Name: 준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 학습하세요 췌장암 세포와 섬유아세포의 3D 회전타원체 공동배양법을 통해 세포대사를 평가하는 방법을. 이 기법은 종양 미세환경에서 대사 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 문화 조건 최적화 및 회전 타원 체 성장 모니터링에 사무엘 Zirbel에 게 감사 하 고 싶습니다. 우리는 해 마 XFe96 분석기, 분석 시 약 및 기술 통찰력을 제공 하기 위한 Agilent 기술에 감사입니다. 우리 또한 감사 박사 Hemant Kocher 바트 암 연구소 영국에서 제공 하는 PS1 셀. 이 작품 지원 부분에서 Seena Magowitz 재단에 의해 췌 장 암 연구와 서 최대 암-암 연구 영국 루스 재단 췌 장 암 드림 팀 연구 부여 (부여 번호: SU2C-AACR-DT-20-16). 암 최대 스탠드 엔터테인먼트 산업 재단의 프로그램입니다. 연구 보조금은 암 연구, SU2C의 과학적인 파트너를 위한 미국 협회에 의해 관리 됩니다.

1. 췌장암의 문화 3D Spheroids 자석 Bioprinting를 사용 하 여 <ol><li>사용 표준 무 균 조직 배양 기술, 적절 한 성장 매체에 70-80%의 confluency T75 플라스 크에 대 한 관심의 문화 셀. 
	참고: 일반적으로 5-7 × 10 6 세포는 70-80% confluent T75 플라스 크에서 했다 수확. 두 개의 서로 다른 세포 유형이이 연구-Patu8902에서에서 사용 되었다 (췌 장 종양 세포)와 PS1 셀 (활성화 된 췌 장 방사상 세포 21). 두 셀 라인 로스웰 파크 기념 연구소 미디어 1640 (RPMI-1640) 10% (v/v) 태아 소 serum(FBS), 1 × 페니실린-스 (p/s)와 보완에 교양 있었다.</li>
	<li>한 번 Dulbecco의 5 mL로 세포 세척 &#39; s 인산 염 버퍼 saline(DPBS).</li>
	<li>플라스틱에서 분리 세포 표면 0.05%의 2 mL와 trypsinizing에 의해 트립 신-EDTA 37에서 5-10 분에 대 한 현미경으로 세포 분리에 대 한 ° C. 확인.</li>
	<li>비활성화 trypsin 8 mL 성장 매체의 추가 의해 세포를 분리. 이 부정적인 건강/세포의 생존에 영향을 미칠 수 있습니다 trypsinization, 피하기.</li>
	<li>피펫으로 세포 아래로 단일 셀 펜션과 카운트를 생성 하는 자동화 된 셀 카운터 또는 hemocytometer를 사용 하 여 밀도 셀.</li>
	<li>한편, 주위 온도에 NS의 유리병 equilibrate.</li>
	<li>원하는 수 spheroids (우물)와 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 약 수를 뿌리기에 필요한 셀의 양을 계산 합니다. 예를 들어 전체 96 잘 접시 5000 셀/음, 약 수 적어도 5.5 × 10 5 셀 씨.</li>
	<li>수집 셀 신중 하 게 3 분에 대 한 500 x g에서 centrifuging 발음 또는 가만히 따르다는 상쾌한 고 성장 매체에서 10 6 셀/mL x 1.0의 농도에서 세포를 resuspend. 부드럽게 넓은 지 루 피펫으로 팁을 사용 하 여 기울이기 피하기 위해 플라스틱. 예를 들어 성장 매체의 550 µ l resuspend 5.5 x 10 5 셀.</li>
	<li>Equilibrated NS (1.6 단계)를 사용 하 여 셀의 원하는 금액을 끌다.
	<ol>직접 <li>성장 매체에 세포 현 탁 액에 NS를 추가 하 고 부드럽게 선동. 라벨에 대 한 효율적인 자기 세포의, (1 x 10 6 셀/mL에서 resuspended) 100 µ L 셀 당 10 µ L NS 사용. 
		참고: 일반 실험에 대 한 레이블 5.5 × 10 5 Patu8902 세포 550 µ L 55 µ L NS와 1.1 × 10에에서 6 PS1 셀 1100 µ L, (별도) 110 µ L NS와.</li>
		<li>부드럽게 반전 튜브 몇 번 세포 현 탁 액을 위해. 일시적으로, 24-잘 접시의 단일 잘으로 셀-NS 믹스를 전송 합니다. 각 셀 형식을 자성에 대해 별도로 이렇게 합니다. 커버 플레이트 및 셀 표면에 NS 바인딩 수 있도록 부드러운 떨고와 2 시간에 대 한 실 온에서 세포를 품 어. 
		참고: 문화 및 공동 문화 spheroids 둘 다 시작 뿐만 아니라 Patu8902 또는 PS1 혼자 셀에서 시작 하는 spheroids의 분석 결과 셀 인쇄 마그네틱 드라이브에 성공적으로 독립에이 메서드를 사용 하 여 달성 하기 전에 혼합 유형 실험입니다. Patu8902 및 p s 2 세포에서 공동 문화 spheroids를 생성 하는 방법 후속 단계에 아래 설명.</li>
	</ol></li> <li>피펫으로 자성된 셀 아래로 부드럽게 균일 하 게 혼합 하 고 원하는 셀 번호를 포함 하는 마스터 믹스를 준비 하. Spheroids 시드 (5000 Patu8902 + 10000 PS1) 15, 000 셀의 총을 사용 하 고 96 잘 접시의 당 150 µ L의 총 볼륨 조정. 
	참고: 각 음에 적절 하 게 최종 볼륨 사용 하는 셀의 수에 관계 없이 동일 이어야 합니다.</li>
	<li>96 잘 자기 회전 타원 체 드라이브 꼭대기 셀 구 충 제 96 잘 접시 놓고 각 우물에 셀 혼합의 150 µ L를 분배 합니다. 세포 관찰 천천히 자석 위에 우물의 센터에 수집 합니다. 커버 하 고 37 ° C에 아직도 연결 된 자석 회전 타원 체 드라이브 설정 5% CO 2 인큐베이터에서 하룻밤 접시를 품 어. 마그네틱 드라이브를 제거 하 고 추가 성장 최대 7 일 동안 품 어. 
	참고: 회전 타원 체 인쇄 자석 회전 타원 체 드라이브를 사용 하 여 셀 구 충 제 성장 격판덮개를 사용 하 여 중요 한 이다. 얇은 작은 자석 회전 타원 체 드라이브 사용 되도록 하지 지주 드라이브.</li>
	<li>성장의 spheroids 매일 모니터링합니다. 자기 각도에서 드라이브를 들고와 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 보낸된 미디어 끌어낼 것에 성장 격판덮개를 배치 하 여 3 일 마다 신선한 성장 미디어와 보충. 
	참고: Patu8902와 PS1 셀 공동에 15, 000 셀/잘 시드 5-7 일 이내 400-600 µ m의 직경을 가진 3D spheroids로 성장할 것입니다. Spheroids 신진 대사 특성, 약 평가 및 다른 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비가 시점에서.</li>
</ol> 2. 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 생체 경로 대 한 3D 췌 장 종양 Spheroids의 대사 분석 결과 참고:이 섹션에서는, extracellular 플럭스를 사용 하 여 spheroids의 신진 대사 기능 분석 3D spheroids을 위해 설계 된 분석 결과 microplates로 분석기 설명.
<ol><li>세척 및 이전 spheroids의 성장 격판덮개에서 회전 타원 체 시험의 microplates. 
	참고: Spheroids ~ 500 µ m의 직경을 도달할 때 대사 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다.
	<ol><li>수행 분석 결과, 전날 제공된 유틸리티 접시에 분석 결과 calibrant (200 µ L/잘)와 프로브 또는 센서 카트리지를 수 화와 품 어 37에서 설정 습도 인큐베이터 (비 CO 2)에서 하룻밤 (4 월 18 일 h) ° c.</li>
		<li>준비 적절 한 분석 결과 중간 원하는 대사 분석 결과 대 한 기본 미디어 (재료의 표 참조)을 보완 하 여 중 2 m m L-글루타민 분해 스트레스 테스트 (GST)에 대 한 분석 결과 또는 1 mM pyruvate, 2 m L-글루타민 m와 10mm 대 한 포도 당을 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 (MST) 분석 결과. 
		참고: 세포 외 유출 분석기 미토 콘 드리 아 호흡 (OCR) 및 96 잘 접시 형태로 라이브 셀의 분해 (ECAR)를 측정합니다. 이러한 요금 조사 샘플에 세포 신진 대사 기능에 대 한 개요를 제공합니다. 자세한 내용은 분석 결과 키트 설명서를 참조 하십시오.</li>
