Name: 샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 배우세요 제브라피시 배아 및 유충에서 RNASeq 기반 전사체 분석 방법을 통해 유전자 발현 프로파일을 식별하고 정량적 비교를 수행하는 기술입니다. 이 방법은 발달생물학 및 신경과학 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.), 및 T32DK098107에 의해 지원 되었다 (T.L.H. 및 J.E.N.).

아래에 설명 된 모든 동물 프로토콜 따라 고 메릴랜드 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 대학에 의해 승인.
 1. 배아 준비 <ol><li>자연 교배를 통해 배아를 생성 <ol><li>3 개월, 문화 배아 생식 성숙 5 , 8 .</li>
		<li>배아 컬렉션, 전에 저녁에 나누어 짝짓기 탱크에 원하는 긴장에서 성인 남성과 여성 물고기를 분리 하 고 각 탱크 2 남성 및 여성 3 추가. 
		참고: 유전자 변형 insulin2a:mCherry 형광 기자 긴장의 사용 허용 췌 장 β-세포의 분석.</li>
		<li>전송 물고기 짝짓기를 신선한 시스템 물 탱크 및 다음 아침에와 서 불 후에 즉시 구분선 제거.</li>
		<li>배아 하단 탱크에서 관찰 된다 때까지 자연스럽 게 짝을 물고기 허용. 원하는 금액을 수집 될 때까지 30 분 간격으로 배아를 수집 합니다. 각 저장소 수집 시간 포인트에서 28.5 배아 미디어에서 별도 접시에 ° c.</li>
		<li>바란다면, 실험적인 문화 미디어 6, 유전 물질 또는 배치의 microinjection를 수행 하 고 신선한 행 크에 배아를 문화 &#39; s 배아 중간 8 28.5 ° c.에 10 cm 배양 접시에 참고: morpholino (MO) 주입 또는 돌연변이 동물 유전자 표정 분석, 참고 각 조작 유전자 발현에 부수적 영향을 미칠 수 있습니다. 뮤턴트 전사 모 기반 유전자 9를 대상으로 관찰 되지 않는 수준에서 유전자 보상을 전시할 수 있다.</li>
	</ol></li> <li>단계 배아 <ol><li>배아의 그룹에서 문화 50 &#8211; 75 배아 모든 배아의 일관 된 발달 타이밍 홍보 10 cm 배양 접시 당.</li>
		<li>모니터링 발달 형태를 사용 하 여 해 현미경 blastomere, epiboly, 및 somite 단계에서 발달 진행 10. 
		참고: 제거 접시에 발달 지연을 방지 하기 위해 모든 죽어가는 또는 잘못 된 배아.</li>
		<li>배아 발달 연령에 따라 구분 합니다. 약 24까지 세분화 (포스트 gastrulation, 10.33 h 게시물 수정 (hpf)) 후 somite 번호를 사용 하 여 태아 나이 측정 hpf. 배아와 24 후 몸 전체 길이 사용 하 여 애벌레 hpf. 
		참고:는 somites는 태아의 등 쪽 부분에 쉐 브 론 모양의 mesodermal 조직.</li>
		<li>28.5 ° C 인큐베이터에 정렬 된 배아를 놓고 원하는 시대에 진행에 개발을 허용.</li>
	</ol></li></ol> 2. 단일 셀 분리: 모든 배아 및 정렬 셀 인구 <ol><li>전체 태아 분리 <ol><li>운동 관찰 될 때까지 5-15 분 동안 얼음에 페 트리 접시를 배치 하 여 원하는 단계에서 zebrafish 태아 안락사 .</li>
		<li>레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 수영장 20 배아 전송. Microcentrifuge 튜브에서 초과 배아 미디어를 제거.</li>
		<li>추가 200 µ L 세포 시 약 (재료의 표 참조) 배아를 포함 하는 관에. 기계적으로 방 앗 공이 사용 하 여 세포 시 약에 배아 균질 1 ml 전체 볼륨을가지고 800 µ L 세포 시 약을 추가 합니다. RNA 추출까지-80 ° C에서 저장소.</li>
	</ol></li> <li>흐름 정렬 셀 격리 11 <ol><li>1.5 mL microcentrifuge 튜브로 페 트리 접시에서 배아를 전송 하 고 가능한 많은 배아 매체 제거. 
