Name: 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 낮은 농도에서 미생물 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 배우세요 디지털 홀로그램 현미경을 이용하여 낮은 농도의 미생물을 실시간으로 검출하고 추적하는 방법을. 이 기술은 병원체 진단과 생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 고 든과 베티 무어 재단 보조금 4037 4038 자금이 작품에 대 한 캘리포니아 기술 연구소를 인정 합니다.

1. 성장과 열거형의 박테리아 참고: 이것은 적절 한 매체 36에서 자란 거의 모든 세균성 긴장에 적용 됩니다. 우리의 예제에서 우리는 세 사용: Serratia marcescens 일반적인, 쉽게 식별 연구소 스트레인;로 그리고 작은, 높게 운동 환경 부담, Shewanella oneidensis 미스터-1. 비교의 비 운동 세포, 비 운동 Shewanella 돌연변이, Δ 대 운동 FlgM, 또한 사용 된다 비교 37. 모든 변종 lysogeny 국물 (파운드)에서 재배 됩니다.
<li>준비 <ol>살 균 파운드 매체 (증류수의 리터 당: 10 g bacto tryptone, 10 g NaCl bacto 효 모 5 g, 필터 또는 오토 클레이 브). 표준 100mm 직경 파운드-한 천 격판덮개 (동일한 매체 플러스 리터 당 15 g 한 천 제조 법, 오토 클레이 브 (121 ° C, 20 분) 소독을 때 충분히 처리할 멋진 부)를 준비 합니다. 냉장고에 매체 및 접시를 저장.</li>
	<li>실험 전날 씨앗의 5-6 mL &#34; 마스터 &#34; 살 균 그리고 biosafety 기법을 사용 하 여 신선한 세균성 식민지에서 문화 매체. 30 ° C에 (120 rpm) 통에 품 어 ~ 12 헤 보육 시간 긴장과 성장 속도에 의존 될 것입니다. 우리의 실험에 Shewanella 긴장은 인 큐베이 팅 12 시간; 그러나, Serratia 문화 중간 로그 성장을 전시 되도록 8 시간 후 수확 이다.</li>
	<li>실험의 하루가지고 박테리아의 spectrophotometric 읽기 (OD 600) 마스터 문화, 0.6 0.7의 범위에 있을 것으로 예상 된다. 그것은 (로 이전 결정) 대 수 성장 단계에 있어야 한다. 경우 중간의 5 mL으로, 하위 100 µ L 중간 로그 단계 세포의 성장을 허용.</li>
	<li>걸릴 샘플 마스터의 문화 및 챔버 Petroff 하우서 계산를 사용 하 여 직접 셀. 이 라이브 및 죽은 세포를 열거 합니다.
	<ol><li>Micropipette와 챔버로 전송 undiluted 문화 10 µ L 샘플을 추출.</li>
		<li>40 X (63 X 나 0.7-0.8) 높은 건조 객관적인 현미경 이미지 단계 대조를 사용 하 여.</li>
		<li>계산 20 사각형에 평균 박테리아. 
		참고: 사각형만 그 건너 상단 왼쪽된 경계 (또는 아래쪽 그리고 당신이 선호 하는 경우에 오른쪽) 내에서 전적으로 박테리아만을 계산 합니다. 사각형은 여러 줄으로 구분 됩니다, 하나를 경계로 선택.</li>
		<li>20의 평균으로 계산 농도 희석 요인 x 사각형. 직접 수 농도 위해 잘 작동 하지 않습니다 참고 &#60; 10 7 / mL.</li>
	</ol></li> <li>식민지 형성의 계산에 대 한 문화의 직렬 희석 하 게 단위 (CFU). 이 라이브 셀만을 열거 합니다.
	<ol><li>만들어 살 균 0.9% 식 염 수와 함께 선택한 세균 샘플의 각각의 직렬 희석 솔루션. 20 µ L 세균성 솔루션의 전송 및 180 µ L 식 염 수로 희석. 가장 낮은 농도 10 ~ 3 셀/mL 때까지 반복.</li>
		<li>희석 제안 하는 적어도 2 걸릴 100 µ L 10은 3과 10 4 /mL &#8212; 및 적절 한 고체 미디어 접시에 접시. 살 균 분산기로 퍼졌다. 각 희석의 3 복제 수행.</li>
		<li>하룻밤 또는 식민지 성장 때까지 당신의 박테리아에 대 한 적절 한 온도에서 품 어.</li>
		<li>식민지 고 콜로 니 형성 단위 (CFU) (# x 희석 요소 식민지)에 따라 계산 / 볼륨 도금 CFU/mL =. CFU는 복제 평균.</li>
	</ol></li></ol> 2. DHM 높은 희석 샘플의 준비 DHM와 게시물 DHM의 계산에 대 한 마스터의 <ol><li>확인 직렬 희석 문화 파운드 미디어 판에 콜로 니 형성 단위 (참조 1.4.1-1.4.4). 이 이중 맹 검을 수행 하므로 사람이 녹음을 하 고는 각 측정 샘플에서 농도의 인식 하지 못합니다.