		<li>추가 시험의 특정 보충제 (2.1.1 단계 참조), 후 37 ° C 물 욕조에 보충된 분석 결과 매체 따뜻하고 pH 7.4 ± 0.1 0.1N 조정 NaOH. 매체 사용까지 따뜻하게.</li>
		<li>Reconstitute 시험 권장 재고 농도 보정된 분석 결과 중간 시 약 키트. 
		참고:이 만들어집니다 10 ×에서 우물에 원하는 최종 농도. 포도 당, oligomycin 2 의하여 포도 당 (2-DG) 재고 농도 100 mM, 100 µ M, 500 m m, 각각.</li>
		<li>성장 플레이트는 조명 아래에서 관찰 spheroids 현미경; 모양 및 structur 회전 타원 체 형태 및 전반적인 균일성에 대 한 확인spheroids의 e.</li>
		<li>성장 플레이트 마그네틱 지주 드라이브에 전송 하 고 신중 하 게 ~ 120 µ L 성장 매체를 발음. 부드럽게 따뜻하게 하 고 사전 보정 분석 결과 미디어의 ~ 120 µ L 함께 spheroids를 세척 하 고 발음 하 고, 두 번 세척을 반복. Spheroids spheroids는 멀리 세척 되지 보장 하기 위해 다시 현미경 검사.</li>
		<li>각 잘을 180 µ L 따뜻한 분석 결과 미디어를 추가 하 여 회전 타원 체 분석 결과 미 판 준비.</li>
		<li>10 µ L를 P20 micropipette를 설정 하 고 그것을 넓은 지 루 팁에 맞는. 넓은 지 루 팁, 사용할 수 없는 경우 차단 일반 피 펫 팁의 팁 깨끗 한가 위 또는 구멍을 넓혀 메스. 
		참고:이 한다 전단 줄이고 플레이트 분석 결과를 전송 하는 동안에 spheroids의 전반적인 형태를 보존.</li>
		<li>는 따뜻한 (37 ℃) 표면을 사용 하 여 spheroids의 전송 수행. 화이트 라이트 램프로 따뜻하게 x 선 필름 뷰어 표면 대비 향상 하 고 원조 전송 과정에서 spheroids의 시각화를 사용 하 여.</li>
		<li>신중 하 게 aspirate P20 micropipette를 사용 하 여 셀 구 충 제 성장 플레이트에서 단일 미리 씻어 회전 타원 체 넓은 장착 구멍 팁과 부드럽게 전송 회전 타원 체는 대사 수행에 대 한 회전 타원 체 분석 결과 플레이트의 각 우물의 센터에 직접 분석 결과입니다. 부드럽게 분석 결과 접시를 채우기 위해 순수한 중력에 의해 각의 중앙 마이크로 챔버로가에 각 회전 타원 체 허용. 
		참고: 그것은 일반적으로 각 회전 타원 체 중력 우물의 중심으로가을 대 한 5-8 s를 걸립니다. spheroids 마이크로-챔버에 정착 할 때까지 피펫으로 밖으로 당겨 하지 마십시오. 배경 웰 스도 사용 될이 이후 분석 결과 플레이트 (A1, A12, H1, H12)의 4 코너 우물에서 예금 spheroids 하지 않습니다.</li>
		<li>형태와 각 회전 타원 체의 각 센터에는 되도록 각 회전 타원 체의 위치를 모니터링 합니다. 회전 타원 체의 넓은 사용 하 여 밖으로 발음에 의해 잘의 중심에 위치 변경 보어 중력에 의해 피펫으로 후속 증 착 및 필요한 경우.</li>
		<li>모든 spheroids 전송 되었습니다, 일단 1 시간 이전 시험에 대 한 분석 결과 접시는 37 ° C 습도 공기 인큐베이터 (비 CO 2)에 배치.</li>
	</ol></li> <li>화합물 및 수행 분석 결과 센서 카트리지 로드 <ol><li>준비 10 × 집중 분석 결과 특정 시 약 단계 2.1.2에서에서 설명한 분석 결과 특정 미디어에. 예를 들어 GST 수행, 포도 당, oligomycin, 및 2-DG 권장된 볼륨에 다시 구성할 언급 분석 결과 설명서에. GST 및 MST 분석 Patu8902 PS1 spheroids를 사용 하 여 실시 했다.</li>
		<li>제대로 센서 카트리지 행 왼쪽에 A H 표시 방향을 지정 하 고 센서 카트리지 위에 로드 가이드를 배치 합니다. 원하는 포트의 정확한 로드 로드 가이드는 해당 포트를 로드 하는 문자는 왼쪽 상단 모서리에 동쪽으로 향하게 하 여 보장.</li>
		<li>주입 포트에 직접 약을 분배 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여. 절차에 걸쳐 손끝을 사용 하 여 위치에서 로드 가이드를 잡아. 
		참고: 각 시 약 분석 결과 설명서에서 권장된 포트에 주입 될 것입니다. 공기 거품을 만들지 않도록 하지만 어떤 부분의 기포를 제거 하는 카트리지를 누릅니다 하지 않습니다.</li>
		<li>로드 가이드 및 카트리지 눈높이 위치 시각적으로 로드 주입 포트 검사 제거.</li>
		<li>실험 분석 결과 디자인/악기 프로토콜 섹션 2.3에에서 설명 된 대로 악기 컨트롤러 웨이브 소프트웨어 (금 후, 분석 소프트웨어)를 사용 하 여 만듭니다.</li>
	</ol></li> <li>시험 설계 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여 실행 <ol><li>실험에 대 한 분석 결과 템플릿 만들기 <ol><li>분석 소프트웨어를 열고 클릭 &#34; 서식 파일 &#34;는 기존 분석 결과에서 선택 하거나 템플릿입니다. 더블 클릭 &#34; 빈 서식 파일 &#34;.</li>
			<li>정의 실험적인 그룹 및 조건입니다.
			<ol><li>포트 A, B 및 C. 떠나 정의 주입 전략 포트 D 빈. 
				참고: GST 분석 결과 대 한 이러한 포트에만 로드 됩니다 포도 당, Oligomycin와 2-DG. MST 분석 결과, 경우 oligomycin FCCP,로 테 논 로드 됩니다.</li>
				<li>정의 사전 치료 경우 spheroids 컨트롤 그룹과 하나 이상의 테스트 화합물으로 치료 했다. 분석 결과 미디어 소스, 보충, 및 기타 정보를 포함 하도록 정의.</li>
				<li>하나 이상의 셀 유형 (예: Patu8902, PS1) 밀도 및 통로 번호 정보를 보고 정의.</li>
			</ol></li> <li>클릭 &#34; 그룹 생성 &#34;.</li>
			<li>클릭 &#34; 플레이트 지도 &#34; 탭 및 그룹을 해당 실험 디자인 하 시험 접시 할당.</li>
			<li>배경 우물으로 4 개의 코너 웰 스를 선택합니다. 이 우물에서 아무 spheroids는 확인 하십시오.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>분석기에서 분석 결과 실행 <ol><li>악기 프로토콜 탭에서 클릭 선택 하 여 기본 프로토콜 명령을 유지 &#34; 보정 &#34;, &#34; 평형 &#34;와 &#34; 기준 측정 주기 &#34;.</li>
		<li>클릭 &#34; 주사 &#34; 화합물 각 포트에 대 한 정의. 편집 측정 주기 6 사이클에는 기본에서 spheroids에 대 한 3 주기. 기본 3 분 믹스, 0 분 대기, 3 분 측정 시간을 유지. 
		참고: 기본 믹스-대기-측정 시간은 3 분, 0 분, 3 분, 각각. 3 기저 속도 측정 일반적으로 첫 번째 시험 화합물의 주사 전에 간다. 이러한 측정을 보정 하 고 실험적인 디자인에 의하여 재조정 수.</li>
		<li>프로토콜 및 그룹 요약 검토.</li>
		<li>분석 결과 디자인 서식 파일 저장.</li>
		<li>주입 포트 분석 결과 기판으로 로드 되 면 사전 분석 결과 보정을 진행 합니다. 세포 외 유출 분석기 유틸리티 플레이트 카트리지 전송. 
		참고:이 일반적으로 15-20 분 이내 완료 및 OCR 및 ECAR 측정 센서 보정.</li>
		<li>카트리지의 교정, 후 3D spheroids를 포함 하는 미리 데워 분석 결과 플레이트 유틸리티 접시를 대체 하 고 분석 결과 시작할. 측정 완료 후 스프레드시트 또는 그래프와 통계 소프트웨어 데이터를 분석 하는 데이터를 내보낼.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+Novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies.</a> J Cell Commun Signal. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Ware, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+in+vitro+3D+PDAC+stroma+rich+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model.</a> Biomaterials. 108, 129-142 (2016).</li>
