샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

제브라피시 유충 샘플에서 이 RNASeq 분석의 전반적인 목표는 제브라피시 배아 및 유충에 대한 유전자 발현 프로파일을 식별하고 샘플 간의 유전자 발현 변화에 대한 정량적 비교 진술을 하는 것입니다. 이 방법은 제브라피시 배아 또는 유충이 유익한 모든 분야의 주요 질문(예: 하나의 표적 유전자의 억제가 어떻게 유전자 발현 변화를 초래하는지 또는 다른 조건에 비해 특정 경로의 중단을 초래하는지)에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제브라피쉬가 많은 수의 동물을 생산할 수 있고 전체 동물 전사체 데이터를 쉽게 얻을 수 있다는 것입니다.

또한, 형질전환 동물의 분류를 사용하여 특정 세포 유형을 쉽게 분리할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 대학원생인 Lain Hostelley와 제 연구실의 박사후 연구원인 Jessica Nesmith입니다. 우선, 배아를 생식 성숙기인 생후 3개월까지 배양합니다.

배아 채취 전날 저녁에 원하는 균주에서 성인 수컷 물고기 2마리와 암컷 물고기 3마리를 담수 수조의 분할된 짝짓기 탱크로 분리합니다. 다음 날 아침, 불이 켜진 후 칸막이를 제거하고 수조 바닥에서 배아가 관찰될 때까지 물고기가 자연스럽게 짝짓기를 하도록 합니다. 원하는 수가 수집될 때까지 배아 배지의 별도의 페트리 접시에 30분 간격으로 배아를 수집합니다.

배아를 단계화하기 위해 10cm 페트리 접시당 50-75마리의 그룹으로 배양하여 모든 배아의 일관된 발달 시기를 촉진합니다. 그런 다음 접시를 섭씨 28.5도로 유지하십시오. 분할 후 수정 후 약 24시간(HPF)까지 솜테 수(somite number)를 사용하여 배아 나이를 측정하고 발달 연령에 따라 배아를 분리합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 원하는 단계에서 배아를 안락사시킨 후, 20개의 배아 풀을 라벨이 붙은 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 이식합니다. 그런 다음 마이크로 원심분리기 튜브에서 여분의 배아 배지를 제거합니다. 200마이크로리터의 용해 시약을 튜브에 추가합니다.

그리고 유봉을 사용하여 배아를 기계적으로 균질화합니다. 그런 다음 800마이크로리터의 용해 시약을 추가하여 총 부피를 1밀리리터로 만듭니다. RNA를 추출하기 위해 수집된 샘플에 용해 시약을 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.

사용된 용해 시약 1ml당 클로로포름 0.2ml를 추가하고 15초 동안 손으로 튜브를 뒤집습니다. 2-3분 동안 실온에서 샘플을 배양한 후 15분 동안 12, 000배 G 및 섭씨 4도에서 샘플을 원심분리합니다. 분리된 수성상을 새 튜브로 옮기고 사용된 용해 시약 1ml당 0.5ml의 이소프로판올을 추가합니다.

튜브를 실온에서 10분 동안 배양한 후 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 다음으로, RNA에 75% 에탄올을 첨가하고 7, 500배 G 및 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 완전히 제거하고 샘플을 실온에서 자연 건조시킵니다.

그런 다음 15-30 마이크로 리터의 DEPC 처리 수에 RNA를 다시 현탁시킵니다. 펠릿을 추출하고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 세척한 후 고품질 RNA를 정제하려면 흡수 분광 광도계를 사용하여 추출된 RNA의 농도 및 순도를 분석합니다. 염기서열분석 판독의 정량화를 기반으로 RNASeq 및 유전자 발현 변화 분석을 위해 RNA 샘플을 공급업체 또는 군단에 보내기 전에 260 over 230 값이 약 2.0인지 확인하십시오.

단일 실험 조건과 대조군을 비교하려면 스프레드시트 관리 소프트웨어에서 차등적으로 발현된 유전자의 데이터를 엽니다. 정렬 버튼 옆에 있는 드롭다운 화살표를 선택하고 스프레드시트 내에서 사용자 지정 정렬을 선택합니다. 팝업 창에서 열 아래의 상자를 선택하고 LFC 열을 기준으로 정렬하도록 선택합니다.

sort on(정렬 기준) 열에서 values(값)가 선택되어 있는지 확인합니다. 주문 열에서 가장 큰 것부터 가장 작은 순으로 정렬하도록 선택하고 확인을 클릭합니다. 두 가지 실험 조건에서 발견된 차등적으로 발현된 유전자를 확인하려면 실험 1 대 대조군 스프레드시트에서 빈 열의 첫 번째 셀을 선택합니다.

그런 다음 셀에 다음 수식을 입력합니다. Enter 또는 Return 키를 눌러 방정식을 실행합니다. 수식이 포함된 셀을 선택하고 셀의 오른쪽 아래 모서리에 있는 상자를 클릭합니다.