	<ol>셀의 농도 실험 기간 동안 분명 변경 되지 않습니다 있도록 <li>적절히 운동 장려 되지만 세포 분열을 억제 하는 최소한의 매체의 10-15 mL에 박테리아를 희석. 이 0.9% 식 염 수 또는 좀 더 구체적인 운동 성 매체 수 있습니다. 예를 들어 대장균에 사용 하 여, 운동 성 매체 EDTA 38를 포함 해야 합니다. 이러한 예제에 대 한 우리는 0.9% 식 염 수를 사용.</li>
	</ol></li></ol> 3. DHM 비디오 <ol><li>관심의 희석의 약 10 mL에 당겨 멸 균 주사기를 사용 하 여,.</li>
	<li>살 균이 음 쇠를 사용 하 여 및 튜브 DHM 샘플 챔버에 주사기를 연결. 
	참고: 맞춤 미세 챔버 악기의 광학 경로 통해 샘플의 일관 된 흐름을 허용 하기 위하여 건설 되었다. 자세한 내용은 결과 섹션을 참조. 실험 전에 압력가 마로 소독에 의해 시료 챔버의 모든 구성 요소를 소독.</li>
	<li>흐름 지속적으로 주사기 펌프를 사용 하 여 샘플 챔버를 통해 주사기에서 샘플. 
	참고: 적절 한 유량 유체 채널 크기, 원하는 처리량 뿐만 아니라 데이터 수집 제한에 따라 다릅니다.</li>
	<li>샘플 샘플 챔버를 통해 흘러 서 적절 한 프레임 속도로 연속적으로 홀로그램을 획득 합니다. 시간 스탬프 파일 데이터 분석 (프로토콜 섹션 4) 동안 나중에 사용할 수 있는 로그 각 이미지의 시간 캡처 생성 됩니다. 상 온 (23 ° C)에서 모든 홀로그램을 얻을. 카메라 제조업체에서 제공 하는 미리 작성 된 c + + 실행 파일을 실행 하 여 홀로그램 기록. 
	참고: 적절 한 프레임 속도 선택 흐름 속도 따라 다릅니다. 이 실험에 대 한 것이 좋습니다 그런 박테리아의 이미지를 만든 것 이다 프레임 속도 사용 하 여 &#62; 악기에 걸쳐 여행으로 2 회 &#39; s 시야.</li>
	<li>는 DHM 통해 이동 하는 샘플의 전체 10 mL에 대 한 충분 한 시간.</li>
	<li>박테리아 성장 하지 또는 접종 실험을 하는 동안 죽어 농축 보낸된 미디어 게시물 DHM 이미지 캡처의 100 µ L 미디어 접시. 살 균 분산기와 확산 하 고 24 시간;에 대 한 적절 한 온도에서 품 어 현재 식민지 계산.</li>
</ol> 4. 셀 밀도 및 검출 한계의 계산 <ol><li>박테리아의 존재에 대 한 데이터를 분석 하는 인수 홀로그램 동영상.
	<ol><li>홀로그램의 시계열에 대 한 중간 픽셀 값 계산 다음 홀로그램에 고정 제거할 각 각 픽셀에서이 중간 값을 뺍니다. 이 ImageJ에서 다음 단계를 수행 하 여 수행할 수 있습니다: <ol><li>32-비트 (이미지-형식-32 비트) 변환</li> <li>계산 (이미지-스택-Zproject-중간) 중간</li> <li>스택 (의 나머지 부분에서 평균을 뺍니다 Process-ImageCalculator-Subtract)</li></ol></li> <li>보이는 공기 반지 및 초점에서 셀의 개수 수동으로. ImageJ에 이렇게 포인트 도구로 개체를 가르키고.</li>
		<li>홀로그램의 각 시리즈 (홀로그램 수집의 시간에서 기록 된) 시간 스탬프 파일을 동반 될 것 이다. 사용 시간 스탬프 파일을 계산 하는 샘플의 총 양을 펌핑 당시 이미지 체포 됐다.</li>
	</ol></li> <li>샘플 이미지의 전체 볼륨에 의해 감지 하는 세포의 총 수를 나누어 세포 밀도 계산. 정확한 통계에 대 한 5-10 프레임 평균.</li>
</ol> 5. 진폭 및 위상 재건 이미지 프레임 당 10-200 셀 <ol><li>선택 대표 동영상. 재구성 소프트웨어에 원시 (중간 감 하지) 홀로그램을 로드 (예: ImageJ 숫자 전파 39; [GitHub] 샴푸).
	<ol><li>ImageJ를 사용 하 여, OD 숫자 전파 숫자 회절 이동.</li>
		<li>프롬프트에서 푸리에 마스크 실제 또는 가상 이미지를 선택 하 고 모든 정현파 잡음 기능 제거를 그립니다.</li>
		<li>재건 거리를 입력 하 여 진폭과 위상 적절 한 z-단계에서 재구성.</li>
	</ol></li> <li>Median 진폭 데이터 4.1.1에서 소음을 줄이기 위해 빼기.</li>
	<li>3D 플롯 데이터 큐브 또는 프로젝션. 플러그인에가 서 &#8212; 볼륨 뷰어.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