<li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Beyond the Petri dish.</a> Nat Biotechnol. 22 (2), 151-152 (2004).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, New York, N.Y. November 1708-1712 (2001).</li>
<li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer.</a> Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+carboxylation+supports+redox+homeostasis+during+anchorage-independent+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth.</a> Nature. 532 (7598), 255-258 (2016).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Tissue+Morphogenesis+and+Cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Souza, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+based+on+magnetic+cell+levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation.</a> Nat Nanotech. 5 (4), 291-296 (2010).</li>
<li>Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culturing+by+magnetic+levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1940-1949 (2013).</li>
<li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spheroid+toxicity+assay+using+magnetic+3D+bioprinting+and+real-time+mobile+device-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging.</a> Sci Rep. 5, 13987(2015).</li>
<li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.promega.com/resources/pubhub/bioprinting-3d-cell-cultures/">Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures</a>. , Promega Corporation. Updated (Figure 1) 1-9 (2015).</li>
<li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+a+three-dimensional+multitype+bronchiole+coculture+model+using+magnetic+levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (9), 665-675 (2013).</li>
<li>Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+in+three-dimensional+levitation+tissue+culture+system+based+on+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles.</a> Tissue Eng Part C, Methods. 19 (5), 336-344 (2013).</li>
<li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+co-culture+model+of+the+aortic+valve+using+magnetic+levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomat%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation.</a> Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).</li>
<li>Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Acute+Extracellular+Flux+%28XF%29+Assay+to+Assess+Compound+Effects+on+Mitochondrial+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screening%22%5BJournal%5D)">The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function.</a> J Biomol Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li>
<li>Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profile+analysis+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Metabolic profile analysis of zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (71), e4300(2013).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> J Vis Exp. (106), e53464(2015).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+Protocol+to+Analyze+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (117), e54918(2016).</li>
<li>Froeling, F. E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+model+of+pancreatic+cancer+demonstrates+that+stromal+cells+modulate+E-cadherin%2C+beta-catenin%2C+and+Ezrin+expression+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells.</a> Am J Pathol. 175 (2), 636-648 (2009).</li>
<li>Kim, J. W., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer%27s+molecular+sweet+tooth+and+the+warburg+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer's molecular sweet tooth and the warburg effect.</a> Cancer Res. 66 (18), 8927-8930 (2006).</li>
<li>Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curbing+cancer%27s+sweet+tooth%3A+Is+there+a+role+for+MnSOD+in+regulation+of+the+Warburg+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Curbing cancer's sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect.</a> Mitochondrion. 13 (3), 170-188 (2013).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21387/full">Cancer statistics, 2017.</a> CA: Cancer J Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
</ol>