		참고: 배아 나이 따라 기계적 분리도 필요할 수 있습니다이 단계에서. 배아와 &#62; 48 hpf, 좋습니다 계속 하기 전에 배아 무결성을 방해 하는 유 봉 사용.</li>
		<li>분리 버퍼 1의 1 mL와 함께 태아를 품 어 (재료의 표 참조) 1.5 mL microcentrifuge 관에서. 실 온에서 15-30 분 동안 품 어. 부드럽게 인큐베이션 단계 마다 3-4 분 섞어 P1000 팁을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 솔루션을 triturate. 와 동 하지 마십시오.</li>
		<li>X 300g에 3 분 동안 원심 분리 하 여 배아를 수집 하 고는 상쾌한 제거. 다시 1 mL 분리 버퍼 2 (재료의 표 참조)에 태아를 일시 중단 합니다. 일반 피펫으로 분쇄와 실 온에서 15-30 분 동안 품 어.</li>
		<li>현미경 (FACS) 버퍼를 정렬 하는 형광 활성화 셀에서 서 스 펜 션의 1-2 µ L를 diluting 하 여 소화를 평가. 
		참고: 완전 한 소화 시험된 약 수 최소 셀 클러스터 및 배아 조직의 조각으로 단일 셀 때 발생 했습니다.</li>
		<li>5 분 제거 상쾌한에 대 한 300 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집합니다. 다시 1 mL FACS 버퍼, 그리고 중력 필터에 소화 되지 않은 조직 샘플에서 제거 하려면 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀을 중단.</li>
		<li>는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 FACS 버퍼 약 1 x 10 6 셀/mL FACS 튜브에서를 희석. 
		참고: 셀 배아 (5% 미만 총의), 췌 장 β-세포 등 당 상대적으로 작은 수를 사용 하 여 1000 단계 일치 하는 배아의 최소.</li>
		<li>FACS 정렬 FACS 관 세포 시 약 또는 FACS 버퍼만 포함 된 뿐만 아니라 FACS 튜브 셀 서 스 펜 션의 1 mL를 포함 하는 시설을 제공 합니다. 형광 기자를 나타내는 단일 셀만 수집 FACS 흐름 정렬 게이트.</li>
		<li>FACS 흐름 정렬 원하는 셀 번호가 수집 될 때까지 수행. 
		참고: RNASeq를 수행 하려면 저기는 최소한 총 RNA. 우리 3000-5000 셀 충분 한 높은-품질, 고 농도 RNA를 분리 하는 것으로 나타났습니다.</li>
		<li>얼음에 수집 된 세포를 저장 하 고 즉시 RNA 준비 진행.</li>
	</ol></li></ol> 3. RNA 준비 <ol><li>RNA 추출 <ol><li>세포 시 약 실 온에서 5 분으로 (2 단계)에서 수집 된 샘플을 품 어.</li>
		<li>추가 세포 시 약의 각 1.0 ml 클로 프롬의 0.2 mL 사용 하 고 실 온에서 2-3 분 15 미 품에 대 한 손으로 튜브를 반전. 4에서 15 분 동안 12000 x g에서 샘플을 원심 ° c.</li>
		<li>신선한 튜브를 분리, 수성 단계를 전송 하 고 세포 시 약 사용의 각 1.0 ml 소 프로 파 놀의 0.5 mL를 추가 합니다. 실 온에서 10 분 동안 품 어. 4에서 10 분 동안 12000 x g에서 샘플을 원심 ° c.</li>
		<li>75% 에탄올 세척 및 4에 5 분 동안 7500 x g에서 샘플을 원심 ° c.는 상쾌한을 완전히 제거 하 고 실 온에서 건조 공기를 허용. 다시 15-30 µ L diethyl pyrocarbonate (DEPC)에서 RNA를 중단-물 처리.</li>
	</ol></li> <li>Purify 높은-품질 RNA <ol><li>1/10 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.5) RNA 서 스 펜 션 결합 및 소 프로 파 놀의 1 볼륨. 실 온에서 20 분 동안 품 어와 4에서 10 분 동안 12500 x g에서 샘플을 원심 ° c.</li>
		<li>DEPC 처리 물에 얼음 처럼 차가운 70% 에탄올과 펠 릿을 세척 하 고 4 시 5 분에 대 한 10000 x g에서 샘플을 원심 ° C. 반복 세척 단계를 한 번.</li>
		<li>는 상쾌한을 제거 하 고 실 온에서 건조를 허용. DEPC 처리 물에 다시 중단.</li>
		<li>농도 (ng / µ L) 및 순도 (260/230 비율)는 흡수 분 광 계를 사용 하 여 추출 된 RNA 분석 결과. 260/230 값 인지 확인 ~ 2.0 RNASeq와 함께 진행 하기 전에. 우리까지-80 ° C에서 저장e (최대 6 개월).</li>
		<li>RNA 샘플 공급 업체 또는 코어에 RNASeq에 대 한 보내고 유전자 발현 분석 읽기 시퀀싱의 정량화에 따라 변경 하십시오. 공급 업체에서 반환 되는 결과 일반적으로 샘플 사이 대 본 읽기에 중요 한 배 변화를 전시 하는 유전자의 목록으로 제공. 