홀로그램의 수치 재건: 홀로그램의 숫자 재건, 각도 스펙트럼 방법 (ASM) 사용 됩니다. 이 DHM의 그린의 기능으로 홀로그램의 회선을 포함 한다. 특정 초점면에서 이미지의 복잡 한 wavefront 푸리에 회선 정리를 다음과 같이 채용 하 여 계산할 수 있다:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq2.jpg">(1)
어디 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq3.jpg"> 는 푸리에 변환 연산자 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq4.jpg"> 홀로그램 매트릭스와 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq5.jpg"> 은 그린의 기능으로 ...

매우 희석 샘플에 정확한 세균의 결정은 많은 응용 프로그램에서 중요 한: 몇 가지 예는 물과 식품 품질 분석1,,23; 혈액, 중추 신 경계, 또는 래4,5;에 병원 균의 검출 메 마른 물6;를 포함 하 여 제약 제품의 생산 그리고 오픈 바다와 퇴적 물7,,89같은 oligotrophic 환경에서 환경 지역 사회 분석. 또한 목성과 토성, 특히 유로 파10,11 , Enceladus12,13, 의 얼음 위성에 가능한 현존 미생물 생명의 검출에 대 한 관심 증가 14, 표면 액체 바다를 알려져 있습니다. 1978 년에서 바이킹 이후 아무 미션이 다른 행성에 현존 생활을 찾을 하려고, 때문에 기술 및 세균성 식별 및 공간 임무15동안 계산을 위한 계기의 한정 된 개발이 되었습니다.
판 수의 전통적인 방법의 찾을 culturable 셀만, 때로는 환경 긴장에 종의 소수를 표현할 수 있는 &#60; 116. 플레이트 일 또는 외피의 주 변형에 따라 최대 성공을 위해 필요 합니다. Epifluorescence 현미경 검사 법은 신속 하 고 정확한 미생물 열거형에 대 한 황금 표준으로 크게 접시 계산을 대체 했다. 핵 산 라벨 형광 염료 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), SYBR 녹색 또는 acridine 오렌지 같은 핵 산을 바인딩하는 일반적인 염료 사용17,,1819 하지만 많은 연구를 사용 하 여 그램의 형광 표시기 서명20,,2122,,2324. ML 당 10 ~5 셀의 검출 (Lod)의 한계를 이끌어 전 농도 단계 없이 이러한 방법을 사용 하 여. LoD 향상 된 여과 사용 하 여 가능 하다입니다. 액체 샘플 막, 일반적으로 폴 리 카보 네이트를 이상적으로 줄이기 위해 배경 검정에 진공 필터링입니다. 저 배경 염료와 같은 위에서 언급 한 DNA 얼룩 필터25에 직접 적용할 수 있습니다. 눈으로 정확한 계산에 대 한 10 ~5 셀 필터, mL 당 10 ~5 셀 보다 더 희석 샘플에 대 한 즉 당 필요한, 중요 한 샘플 볼륨을 수집 하 고 필터링 해야 합니다. 레이저 검사 장치 필터의 모든 영역을 체계적으로 탐구 하 고 따라서 mL26당 10 ~2 셀 아래로 탐지의 한계를 밀고, 계산에 필요한 셀의 수를 줄이기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 이들은 대부분 실험실에서 사용할 수 있습니다 그리고 정교한 하드웨어 뿐 아니라 소프트웨어 전문가 확인 입자를 관찰 하는 허용 하 고 박테리아와 파편 하지.