저자 조지 W. 로저스와 앤드류 닐슨 직원/주주 Agilent 기술 시 약 및이 문서에서 사용 되는 악기를 생산 하는. 다른 모든 저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

췌장암, 3층 을 사용 하 여 주요 원인이 암 관련 사망자24, 예제와 모델, 신속 하 고 일관 된 방법으로 개발 되었다 성장 하 고 췌장암 세포의 공동 문화를 사용 하 여 3D spheroids 분석 결과 미국에서와 췌 장 섬유 아 세포 활성화. 마그네틱 bioprinting를 사용 하 여, 직경에 있는 400-600 µ m에서 크기에서 배열 하는 spheroids 획득 했다. 이러한 대사 분석 교양된 3D spheroids의 기능을 성공적으로 테스트를 받게 했다. 이 방법은 간단 하 고 일관 된 이며 다른 세포 유형에 쉽게 적응 시킬 수 있다.
동안이 방법을 가속화 되며 3D spheroids를 사용 하 여 수행 하는 분석 실험의 변환 값에 추가, 회전 타원 체 조작의 멀티플렉싱 및 처리 기술을 개발 하 여 향상 될 수 있습니다. 이 전체 시간, 비용 및 분석 결과 수행 하는 데 필요한 노동 감소 추가 해야 합니다. 또한, 정상화 OCR 신호6다른 사람에 의해 보고 하 회전 타원 체 볼륨을 사용할 수 있습니다. 회전 타원 체 볼륨 셀의 평균 볼륨 정규화 셀 당 OCR을 결정 하기 위해 사용 될 수 있지만 계산 셀 당 절대 OCR을 도전 수 있습니다 spheroids의 성장 같지 않을 것 이다, 이후. 현재,이 방법론은 환경 시험에 성장 격판덮개에서 다중 회전 타원 체 처리 및 전송에 효율적인 도구의 부족에 의해 제한 됩니다.
설명 하는 방법은 수정 하 고 자석 bioprinting 기술에서 적응 이며 더 교양된 spheroids 다운스트림 대사 분석 결과 적용 하 여 기능적 관련성을 표시 확인. 메서드는 대부분 종양 조직, 암 세포 및 다른 조사 가능한 분석 실험을 위해 채택 될 수 있다, 암 관련 된 섬유 아 세포에 있는 두 개의 주요 셀 형식을 포함 하는 강력 하 고, 가능한 고 기능 spheroids을 생성 하는 중요 한 도구를 제공 합니다. 같은 약물 스크린. 상대적 용이성 및 NS 방법론의 효율성 같은 교수형 드롭 방법2,26 회전 타원 체 세대의25의 다른 방법을 통해 주요 개선 이다.
이와 같이 생성 하는 강력한 spheroids는 생체 외에서 종양 모델 stromal 세포, 종종 많은 3D 문화 연구에서 포함 된 제공 합니다. 이와 같이 생성 된 3D 회전 타원 체 모델의 응용 프로그램에 대 한 가능성은 광대 한. 예를 들어 같은 모델 세포 세포 상호 작용, 생체 변화를 조사 하 고 유전적 민감성과 다양 한 치료 regimens의 테스트를 사용할 수 있습니다. Vivo에서 종양 microenvironment 정리 3D spheroids 마약 검사 연구와 현재 및 새로운 치료제의 행동의 메커니즘을 조사 하 고 그에 대 한 매우 적절 하 고 유용한 도구 역할을 합니다. 에너지 경로 spheroids 돌연변이 세포 문화 그 유전자 및 암, 관련 3D 모델에서 pathobiology에 관련 된 통로의 역할에 새로운 빛을 발산 도움이 될 수를 사용 하 여 프로 빙 대사 분석이이 연구에서 설명 하는 spheroids 같은.
이 방법의 성공적인 응용 프로그램 제일 이유 로그 단계에서 성장 하는 세포를 수확 해야 하며 자기는 자기 인쇄에 필요한 세포의 건강에 의존 합니다. 그것은 자석 회전 타원 체 드라이브를 사용 하 여 인쇄 자성 전지와 하지 지주 드라이브, 회전 타원 체 세척 및 미디어 보충 설명된 방법의 단계 중에 활용 해야 하는 중요. 변화 분석 실험의 성공적인 판독에 대 한 다른 가장 중요 한 측면은 시험 접시에 성장 격판덮개에서 전송 과정은 spheroids의 형태를 유지 하는 것입니다.
전반적으로,이 프로토콜 암, stromal 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 spheroids의 후속 대사 분석 결과 다음을 포함 하는 3D spheroids의 생성을 위해 설립 되었습니다. 이 방법의 주요 특징은은 빠르고, 쉽게 적응 하 고 일관 된, 관련 그리고 vivo에서 종양 microenvironment 모방, 비교적 저렴을 항 암 종양 생물학을 공부 하 고 개발 하기 위한 새로운 도구로 제공할 수 있다 요원입니다.