		참고: 위의 방법 품질 RNA를 생성 하는 경우 열 사용할 수 있습니다. 금액, 농도, 및 RNA 무결성 번호 (린) RNA 샘플에 대 한 코어를 확인 한다. 공급 업체 또는 코어 린 평가 또한 일반적으로 것입니다.</li>
	</ol></li></ol> 4. 통로 이동 기간 분석 참고: 코어 또는 공급 업체에서 제공 하는 RNASeq 후 그림 1 유전자 표정 분석의 대표적인 출력을 참조 하십시오.
스프레드시트 관리 소프트웨어에서 <ol><li><ol><ol><li>오픈 컨트롤에 대 한 실험 조건 비교 <li>정렬 차동 유전자 표현 데이터 (결과) (참조 자료 테이블 ).</li>
			<li>선택 드롭-다운 화살표 옆에 &#39; 정렬 &#39; 단추 및 선택 &#34; 사용자 정의 정렬 &#34; 제어 조건 대 실험에서 차동 표현한 유전자를 포함 하는 스프레드시트 내에서.</li>
			<li>선택 아래에 있는 상자 &#39; 열 &#39; 팝업 창에서 고 기준으로 정렬 하려면 선택 합니다 &#39; LFC &#39; 열. 확인 &#39; 값 &#39;에서 선택은 &#39;에 정렬 &#39; 열. 정렬 선택 &#39; 내림차순 오름차순 &#39;에 &#39; 순서 &#39; 열과 클릭 &#34; 확인 &#34;. 
			참고:이 정렬 됩니다 차동 표현한 유전자는 그 감소 식 (부정적인 LFC) 목록 하단에 나타납니다 동안 증가 식 (긍정적인 LFC)와 그 목록의 상단에 나타납니다.</li>
		</ol></li> <li>다음과 같이 단일 컨트롤에 여러 실험 조건 비교.
		<li>선택 <ol>차동 결정 제어 스프레드시트 대 실험 1에 빈 열에서 첫 번째 셀 두 실험 조건에서 발견 하는 유전자 표현. 셀에 다음 수식을 입력: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56187/56187eq1.jpg" /> 참고:이 식은 if, ISERROR, 조합 및 일치 기능. (i) MATCH 함수를 일치 (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0), a 1에 값에 대 한 보이는 것입니다 (합 ID) Experimental2_vs_Control 라는 스프레드시트의 A 열 (A:A)에서 (Experimental2_vs_Control!). &#34; 0 &#34;, 정확 하 게 일치 찾아가 정확히 일치 하는 경우 함수 값을 반환 합니다 &#34; 1 &#34;, 일치 하는 것이 없는 경우 함수는 오류를 반환 합니다 &#34; n / &#34;. (ii) 일치 함수의 결과 다음 ISERROR 함수, ISERROR (일치 (A1, Experimental2_vs_Control로 입력! A:A, 0)), 어디에, 입력이 &#34; 1 &#34; 반환 됩니다 발견 일치 하는 항목을 나타내는 &#34; FALSE &#34;, 그리고 입력이 &#34; n / &#34; 나타내는 일치 하는 찾을 수 없습니다, 그것은 반환 됩니다 &#34; 진정한 &#34;. (iii)는 &#34; 진정한 &#34; 또는 &#34; FALSE &#34; 결과 다음 IF 함수에 입력 하는 경우 (ISERROR (일치 (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), &#34; &#34;, &#34; 중복 &#34;), 어디에, 입력이 &#34; 진정한 &#34; 나타내는 일치 하는 항목을 찾을 수 없습니다, 그것은 첫 번째 집합 따옴표의 사이 값을 반환 합니다 (&#34; &#34;)는 빈, 그리고 따라서 해당 셀이 비어 있을 것입니다. 입력이 &#34; FALSE &#34; 발견 일치 하는 항목을 나타내는, 그것의 따옴표 두 번째 집합의 중간 값을 반환 합니다 (&#34; 중복 &#34;), 그리고 셀 말할 것 이다 &#34; 중복 &#34;.</li>
			<li>기자 &#34; 입력 &#34; 또는 &#34; 반환 &#34; 방정식을 실행. 방정식에 포함 된 셀을 선택 하 고 셀의 오른쪽 하단 모서리에 있는 상자를 클릭 합니다. 마우스 클릭을 유지 하 고 마지막까지 열 아래로 선택된 영역을 끌어 &#39; 기능 ID &#39;, 열에 있는 각 셀에 수식 복사.</li>
			<li>선택 &#34; 사용자 정의 정렬 &#34; 다시 클릭 하 여 정렬의 두 번째 수준 추가 &#34; + &#34; 왼쪽된 하단 모서리에 아이콘. 첫 번째 레벨에서 &#34;으로 정렬 &#34;, 열 선택에서 &#34; 중복 &#34;, 정렬에 선택에서 &#39; 값 &#39;, 주문 선택 아래 &#39; a Z &#39;. 두 번째 레벨에서 &#34;에 의해 다음 &#34;, 열 선택에서 &#39; LFC &#39;, 선택 정렬에에서 &#39; 값 &#39;, 주문 선택 아래 &#39; 내림차순 오름차순 &#39; 선택 &#34; 확인 &#34;. 