참고로, 패 혈 증으로 성인 보통 시작에서 증상을 보여주는 &#60; 셀/100ml의 혈액, 및에서 유아 &#60; 10 셀/mL. 성인에서 혈액 무승부 소요 10 mL, 유아, 1 mL에서. PCR 기반 방법 인간과 비 병원 성 식물 DNA의 존재에 의해 및 혈액27,28구성 요소 PCR 억제 저해 됩니다. 다양 한 새로운 기술에도 불구 하 고 문화 전원 지역 또는 개발 도상 국가에서 특히 혈 류 감염의 진단에 대 한 황금 표준 남아 있습니다. 다른 행성에 생활의 탐지, 열역학 계산 생활을 따라서 예상된 가능한 바이오 매스 에너지 예산을 추정할 수 있다. 1-100 셀/mL 유로 파29에 열역학으로 합리적인 것으로 예상 된다. 그것은 쉽게 이러한 숫자에서 볼는 수성 해결책의 다량에 있는 세포의 아주 작은 숫자의 발견은 중요 한 미해결된 문제를 수 있습니다.
이 논문에서는, 10의 농도에서 Serratia marcescens 및 Shewanella oneidensis (야생 형 및 비 운동 돌연변이)의 탐지 설명5, 104, 103및 꺼짐-축을 사용 하 여 100 셀/mL 디지털 홀로그램 현미경 (DHM) DHM의 주요 장점은 전통적인 가벼운 현미경 검사 법은 높은 해상도에서 두꺼운 샘플 볼륨의 동시 영상-이 구현에서 샘플 챔버는 0.8 m m 두께. 이러한 샘플 챔버는 소프트-리소 그래피입니다 (PDMS) 정밀 가공 알루미늄 몰드에서의 허용 오차는 ± 50 µ m에 의해 건설 되었다. 이 고 전력 가벼운 현미경 검사 법을 통해 필드의 깊이에 약 100 개선을 나타냅니다. 또한 DHM 광학 경로 길이 (굴절률과 두께의 제품)의 측정에 대 한 허용 하 양적 위상 정보를 제공 합니다. DHM와 유사한 기술을 사용 되었습니다 모니터링 박테리아와 효 모 세포 주기 및 세균 건조 질량30,,3132;의 계산 산란 차이점도 세균성 긴장33을 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다.
우리가 사용 하는 악기 이전 게시34,35, 미생물와 함께 사용 사용자 이며 그것의 디자인 및 건축 시연 및 설명. 수성 솔루션 통해 주사기 펌프; 0.25 µ L 볼륨 샘플 챔버에 지속적으로 공급 된다 흐름 율은 전체 샘플 볼륨의 이미지를 보장 하기 위해 카메라 프레임 속도 의해 결정 됩니다. 통계 계산 주어진된 농도에서 세포의 상당수를 탐지 하기 위해 몇 군데 해야 합니다 샘플 볼륨의 수를 예측 합니다.
셀-감지 응용 프로그램 진폭 및 위상 이미지에 홀로그램의 재건은 필요; 분석은 원시 홀로그램에서 수행 되었다. 이 저장 계산 리소스 및 디스크 공간: 500mb 홀로그램 비디오 1-2 결핵 때 재건 될 것입니다. 그러나, 우리는 홀로그램 원하는 종 나타내는 확인 하는 샘플의 깊이 통해 재건 논의 할. DHM의 중요 한 기능 강도 및 이미지의 단계를 모니터링 하는 기능입니다. 강도 (예: 대부분의 생물 세포)에 거의 투명 한 유기 단계에서 명확 하 게 표시 됩니다. 그것은 레이블 없는 기술, 아니 염료 사용 됩니다. 이 한가능한 우주 비행 용, 염료는 임무의 조건을 살아날 수 있습니다 이후 dvantage 및-더 중요 한 것은-외계 생물, 인코딩에 대 한 DNA 또는 RNA를 사용 하지 않을 수 있습니다 작업으로 간주 될 수 없습니다. 북극과 남극, 염료 원격 위치를 데 려 어려울 수 있습니다 및 저장 시 저하 될 수 있습니다 같은 극한 환경에서 작업에 대 한 장점 이기도 합니다. 위상 및 진폭으로 이미지의 개조는 우리가 만든 사용할 수 GitHub (샴푸)에 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 또는 ImageJ를 사용 하 여 수행 됩니다.