지난 10 년간에서 수많은 생체 외에서 3D 모델 정리 하는 비보에 종양 생물학, microenvironment 및 성장 조건 암 세포1,2의 조사 개발 되었습니다. 2 차원 (2D) 단층 세포 생화학 요소와 조사 가능한 화합물에 균일 한 노출 시스템 실패는 extracellular 통해 확산 하는 화합물의 그라데이션 노출 네이티브 3D stromal 종양 상호 복제 하 문화 매트릭스 단백질 (ECM)3,4. 따라서, 2D 조직 문화 모델에 비해 3D 암 모델 잠재적인 종양 microenvironment 시뮬레이션에 더 나은 표시를 등장 하 고 중요 한 도구를 역임 vivo에서 종양 특성, hypoxia, 등 이해 desmoplasia, 휴면, 마약 penetrance, 독성 및 치료 저항5,6. 이 위해 3D 모델 빠른 생성 및 일관성에 대 한 상대적으로 저렴 하 고 최적화 하면서 종양 기능 vivo에서 을 흉내 낸에 의해 2 차원 세포 배양 및 전체 동물 모델 사이의 격차를 해소 하는 가능성이 있다. 이러한 장점은 암 생물학, morphogenesis와 조직7,8공학 등 많은 분야에서 번역 상 연구를 가속 화 하기 위해 악용 되 고 있습니다.
서 진화 하는 3 차원 조직 배양 방법을의 지, 자기 부상 기술을 최근 개발 되었고 성장에 대 한 설명, 다양 한 세포 유형9,10, 에서 파생 된 시 금 및 spheroids의 이미징 11 , 12. 자기 3D bioprinting 이용 생체 나노 입자를 세포 자화 및 멀티 잘 포맷에서 그들을 인쇄 하 여 조직 하 자기 세력의 사용. 일관성, 무력화 하 고 생화학 및 생물 조사10다운스트림 응용 프로그램의 과다에 대 한 고용 수 있는 동일한 3D spheroids 근처의 급속 한 생산 수 있습니다. 여기 우리는 산화 철, 폴 리 L-리 신 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포를 금 나노 입자의 구성 이라고 Nanoshuttle (NS) 생체 재료를 사용 하 여 자석 bioprinting 기술을 적응 했습니다. 원형질 막에 정전 NS 부착은 어떤 특정 한 수용 체, 바인딩할 알려져 있지 하 고 셀에서 출시 1 주일 이내 표면. 그것은 매우 낮은 자기 세력 (30pN) 필요, 충분히 집계 하지만 하지 해 세포와 세포 생존 능력, 신진 대사 또는 3D 문화10,13,14 매우 생체 수 있도록 확산에 영향을 미치지 않습니다. ,15.
이 연구에서는 생성 및 3D 암 세포 섬유 아 세포 spheroids의 대사 분석 결과 설명 예제 및 모델, 췌장암을 사용 하 여. 2D 선박에 경작 하는 세포에서 시작, 우리 자석 bioprinting를 사용 하 여 췌 장 종양-섬유 공동 문화 spheroids의 문화 및 성장 조건을 보여 줍니다. 교양된 spheroids는 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기능 대사 분석 실험에 사용 했다, 두 개의 주요 에너지 생산 경로, 분해 및 다양 한 라이브에서 미토 콘 드리 아 호흡 동시에 측정 하는 기술 시연 세포와 조직16,17,18,,1920. 분해 측정 했다 extracellular 산성화 속도 (ECAR) 변경으로 미토 콘 드리 아 호흡 또는 산화 인 산화 측정 되었다 하는 동안 산소 소비 속도 (OCR)으로. 우리는 췌 장 종양 spheroids에 대 한 개발이 방법 최적화 및 3D 종양 회전 타원 체 세대와 다른 세포/조직 유형 분석 결과 번역 백본으로 사용할 수 있습니다 제안 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA</td><td>Sigma</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 세포 방충제 플레이트</td><td>USA Scientific/ Griener Bio-One</td><td>655970</td><td>스페로이드 성장 플레이트</td></tr><tr><td>셀로메트리 세포 계수 슬라이드</td><td>Nexcelom&nbsp;</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>시그마</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>해당과정 스트레스 테스트 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>103020-100</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마</td><td>59202C</td><td></td></tr><tr><td>미토콘드리아 스트레스 테스트 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>n3D 자기 스페로이드 드라이브</td><td>Nano3D Bioscience</td><td>655841</td><td>스페로이드 Bioprinting Kit</td></tr><tr><td>n3D 자기 스페로이드 홀딩 드라이브</td><td>Nano3D Bioscience</td><td>655841</td><td>Spheroid Bioprinting Kit</td></tr><tr><td>n3D NanoShuttle-PL&nbsp;</td><td>Nano3D Bioscience</td><td>655841</td><td>스페로이드 바이오프린팅의 일부 Kit:&nbsp; 4에 저장 &deg; C</td></tr><tr><td>Patu8902 세포</td><td>실험실 재고</td><td></td><td>췌관 선암 세포</td></tr><tr><td>PS1 세포</td><td>실험실 재고</td><td></td><td>활성화 췌장 성상 세포</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</>span</td> 세포<td>, 스페로이드</td></tr><tr><td>용 성장 매체SeaHorse XFe96 세포외 플럭스 분석기</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>세포외 플럭스 분석기</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>XF 기본 매체</td><td>Agilent Technologies</td><td>102365-100</td><td>XFe96의 대사 분석을 위한 기본 배지</td></tr></tbody></table>

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

췌 장의 암 등 많은 암 종류, 조밀한 거리 기질 종양 진행에 침공 한 중요 한 역할을 했습니다. 활성화 된 암 관련 된 섬유 아 세포 종양 기질 암 세포와 상호 작용 하 고 그들의 성장 및 생존 지원의 핵심 구성 요소입니다. 암 세포의 상호 작용을 정리 하 고 섬유 아 세포를 활성화 하는 모델은 stromal 생물학을 공부 하 고 antitumor 에이전트의 개발을 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 췌장암 세포와 활성화 된 췌 장 fibroblasts 이후의 생물학 연구를 위해 사용할 수 있는 강력한 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 급속 한 세대에 대 한 메서드를 설명 합니다. 또한, 설명 이다 세포 생체 경로 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 프로브를 기능 대사 분석 수행에 3D spheroids의 사용와 결합 회전 타원 체 미 판. 췌 장의 암 세포 (Patu8902)와 활성화 된 췌 장 섬유 세포 (PS1) 공동 경작 했다 생체 나노 어셈블리를 사용 하 여 자기. 자성된 셀 bioprinted spheroids 문화의 5-7 일 이내 400-600 µ m 사이 직경을 가진 생성 하 성장 매체에서 96 잘 형식에서 마그네틱 드라이브를 사용 하 여 빠르게 했다. Patu8902-PS1 spheroids를 사용 하 여 기능 대사 분석 실험 다음 세포 에너지 경로 조사 하는 세포 외 유출 기술을 사용 하 여 실행 되었다. 방법은 여기 간단, 암 세포 섬유 회전 타원 체 공동 문화의 일관 된 세대 수 이며 잠재적으로 다른 암 세포 유형 현재 기술된 방법론의 최적화에 따라 적용할 수 있습니다.

