준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

이 방법론의 전반적인 목표는 세포 외 플럭스 분석기를 사용하여 대사 평가를 위해 췌장암 세포와 섬유아세포에서 3차원 종양 스트럼 스페로이드를 공동 배양하는 것입니다. 이 방법은 세포 대사 및 약물 감수성에 대한 종양 마이코의 영향에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 빠르고 상대적으로 쉬우며 재현성이 높으며 다른 세포 정렬 사례에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다.

절차를 시연하는 사람은 Pawan Noel과 Ruben Munoz입니다. 표준 무균 조직 배양 기술을 사용하여 적절한 성장 배지에서 T75 플라스크의 관심 암세포와 섬유아세포를 배양합니다. 세포가 70%에서 80%의 포화도에 도달하면 5밀리리터의 PBS로 배양물을 한 번 세척하고 플라스크 표면에서 세포를 분리하고 플라스크당 0.05%트립신 EDTA 2밀리리터로 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 분리합니다.

현미경으로 분리를 확인한 후 플라스크당 8ml의 성장 배지로 트립신을 비활성화하고 세포를 몇 번 피펫팅하여 계수를 위한 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 신선한 성장 배지에서 1 x 10에서 밀리리터 농도당 6번째 세포로 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 세포를 자화시키기 위해 성장 배지에 10 마이크로 리터의 나노 셔틀을 첨가하고 100 마이크로 리터의 세포를 넣고 용액을 부드럽게 교반합니다.

튜브를 몇 번 부드럽게 뒤집고 세포 나노셔틀 혼합물을 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 나노셔틀이 세포 표면에 쉽게 결합할 수 있도록 실온에서 부드럽게 흔들어 2시간 동안 세포를 배양합니다. 결합 배양이 끝나면 각 자화 세포 현탁액을 피펫팅과 부드럽게 혼합하고 150마이크로리터 배지당 네 번째 자화 암세포 또는 섬유아세포에 대한 농도를 1.5 x 10으로 조정합니다.

섬유아세포와 암세포를 2:1 비율로 혼합하여 웰당 총 150마이크로리터의 파종 세포를 만듭니다. 더 얇은 자석을 사용하여 96웰 자기 스페로이드 드라이브 위에 세포 방수제 96웰 플레이트를 놓고 각 웰에 150마이크로리터의 세포 혼합물을 시딩합니다. 모든 세포가 플레이트링되면 자기 스페로이드 드라이브가 부착된 상태에서 섭씨 37도, 5%CO2에서 밤새 플레이트를 배양합니다.

다음 날 아침, 마그네틱 드라이브를 제거하고 최대 7일 동안 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 대사 분석 전날, 제공된 유틸리티 플레이트의 웰당 200마이크로리터의 분석 구경으로 프로브 카트리지를 수화하고 가습된 섭씨 37도의 비CO2 인큐베이터에서 유틸리티 플레이트를 밤새 배양합니다. 다음 날 아침, 광학 현미경으로 성장판의 스페로이드를 관찰하여 형태와 전반적인 균일성을 확인합니다.

성장판을 마그네틱 홀딩 드라이브로 옮기고 웰당 약 120마이크로리터의 성장 배지를 조심스럽게 흡입합니다. 120마이크로리터의 따뜻한 분석 매체로 스페로이드를 부드럽게 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 현미경으로 스페로이드를 다시 검사하여 스페로이드가 씻겨 나가지 않았는지 확인하고 각 웰에 180마이크로리터의 가열된 분석 배지를 추가합니다.

넓은 보어 팁을 사용하여 세포 기피제 성장 플레이트에서 사전 세척된 단일 스페로이드를 조심스럽게 흡인하고 스페로이드를 스페로이드 분석 플레이트의 한 웰 중앙으로 직접 부드럽게 옮겨 스페로이드가 중력에 의해 웰의 중앙 마이크로 챔버로 떨어지도록 합니다. 모든 스페로이드가 옮겨졌을 때 분석 플레이트를 CO2가 아닌 섭씨 37도의 가습 공기 인큐베이터에 1시간 동안 놓습니다. 배양하는 동안 A부터 H행까지 열이 왼쪽에 오도록 센서 카트리지의 방향을 지정하고 카트리지 상단에 로딩 가이드를 배치하여 로드할 포트에 해당하는 문자가 왼쪽 상단 모서리에 오도록 합니다.

