가 필요합니다.

이것은 플레이트 수로 측정된 밀리리터당 2, 100개의 세포에서 Serratia marcescens 배양의 DHM 홀로그램 염기서열입니다. 이 시퀀스는 대략 1-2초마다 하나의 셀을 보여주며, 이는 예측에 매우 적합합니다. 그리고 이것은 플레이트 수로 측정된 밀리리터당 620개의 세포에서 Serratia marcescens 배양의 또 다른 DHM 홀로그램 염기서열입니다.

이 시퀀스는 대략 6-7초마다 하나의 셀을 보여줍니다. 디지털 홀로그램 현미경을 사용하여 세포를 이미지화할 때는 모든 용액을 준비할 때 필터 멸균 기술을 사용하는 것을 잊지 마십시오. 이렇게 하면 기기에 미립자 물질이 유입되는 것을 방지할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 건강한 세포 배양을 준비하고 여분의 성장 배지, 플레이트 및 운동성 배지를 준비해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 살아 있는 세포와 죽은 세포의 비율과 같은 추가 질문에 답하기 위해 형광 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 미생물학 분야의 연구자들이 배양된 세포와 환경 샘플에서 3차원 운동성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 홀로그램 현미경을 사용하여 박테리아를 계수하고 다른 계수 기술을 사용하여 결과를 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 박테리아 배양물을 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 살아있는 유기체를 성장시키고 취급할 때는 항상 적절한 생물 안전 예방 조치를 취해야 합니다.