마그네틱 bioprinting 및 3D spheroids의 세포 외 유출 분석에 대 한 일반적인 워크플로 
그림 1 이 프로토콜에서 설명 하는 전체 프로세스에 대 한 개요를 보여 줍니다. 췌 장의 암 세포 (Patu8902)와 활성화 방사상 세포 (PS1) 70-80%의 confluency에 적절 한 성장 매체를 포함 하는 조직 배양 플라스 크에서 경작 했다. 셀 2D 문화 용기에서 분리 했다 세척, 셀 밀도 결정 했다 그리고 마지막으로 1 × 106 셀/mL에 성장 매체에 resuspended 세포. NS, 금, 철 산화물, 그리고 폴 리-L-리 신으로 구성 된 나노 입자 어셈블리 끌다 셀에 사용 되었다. 개별적으로 자성된 Patu8902와 PS1 셀 혼합 그리고 자석 회전 타원 체 드라이브에 장착 된 96 잘 셀 구 충 제 성장 판에 인쇄 된 했다. 우리는 시드 단일 잘 (5000 Patu8902 셀 단일 회전 타원 체를 생성 하는 10000 PS1 세포와 혼합)를 위한 세포의 총 수를 15000을 최적화 했습니다. 어느 시간 동안 이러한 spheroids의 성장 했다 모니터링 하 고 기록 5-7 일에 대 한 적절 한 조직 배양 조건에서 부 화 후 3 차원 spheroids 획득 했다. 씻은 후 분석 결과 미디어와 함께, spheroids 분해 및 미토 콘 드리 아 호흡의 동시 측정을 위한 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 신진 대사 분석을 수행 하는 회전 타원 체 microplate에 물리적으로 옮겨 졌다.
문화 및 췌 장 종양-섬유 아 세포 spheroids의 성장 기능 및 강력한 spheroids를 하려면 상피 암 세포 Patu8902를 라인을 PS1 보충 소 태아 혈 청 RPMI 1640에 교양 있었다 방사상 세포를 활성화 합니다. Pat8902와 PS1 셀 NS와 자기 했다 다음 함께 혼합 1: 2의 비율에 성장 격판덮개에 잘 당 15, 000 셀의 총 씨 만큼. 마그네틱 드라이브에 셀 인쇄의 24 시간 이내 셀 focalized 우물의 센터에 각 잘 아래 각 자석 핀 위에 정확 하 게. Patu8902-PS1 spheroids의 성장 일 2, 4, 7 및 9 셀을 뿌리기 후에 영상 모니터링 했다. 그림 2 는 다양 한 시간 점에서 위의 대표 spheroids의 평균 직경의 정량화를 보여준다. Spheroids의 직경 7 일에 596 µ m 2 게시물 인쇄 당일 414 µ m에서 증가 합니다. 9, 7 일에 성장 사이의 큰 차이 고 따라서 모든 더 실험 제한 되었다 회전 타원 체 성장의 7 일. 우리는 spheroids 취득 외부 가장자리의 주위에 특히 선명 형태학 및 NS 점차적으로 더 균등 하 게 확산 되는 회전 타원 체의 볼륨에 걸쳐 문화에 더 많은 일을 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 그들의 축과 단축의 길이에 따라 10 spheroids의 구형 추정. 평균 구형 0.92 ± 0.04 Patu8902 혼자 (종양), PS1 (실질) 혼자와 0.94 ± 0.02 공동 문화 spheroids에 대 한 0.95 ± 0.04 이다.
를 사용 하 여 췌 장 3D spheroids의 기능 변화 분석 결과 세포 외 유출 분석기 spheroids의 기능을 테스트 하려면 우리 고용 대사 및 생체 분석 조사 spheroids에 에너지 경로. 우리 spheroids 위에서 설명한 교양에 분해 스트레스 테스트 실시. 이 위해, spheroids 공동 문화는 두 종류의 세포에서 인 뿐만 아니라 Patu8902 또는 PS1 세포에서 생성 된 분석 결과를 받게 했다. 흥미롭게도, 모든 세 가지 유형의 spheroids, 개별 또는 혼합 세포에서 발생 하는 여부 GST 분석 결과에 대 한 생물학 기능 응답 전시. Saturating 포도 당 농도, 주입 시 spheroids 유형 테스트 쇼 증가 glycolytic 통로에 ECAR (그림 3)에 있는 증가 의해 입증. Oligomycin를 사용 하 여 미토 콘 드리 아의 ATP 생산은 저해 하는 경우 에너지 생산 분해를 그리고 증가 ECAR에 볼 최대한 glycolytic 용량 셀을 밀어. 2-DG, 경쟁적으로 포도 당 hexokinase glycolytic 활동으로 인해 ECAR 이전 증가 했다는 ECAR 감소 귀착되는 포도 당 아날로그를 사용 하 여 분해 억제 우리는 PS1 혼자 spheroids (평균 직경 250 µ m)으로 인해 그들의 작은 크기와 낮은 glycolytic 용량 Patu8902 암에 비해 상대적으로 낮은 신호 했다 비록이 연구에서 테스트 spheroids이이 패션에 응답 발견 셀 (평균 직경 600 µ m)입니다. 일반적으로, 더 높은 ECAR 신호 파생 된 종양 세포에서 spheroids에서 상대적으로 작은 PS1 구와 그에 비해 파생 spheroids, 가능 하 게 분해22로 암 세포의 고유의 대사 성향에 표시 될 수 있습니다. 23. 비록 우리가 발견 하는 각 형식, PS1 혼자 spheroids 작은, 되 고 중 회전 타원 체 크기 변화 다음 공동 문화 spheroids, 모든 세 가지 유형의 spheroids 셀의 동일한 수를 뿌리기에서 파생 되었다 Patu8902 혼자 spheroids 되는 가장 큰.