플레이트가 균일하게 로드된 경우 해석 소프트웨어를 열고 템플릿을 클릭합니다. 빈 템플릿을 두 번 클릭하고 그룹 생성을 클릭합니다. Plate Map 탭에서 실험 설계에 해당하는 분석 플레이트에 그룹을 할당하고 4개의 모서리 웰을 배경 웰로 선택합니다.

Instrument Protocol 탭에서 Calibrate, Equilibrate 및 Baseline 측정 주기를 확인합니다. 주입을 클릭하고 각 포트에 대한 화합물을 정의합니다. 측정 주기를 6으로 변경하고 프로토콜 및 그룹 요약을 검토한 다음 분석 설계 템플릿을 저장합니다.

분석 설계를 가이드로 기반으로 멀티채널 피펫을 사용하여 각 시약을 주입 포트에 직접 분주하고 손가락 끝으로 로딩 가이드를 제자리에 고정합니다. 모든 시약이 로드되면 로딩 가이드를 제거하고 카트리지를 눈높이에 대고 주입 포트가 균일하게 로드되었는지 육안으로 검사합니다. 유틸리티 플레이트의 카트리지를 세포외 플럭스 분석기로 옮기고 사전 분석 보정을 시작합니다.

보정이 완료되면 유틸리티 플레이트를 3D 스페로이드가 포함된 예열된 분석 플레이트로 교체하고 분석을 시작합니다. 분석이 완료되면 데이터를 적절한 데이터 분석 소프트웨어로 내보냅니다. 일반적인 실험에서 스페로이드의 직경은 인쇄 후 2일차에 약 400마이크로미터에서 7일차에 거의 600마이크로미터로 증가하며 7일차 이후에는 큰 증가가 관찰되지 않습니다.

세 가지 유형의 스페로이드 배양물 모두 세포 외 응집률의 증가에 의해 입증된 바와 같이 포화 농도의 포도당 주입에 대한 반응으로 해당과정 스트레스 분석에 대한 생물학적으로 기능적인 반응을 나타냅니다. 일반적으로 상대적으로 작은 PS1 섬유아세포 유래 스페로이드의 신호에 비해 종양 세포 유래 스페로이드의 세포외 주장률 신호가 더 높은 것은 암세포의 해당과정에 대한 선천적인 대사 성향에 기인할 수 있습니다. 종양 섬유아세포 스페로이드에 대한 이 대표적인 미토콘드리아 스트레스 테스트에서, ATP 합성효소 억제제에 대한 반응으로 미토콘드리아 호흡의 감소가 관찰되었으며, 이는 세포 ATP 생산에 사용되는 미토콘드리아 호흡의 분율과 상관관계가 있습니다.

분리제를 두 번째로 주입하면 미토콘드리아 호흡이 증가하면서 스페로이드의 최대 산소 소비가 자극되었습니다. 전자 수송 사슬 복합체 1 및 3 억제제의 세 번째 주입은 산소 소비율의 급격한 감소로 관찰 된 미토콘드리아 호흡을 차단했습니다. 이러한 매개변수와 기초 호흡수는 스페로이드의 양성자 누출 및 예비 호흡 용량을 계산하는 데 사용할 수 있으며, 자화된 스페로이드의 다중 파라메트릭 대사 분석을 제공합니다.

일단 숙달되면이 기술은 잘 계획된다면 3-4 시간 안에 완료 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 대사 분석을 수행하기 4-16시간 전에 37도 인큐베이터에서 프로브에 수분을 공급하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 스페로이드 배양 절차에 따라 용량 반응 실험과 같은 다른 분석을 수행하여 약물 효능, 독성, 침투제 및 감수성에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 췌장암 분야의 연구자들이 생체 내 종양 생물학 및 그 특성을 모방한 3차원 모델에서 종양 미세환경 내의 종양 기질 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 배양된 췌장 종양 및 섬유아세포 세포부터 세포 대사 기능의 다운스트림 분석에 이르기까지 3차원 스페로이드를 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.