<table><tbody><tr><td>Bacto Yeast</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7710</td><td>다양한 구매 옵션</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>10cm 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>10053-704</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 배양 튜브</td><td>Falcon ( Corning Life Sciences)352002</td><td></td> <td>Loose-capped</td></tr><tr><td>Petroff-Hauser chamber</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>3920</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringes</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>Luer-Lok tip not necessary</td></tr><tr><td>Male Luer to 1/16" barbed fitting</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K291</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 가능 1/16" 흐름용 ID PVC 튜빙</td><td>Nalgene</td><td>8000-0004</td><td>길이별로 판매, 그에 따라 구매</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>Sample Chamber</td><td>Custom</td><td>n/a</td><td>See Materials Section</td></tr><tr><td>Holographic Microscope</td><td>Custom</td><td>n/a</td><td>See Wallace et al.</td></tr><tr><td>오픈 소스 소프트웨어</td><td>Custom</td><td>https://github.com/bmorris3/shampoo</td><td></td></tr></tbody></table>

디지털 홀로그램 현미경 (dhm)를 사용 하 여 낮은 농도에서 미생물 측정

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

정확 하 게 감지 하 고 스파스 세균 샘플 세 의료 진단, 및 로봇 식 임무를 다른 행 성과 태양계의 위성에 의해 생활 탐지에 대 한 음식, 음료, 제약 공업, 많은 응용 프로그램 있다. 현재, 스파스 세균 샘플은 문화 도금 또는 epifluorescence 현미경 검사 법에 의해 계산 됩니다. 문화 접시 필요 오래 부 화 시간 (주 일) 하며 epifluorescence 현미경 광범위 한 얼룩 및 샘플의 농도. 여기, 꺼짐-축 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 매우 희석 문화 (100-104 셀/mL)에 박테리아를 열거 하는 방법을 보여 줍니다. 첫째, 사용자 지정 DHM의 건설 건물 저가 악기에 자세한 지침과 함께 설명 되어 있습니다. 홀로 그래피의 원리를 설명 하 고 통계 모델 동영상 해야 얼마나 오래 추정 하는 데 사용은 악기의 광학 성능 특성 및 세균 솔루션 (표 2)의 농도에 따라 셀을 검출 하 . 10 셀의 비디오 검색5, 104, 103및 100 셀/mL 유엔 재건된 홀로그램을 사용 하 여 실시간으로에서 설명 된다. 진폭 및 위상 이미지의 개조는 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 보여 줍니다.