3D spheroids에서 미토 콘 드리 아 기능을 테스트 하려면 우리 MST 분석 결과 공동 문화 spheroids 대상이. MST 셀 (그림 4A 와 4B)의 OCR를 직접 측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능의 주요 매개 변수를 측정 합니다. 화합물 (oligomycin, FCCP, 그리고로 테 논 및 antimycin A의 혼합)와 직렬 주입 키 미토 콘 드리 아 등의 매개 변수, ATP 생산, 최대한 호흡, 비-미토 콘 드리 아 호흡을 측정 하기 위해 사용 되었다. 이러한 매개 변수 및 기초 호흡 속도 더 양성자 누출 및 예비 호흡기 용량 (그림 4C)을 계산 하기 위해 사용 되었다. 응답 oligomycin으로 OCR에 감소, ATP synthase (복잡 한 V)의 억제제 셀룰러 ATP 생산과 관련 된 미토 콘 드리 아 호흡에 연관 시킵니다. Spheroids는 oligomycin 최대한 침투 및 효율적인 응답 시간을 허용 하는 긴 기간에 대 한와 함께 알을 품을 했다. FCCP uncoupler와 함께 두 번째 주입 극대 산소 소비와 OCR 증가 자극. FCCP 자극 OCR 예비 호흡기 용량, 증가 에너지 수요에 대응 하는 세포의 능력의 측정을 계산 하는 데 사용 되었습니다. 3 주입; 로 테 논, 혼합 한 (복잡 한 나 억제제), 및 antimycin A (복잡 한 III 억제제) 차단 OCR (그림 4B 의 날카로운 감소도 미토 콘 드리 아 호흡옹 >).
전반적으로, 우리의 관측 위에서 설명한 대로 그들의 신진 대사 발자국/활동 모두 glycolytic 및 미토 콘 드리 아 잠재력 측면에서 측정으로 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 경작된 spheroids의 기능을 확인 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig1.jpg"> 
그림 1 . 문화와 췌장암 세포/섬유 spheroids의 분석 결과 대 한 방법론의 도식 대표. Patu8902 및 PS1cells 교양, trypsinized, 세척 되었고 계산. 시드의 각 회전 타원 체, Patu8902 (5, 000 셀/잘)와 PS1 섬유 아 세포 (10, 000 셀/잘) NS를 사용 하 고 하루에 1 셀 구 충 제 성장 플레이트에 인쇄 된 자력을 띠게 했다. 시드, 후 성장 플레이트 (96 잘 포맷 성장 플레이트의 각 우물에서 하나의 자석)와 자기 회전 타원 체 드라이브에 탑재 되었고 3D spheroids를 2-7 일에 대 한 문화 수 있습니다. 결과 spheroids 세척 되었고 세포 외 유출 악기에 대사 분석을 수행 하는 회전 타원 체 분석 결과 microplates로 전송. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig2.jpg"> 
그림 2 . 췌 장 종양-섬유 아 세포 spheroids의 성장. (Patu8902-PS1 공동 문화 문화 날에 해당 회전 타원 체의 대표 이미지 A)를 상단에 표시 되 고 회전 타원 체 (µ m)의 직경에 크기 아래 계량. 회전 타원 체 크기와 볼륨에 걸쳐 NS 입자 (검은 점)의 보급에 있는 진보적인 증가 2 그리고 7 일 사이 분명 하다. Spheroids는 회전 타원 체 직경에 상당한 증가 초래 하지 않았다이 후, 추가 2 일 문화에 유지 했다. (종양 세포 (Patu8902), 기질 세포 (PS1)와 공동 배양된 세포 (Patu8902 + PS1)에서 파생 된 spheroids의 B) 대표적인 사진은 표시 됩니다. (C) 구형 데이터는 각 그룹에서 10 개인 spheroids에서 묘사 된다. 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig3.jpg"> 
그림 3 . 분해 스트레스 테스트 (GST) 췌 장 spheroids. (다양 한 분석 결과 매개 변수 묘사는 전형적인 glycolytic 함수 분석 결과의 A) 도식 표현입니다. (B) GST 테스트의 예 췌 장 spheroids 설명 된 방법론을 사용 하 여 양식에서 수행. 포도 당 주입 분해 ECAR, 미토 콘 드리 아 호흡을 차단 하는 oligomycin의 추가에 더 증가 함께 증가로 볼 최대 경사로. ECAR 분해를 차단 하 여 2-dg, 포도 당의 경쟁력 있는 아날로그 응답에 빠진다. 모든 spheroids는 GST 분석 결과에 대 한 기능 응답을 전시 설명 되어 있습니다. (GST 분석 결과의 세 가지 주요 매개 변수를 묘사 하는 제조업체의 보고서 생성기를 사용 하 여 GST 분석 결과의 C)는 출력. 오차 막대를 나타냅니다 표준 오차 (SEM)의. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig4.jpg"> 
그림 4. 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 (MST)와 Patu8902 PS1 spheroids. (다양 한 분석 결과 매개 변수는 전형적인 미토 콘 드 리아 기능 분석 결과의 A) 회로도 표현을 묘사 된다. (B) 췌 장 종양-섬유 spheroids에 MST의 예가 표시 됩니다. (C) 공동 문화 3D spheroids MST 분석 결과에 대 한 기능 응답을 전시 한다. 예상 했던 대로, OCR 하락으로 측정 하는 미토 콘 드 리아 기능 spheroids oligomycin, ATP synthase 억제제와 함께 도전 하는 때 주의 되었다. 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여의 저해 시 즉시 축소 최대한 OCR 결과 FCCP 전자 흐름을 램프를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 복잡 한 억제제의-칵테일. 오차 막대를 나타냅니다 표준 오차 (SEM)의. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 췌장암 세포 및 섬유 아 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 대사 기능을 측정 하 여 다음의 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 준비에 대 한 메서드를 설명 합니다.