마우스를 클릭한 상태로 마지막 피쳐 ID를 선택하여 방정식을 열의 각 셀에 복사할 때까지 선택한 영역을 열 아래로 완전히 드래그합니다. 사용자 지정 정렬을 다시 선택하고 왼쪽 아래 모서리에 있는 더하기 아이콘을 클릭하여 두 번째 정렬 수준을 추가합니다. 첫 번째 수준에서 정렬 기준의 열에서 중복을 선택합니다.

정렬 기준에서 값을 선택하고 순서에서 Z를 선택하여 두 번째 수준을 A.In 한 다음 열 아래에서 LFC를 선택합니다. 정렬 기준에서 값을 선택하고, 순서에서 가장 큰 값에서 가장 작은 값을 선택하고, 확인을 선택합니다. 계속하기 전에 유전자 기호(gene symbols) 열에서 괄호를 제거하려면 유전자 기호가 포함된 전체 열을 선택합니다.

편집을 선택한 다음, 드롭다운 파일 메뉴에서 바꾸기를 선택합니다. 바꾸기 창의 찾을 내용 표시줄에 open parenthesis, star, closed 괄호를 입력하고 replace with bar empty를 임대합니다. 모두 바꾸기를 선택하여 괄호의 모든 인스턴스를 제거합니다.

농축 경로를 결정하려면 원하는 유전자 기호를 클립보드에 복사합니다. ConsensusPathDB로 이동한 다음 웹 페이지의 왼쪽 사이드바에서 유전자 세트 분석을 선택한 다음 과대 대표 분석을 선택합니다. 유전자 및 단백질 식별자 목록 붙여넣기 상자에 유전자 목록을 붙여넣습니다.

유전자/단백질 식별자 유형 상자에서 유전자 기호를 선택하고 진행을 클릭합니다. pathway-based sets 섹션에서 pathway 데이터베이스에 의해 정의된 경로 옆에 있는 상자를 선택합니다. find enriched sets를 선택하여 입력 목록에 유전자가 포함된 경로 목록을 얻습니다.

경로 이름 옆에 있는 각 상자를 선택하거나 선택 상자 위의 열 헤더에 있는 선택에서 모두를 클릭하여 경로 네트워크에서 시각화할 보강된 경로를 모두 선택합니다. 그런 다음 선택한 세트 시각화를 선택합니다. 페이지 상단 가운데에 있는 상자 중 하나를 선택하고 원하는 백분율, 상대 중복 또는 공유 후보 수를 입력한 다음 적용을 선택하여 상대적 중복 및 공유 후보 필터를 조정합니다.

농축된 유전자 온톨로지를 결정하려면 해당 그룹의 유전자 기호를 클립보드에 복사합니다. Gene Ontology Consortium의 GO Enrichment 분석 도구로 이동합니다. 페이지 왼쪽의 유전자 ID 아래에 있는 상자에 유전자 기호 목록을 붙여넣습니다.

유전자 ID 상자 아래에서 생물학적 프로세스라는 go-term을 선택합니다. 그런 다음 go terms(go terms) 상자 아래에서 danio rerio를 선택하고 submit(제출)을 클릭합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 QRT PCR을 수행하고 RNASeq와 비교합니다.

alms1 또는 bbs1에 대해 Morpholinos를 주입한 유충에서 추출한 RNA의 염기서열분석은 Alstrom 및 BBS 모델에서 고유하게 상향 및 하향 조절된 유전자와 두 모델 모두에서 크게 변화된 유전자를 밝혔습니다. Alstrom 모델의 분자 프로파일을 보다 명확하게 설명하기 위해 차등적으로 발현된 유전자에서 풍부한 경로와 유전자 온톨로지를 확인했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 총 31개의 경로가 상향 조절되었습니다.

신진대사의 광범위한 그룹화를 제외하고, 가장 큰 영향을 받은 경로는 각각 32개와 20개의 유전자를 가진 선천면역계와 적응면역계였습니다. 다운스트림 B 세포 수용체 신호 전달 이벤트도 강화되었습니다. 상향 조절된 유전자들 사이에서 여러 신호 전달 경로가 풍부해졌는데, 이는 알스트롬 증후군과 원발성 섬모 기능 장애의 연관성과 일치합니다.

또한, 인슐린 분비와 관련된 세 가지 경로를 상향 조절하고, GPR40에 결합한 지방산, 유리 지방산 및 아세틸콜린을 첨가했습니다. 마지막으로, 적혈구 분화(erythrocyte differentiation), 적혈구 항상성(erythrocyte homeostasis), 골수성 세포 항상성(myeloid cell homeostasis) 및 항상성 과정(homeostatic process)을 포함한 6개의 GO 항이 Alstrom 모델에서 상향 조절된 유전자 중에서 풍부해졌습니다. 일단 마스터하면 경로 및 GO 용어 분석을 한 시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 경로 매개변수 및 차단 값의 선택은 RNASeq 발현 비교 결과를 해석할 때 가장 중요한 고려 사항임을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 돌연변이 계통 적용 및 단일 세포 유형의 전사체 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 세포 유형의 전사체 프로파일링 및 특정 유전자의 제어에 따른 유전자 발현 변화와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 RNASeq에서 생성된 제브라피시 전사체 데이터를 사용하여 실험 샘플 간의 중요한 유전자 발현 변화를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.