결과 DHM로 매우 낮은 수준에서 생활 하 고 죽은 박테리아를 감지 하는 능력을 표시 해야 합니다. 계산 하는 박테리아의 수는 Petroff 하우저 세 실과 접시 수를 사용 하 여 얻은 결과와 일관 되어야 합니다. 표준 통계 방법을 다양 한 세균성 농도에서 다른 검출 방법의 정확성에 대 한 정보를 제공합니다.
그림 1 에서는 세포의 직접 열거형에 사용 되는 세 실의 미세 뿐만 아니라 사용 Petroff 하우서 세 챔버. 그림 2A 보여줍니다 충분 한 허용 된 전형적인 풍부한 문화 접시 S. marcescens 식민지 (상 온에서 16 시간) 성장에 대 한 시간. 그림 2B 사용 하는 모든 ...

디지털 홀로그램 현미경 (DHM) 이미징 샘플 50-100 X 초점 비교 해상도, 명시 야 현미경 보다 두꺼운 수행 후 처리를 허용 하는 체적 기술입니다. 여기 DHM 사용 됩니다 식별, 계산, 그리고 미생물에서 매우 낮은 밀도 추적과 광학 밀도 측정, 판 수, 및 직접 카운트와 비교.

디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 낮은 농도에서 미생물 측정

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

이 실험의 전반적인 목표는 디지털 홀로그램 현미경을 사용하여 매우 낮은 수준에서 미생물을 검출하는 것을 입증하는 것입니다. 이 기술은 기존의 광학 현미경보다 더 민감하며 박테리아 거동에 대한 실시간 정보를 제공합니다. 이 방법은 물에서 병원성 유기체를 찾거나 얼음 위성에서 태양계 내의 생명을 찾는 것과 같은 생물학 및 우주론 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 DHM이 체적 기법이라는 것인데, 이는 물리적으로 다시 초점을 맞출 필요 없이 샘플에서 3차원 정보를 즉시 캡처할 수 있다는 것을 의미합니다. 이 기술의 의미는 낮은 박테리아 농도를 감지하는 능력 때문에 혈류 또는 뇌척수액 감염의 진단으로 확장됩니다. 이 절차를 시작하려면 실험 당일에 0.6에서 0.7 범위로 예상되는 박테리아 마스터 배양물의 분광 광도계 판독을 수행합니다.그런 다음 마스터 배양 샘플을 채취하고 Petroff-Hausser 계수 챔버를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 모두 계수합니다. 마이크로피펫을 사용하여 희석되지 않은 배양액의 10마이크로리터 샘플을 챔버로 옮깁니다. 위상차를 사용하여 고건조 대물 현미경으로 이미지화합니다.그런 다음 박테리아를 최소 20개의 제곱으로 세고 평균을 냅니다. 농도를 20제곱의 평균에 희석 계수를 곱한 값으로 계산합니다. 살아있는 세포만 열거하려면 20마이크로리터의 박테리아 용액을 다른 웰로 옮기고 180마이크로리터의 식염수로 희석하여 선택한 각 박테리아 샘플을 멸균 0.9% 식염수로 연속 희석합니다.가장 낮은 농도가 밀리리터당 3개의 셀에 대해 약 10이 될 때까지 절차를 반복합니다. 다음으로, 최소 2개의 희석액에서 100마이크로리터의 샘플을 취하여 적절한 고체 매체 플레이트에 플레이트합니다. 멸균 스프레더로 펴고 각 희석액을 최소 3회 반복합니다.그 후, 하룻밤 동안 또는 군체가 자랄 때까지 적절한 온도에서 배양하십시오. 그런 다음 식민지를 세십시오. 군체 형성 단위를 계산하고 반복실험에 대해 평균을 구합니다.이 절차에서는 DHM을 위한 마스터 배양을 연속적으로 희석하고 용융성 배지 플레이트에서 CFU의 DHM 후 계수를 수행합니다. 박테리아를 운동성을 촉진하지만 세포 분열을 억제하는 최소 배지 25ml로 희석하여 실험 중에 세포 농도가 눈에 띄게 변하지 않도록 합니다. 멸균 주사기를 사용하여 DHM 비디오를 녹화하려면 약 10ml의 관심 희석액을 끌어들입니다.그런 다음 멸균 피팅과 튜브를 사용하여 주사기를 DHM 시료 챔버에 연결합니다. 