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

이 방법론의 전반적인 목표는 세포 외 플럭스 분석기(extra-cellular flux analyser)를 사용하여 대사 평가를 위해 췌장암 세포와 섬유아세포로 구성된 3차원 종양 기질 스페로이드를 공배양하는 것입니다. 이 방법은 종양 미세환경이 세포 대사와 약물 민감도에 미치는 영향에 대한 의문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분석 속도가 빠르고 상대적으로 쉽고 재현성이 높으며, 다른 세포주 사례에도 쉽게 적용할 수 있다는 점입니다.시연자는 Pawan Noel와 Ruben Munoz입니다. 표준 무균 조직 배양 기술을 사용하여, 적절한 성장 배지가 담긴 T75 플라스크에서 대상 암세포와 섬유아세포를 배양합니다. 세포의 합쳐짐 정도(confluency)가 70%에서 80%에 도달하면, 5 mL의 PBS로 배양물을 한 번 세척하고, 플라스크당 2 mL의 0.05% trypsin EDTA를 사용하여 37 °C에서 5분 동안 세포를 플라스크 표면에서 떼어냅니다.현미경으로 세포의 탈착을 확인한 후, 플라스크당 8 mL의 성장 배지를 가해 트립신을 불활성화하고, 파이펫으로 세포를 몇 번 옮겨 담아 세포 수를 세기 위한 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 원심분리를 통해 세포를 수집하고, 신선한 성장 배지에서 1 x 10⁶ cells/mL 농도로 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 자성으로 처리하려면, 성장 배지에 10 µL의 nanoshuttle과 100 µL의 세포를 넣고 용액을 부드럽게 흔들어 섞습니다.튜브를 몇 번 부드럽게 반전시킨 후, 세포 나노셔틀 혼합물을 24웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 나노셔틀이 세포 표면에 결합하기 쉽도록 상온에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어주며 세포를 배양합니다. 결합 배양이 끝나면, 피펫팅을 통해 각 자성 세포 현탁액을 부드럽게 섞고, 배지 150 µL당 자성 암세포 또는 섬유아세포의 농도가 1.5 x 10⁴가 되도록 조정합니다.섬유아세포와 암세포를 2:1 비율로 혼합하여, 웰당 총 150 µL의 세포를 분주합니다. 세포 반발 96 웰 플레이트를 얇은 자석이 장착된 96 웰 마그네틱 스페로이드 드라이브 위에 놓고, 각 웰에 150 µL의 세포 혼합액을 분주합니다. 모든 세포의 분주가 완료되면, 마그네틱 스페로이드 드라이브를 부착한 상태로 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, 마그네틱 드라이브를 제거하고 세포를 인큐베이터로 옮겨 최대 7일 더 배양합니다. 대사 분석 전날, 제공된 유틸리티 플레이트의 웰당 200 µL의 분석 캘리브레이터로 프로브 카트리지를 수화하고, 습도가 유지되는 37 °C 비-CO2 인큐베이터에서 유틸리티 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 광학 현미경으로 성장 플레이트 내의 스페로이드를 관찰하여 형태와 전반적인 균일성을 확인합니다.배양 플레이트를 마그네틱 홀딩 드라이브로 옮기고, 웰당 약 120 µL의 배양액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 가온된 분석 배지 120 µL를 사용하여 스페로이드를 3회 부드럽게 세척합니다. 마지막 세척 후, 현미경으로 스페로이드를 다시 관찰하여 씻겨 내려가지 않았는지 확인하고, 각 웰에 가온된 분석 배지 180 µL를 추가합니다.와이드 보어 팁을 사용하여 세포 반발 성장 플레이트에서 사전 세척된 스페로이드 하나를 조심스럽게 흡입한 후, 스페로이드 분석 플레이트의 웰 중앙으로 조심스럽게 옮겨 스페로이드가 중력에 의해 웰의 중앙 마이크로 챔버로 떨어지게 합니다. 모든 스페로이드를 옮긴 후, 분석 플레이트를 non-CO2 37 °C 가습 공기 배양기에 넣고 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 센서 카트리지의 A행부터 H행이 왼쪽에 오도록 배치하고, 로딩할 포트에 해당하는 문자가 왼쪽 상단 모서리에 오도록 카트리지 위에 로딩 가이드를 배치합니다.플레이트가 균일하게 로딩되었다면, 분석 소프트웨어를 열고 템플릿(templates)을 클릭하십시오. 빈 템플릿(blank template)을 더블 클릭한 후 그룹 생성(generate groups)을 클릭하십시오. 플레이트 맵(plate map) 탭에서 실험 설계에 맞춰 어세이 플레이트에 그룹을 할당하고, 네 모서리의 웰을 배경 웰(background wells)로 선택하십시오.기기 프로토콜 탭에서 보정, 평형화 및 기선 측정 사이클을 확인하십시오. 주입(injections)을 클릭하고 각 포트에 대한 화합물을 정의하십시오. 측정 사이클을 6회로 변경하고, 프로토콜과 그룹 요약을 검토한 후, 분석 설계 템플릿을 저장하십시오.분석 설계를 가이드로 삼아, 손끝으로 로딩 가이드를 고정한 상태에서 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 시약을 주입구에 직접 분주하십시오. 모든 시약이 로드되면 로딩 가이드를 제거하고 카트리지를 눈높이로 들어 올려 주입구에 시약이 균일하게 로드되었는지 육안으로 확인하십시오. 유틸리티 플레이트에 있는 카트리지를 세포외 플럭스 분석기(extracellular flux analyser)로 옮긴 후 분석 전 캘리브레이션을 시작하십시오.보정이 완료되면 유틸리티 플레이트를 3D 스페로이드가 포함된 예열된 분석 플레이트로 교체하고 분석을 시작합니다. 분석이 완료되면 데이터를 적절한 데이터 분석 소프트웨어로 내보냅니다. 일반적인 실험에서 스페로이드의 직경은 프린팅 후 2일 차의 약 400 micrometers에서 7일 차에는 거의 600 micrometers까지 증가하며, 7일 차 이후에는 유의미한 증가가 관찰되지 않습니다.세 가지 유형의 스페로이드 배양 모두 포화 농도의 포도당 주입에 따른 당분해 스트레스 분석(glycolysis stress assay)에 대해 생물학적으로 기능적인 반응을 보였으며, 이는 세포 외 산성화 속도의 증가로 입증되었습니다. 일반적으로 상대적으로 크기가 작은 PS1 섬유아세포 유래 스페로이드의 신호와 비교하여, 종양 세포 유래 스페로이드에서 더 높은 세포 외 산성화 속도 신호가 나타나는 것은 암세포 고유의 당분해 대사 성향 때문일 수 있습니다. 종양 섬유아세포 스페로이드의 대표적인 미토콘드리아 스트레스 테스트에서, ATP 합성효소 억제제에 반응하여 미토콘드리아 호흡의 감소가 관찰되었으며, 이는 세포 ATP 생산에 사용되는 미토콘드리아 호흡의 분율과 상관관계가 있습니다.탈커플링제(uncoupling agent)를 두 번째로 주입하자, 미토콘드리아 호흡의 상응하는 증가와 함께 스페로이드의 최대 산소 소비가 자극되었습니다. 전자 전달계 복합체 1 및 3 억제제를 세 번째로 주입하자 미토콘드리아 호흡이 차단되었으며, 이는 산소 소비율의 급격한 감소로 관찰되었습니다. 이러한 매개변수들과 기초 호흡률은 스페로이드의 양성자 누출(proton leak) 및 예비 호흡 용량(spare respiratory capacities)을 계산하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 자성화된 스페로이드에 대한 다중 매개변수 대사 분석이 가능합니다.이 기술을 숙달하면 계획이 잘 세워졌을 때 3~4시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 대사 분석을 수행하기 4~16시간 전에 37°C 인큐베이터에서 프로브를 수화시켜야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 스페로이드 배양 절차 이후에는 약물 효능, 독성, 침투력 및 감수성에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 용량 반응 실험과 같은 다른 분석을 수행할 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, 췌장암 분야의 연구자들은 생체 내 종양 생물학 및 그 특성을 모방한 3차원 모델을 통해 종양 미세환경 내의 종양 기질 상호작용을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 배양된 췌장 종양 및 섬유아세포로부터 3차원 스페로이드를 배양하는 방법부터 세포 대사 기능의 하위 분석에 이르는 과정을 충분히 이해하게 될 것입니다.

preparation-metabolic-assay-3-dimensional-spheroid-co-cultures

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 동영상은 공동 배양된 췌장암 세포와 섬유아세포의 3D 자기 바이오프린팅에 대해 설명합니다. 췌장암 세포와 활성화된 췌장 섬유아세포 세포는 자기력의 영향으로 스페로이드를 생성하기 위해 생체 적합성 나노 입자 어셈블리를 사용하여 공동 배양 및 자화됩니다.

자기 바이오프린팅 3D 스페로이드 공동 배양: 암세포와 섬유아세포를 공동 배양하는 방법

이 프로토콜은 췌장암 세포(Patu8902)와 활성화된 췌장 섬유아세포(PS1)의 공동 배양에서 생성된 3D 스페로이드에 대해 세포 외 플럭스 분석을 수행하여 두 가지 주요 에너지 생성 경로인 해당작용과 미토콘드리아 호흡을 측정하는 기술을 설명합니다.

3D 스페로이드의 세포외 플럭스 분석: 췌장 종양 스페로이드의 대사 활성을 측정하는 방법

이 동영상은 3차원 종양 스페로이드와 T 세포 공동 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. 종양 스페로이드를 함유하는 마이크로웰이 있는 아가로스 캐스트를 준비한 후 T 세포를 첨가합니다. 배양 후 이 설정을 통해 통제된 3차원 환경에서 T 세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

종양 스페로이드에 침투하는 T 세포의 3차원 공동 배양 모델

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

이 프로토콜은 Caco2 결장 아데노암종 세포에서 3차원 스페로이드를 생성하고 성장시키는 새로운 견고하고 재현 가능한 배양 시스템을 제공합니다. 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 암 줄기 세포 생물학을 공부하는 이 접근의 적합성을 위한 개념증명을 제공합니다.

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

췌장암은 여전히 치료하기 가장 어려운 암 중 하나입니다. 따라서 치료 효능을 평가하는 전임상 모델은 재현 가능하고 임상적으로 관련성이 있어야 합니다. 이 프로토콜은 재현 가능하고 임상적으로 유의미한 탈형성 스페로이드를 생성하기 위한 간단한 공동 배양 절차를 설명합니다.

공동 배양에서 Desmoplastic Three-dimensional Pancreatic Cancer Spheroids 성장

학습하세요 췌장암 세포와 섬유아세포의 3D 회전타원체 공동배양법을 통해 세포대사를 평가하는 방법을. 이 기법은 종양 미세환경에서 대사 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

더 많은 동영상 탐색