주사기 펌프를 사용하여 주사기에서 시료 챔버를 통해 시료를 지속적으로 흐르게 합니다. 샘플이 샘플 챔버를 통해 흐를 때 적절한 프레임 속도로 홀로그램을 연속적으로 획득합니다.전체 10ml의 샘플이 DHM을 통해 흐를 수 있도록 충분한 시간을 허용합니다. 실험 중에 박테리아가 성장하거나 죽지 않도록 하려면 멸균 스프레더로 펴서 사용한 DHM 이미지 캡처 후 100마이크로리터의 농축 배지 플레이트를 접종합니다. 그런 다음 군체를 세기 전에 24시간 동안 적절한 온도에서 배양하십시오.정확한 세포 수를 갖는 것은 검출 한계를 정량적으로 결정하는 데 필수적입니다. 보정된 마이크로피펫을 사용하여 모든 희석을 세심하게 수행하고 Petroff-Hausser 챔버에서 광학 밀도, 도금 및 직접 계수로 모든 계수를 확인하는 것이 중요합니다. 획득한 홀로그램 비디오에서 박테리아 존재에 대한 데이터를 분석하려면 먼저 이미지를 32비트 형식으로 변환하여 매체 빼기 필터링을 수행합니다.그런 다음 중앙값 픽셀 값을 계산합니다. 마지막으로, 각 픽셀에서 이 중앙값을 빼서 홀로그램에서 고정된 아티팩트를 제거합니다. 그런 다음 가시 영역 링과 초점이 맞는 셀의 수를 수동으로 계산합니다.각 홀로그램 시리즈에는 타임스탬프 파일이 함께 제공됩니다. 타임스탬프 파일을 사용하여 이미지가 캡처된 시점에 펌핑된 샘플의 총량을 계산합니다. 그런 다음, 검출된 총 세포 수를 이미징된 샘플의 총 부피로 나누어 세포 밀도를 계산합니다.정확한 통계를 위해 평균 5-10프레임. 이 플롯은 365마이크로미터 x 365마이크로미터 x 1밀리미터의 샘플 부피를 기반으로 시야당 예측된 셀을 보여줍니다. 시야당 세포 수가 1 미만으로 떨어지는 농도의 경우 검출을 위해 여러 이미지가 필요합니다.이것은 플레이트 수로 측정된 밀리리터당 2, 100개의 세포에서 Serratia marcescens 배양의 DHM 홀로그램 염기서열입니다. 이 시퀀스는 대략 1-2초마다 하나의 셀을 보여주며, 이는 예측에 매우 적합합니다. 그리고 이것은 플레이트 수로 측정된 밀리리터당 620개의 세포에서 Serratia marcescens 배양의 또 다른 DHM 홀로그램 염기서열입니다.이 시퀀스는 대략 6-7초마다 하나의 셀을 보여줍니다. 디지털 홀로그램 현미경을 사용하여 세포를 이미지화할 때는 모든 용액을 준비할 때 필터 멸균 기술을 사용하는 것을 잊지 마십시오. 이렇게 하면 기기에 미립자 물질이 유입되는 것을 방지할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 건강한 세포 배양을 준비하고 여분의 성장 배지, 플레이트 및 운동성 배지를 준비해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 살아 있는 세포와 죽은 세포의 비율과 같은 추가 질문에 답하기 위해 형광 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 미생물학 분야의 연구자들이 배양된 세포와 환경 샘플에서 3차원 운동성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 홀로그램 현미경을 사용하여 박테리아를 계수하고 다른 계수 기술을 사용하여 결과를 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 박테리아 배양물을 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 살아있는 유기체를 성장시키고 취급할 때는 항상 적절한 생물 안전 예방 조치를 취해야 합니다.

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연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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