			참고:이 식 변경의 방향에 따라 4 그룹으로 유전자 목록이 정렬 됩니다. 식에서 변화 같은 방향 또는 반대 방향에서 둘 다에 되도록 두 실험 조건에서 발견 하는 유전자를 확인 하는 것이 중요 하다.</li>
			<li>절차 또는 결과 데이터베이스에서 발견 되지 것입니다 하기 전에 유전자 기호 열에서 모든 괄호를 제거 합니다. 유전자 기호를 포함 하는 전체 열을 선택 합니다. 선택 &#34; 편집 &#34; 다음 &#34; 대체 &#34; 드롭-다운에서 &#39; 파일 &#39; 메뉴. 유형 &#34; (*) &#34;에 &#34; 찾을 내용: &#34; 바꾸기 창과 휴가의 바는 &#34; 바꿉니다: &#34; 빈 바. 선택 &#39; 모두 &#39; 괄호의 모든 인스턴스를 제거 하려면. 
			참고:는 * 임의 개수의 문자, 프로그램은 강조 표시 된 셀에서 모든 인스턴스를 찾을 것인지 묻는 메시지가 두 괄호 및 괄호의 모든 인스턴스 사이이 문자를 배치 하 여 아무것도, 그로 인하여 그들을 제거 교체 될 것 이다 나타냅니다.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>결정 농축 경로 <ol><li>복사 클립보드에 농축된 경로 결정 하는 한 세트의 유전자 기호 소원. ConsensusPathDB 12로 이동 합니다. 선택 &#34; 유전자 분석 설정 &#34; 다음 웹 페이지의 왼쪽된 사이드바에서 &#34; 이상의 표현 분석 &#34;.</li>
		<li>에 유전자의 목록을 붙여 넣습니다는 &#34; 유전자/단백질 식별자의 목록을 붙여 넣습니다 &#34; 상자. 선택 유전자 기호는 &#34; 유전자/단백질 식별자 형식 &#34; 상자와 클릭 &#34; 진행 &#34;. 옆에 있는 상자를 선택 &#34; 경로 경로 데이터베이스에 정의 된 대로 &#34; 통로-기반 설정 섹션. 
		참고: 다양 한 분석에 대 한 옵션 검색 가능한 데이터베이스의 목록을 포함 하 여 표시 됩니다. 그들은 가장 설립 하 고 포괄적인 드 Kegg 및 Reactome 데이터베이스를 제외한 모든 데이터베이스를 선택 하는 것이 좋습니다. 입력 목록 및 p-값 컷오프 설정 최소 중복 또한 필요에 따라 조정할 수 있다. 이러한 설정은 기본 2 유전자 최소 중복 및 0.01 p-값 구분에서 떠나는 것이 좋습니다.</li>
		<li>선택 &#34; 찾을 풍부한 세트 &#34; 입력된 목록에서 유전자를 포함 하는 경로 목록을 가져올 수. 
		참고: 출력 다음 각 통로의 이름을 포함 하는 표 형식에 있을 것입니다 &#34; 크기 설정 &#34; (통로에서 전체 유전자의 수를 나타내는), &#34; 후보자 포함 된 &#34; (그 경로에 있는 입력된 목록에 있는 유전자의 수를 나타내는 ), p-값 및 q 값 (루즈벨트), 및 통로 식별 되.</li>
	</ol></li> <li>통로 네트워크의 세대 <ol><li>농축된 경로 위에서 설명한 대로 결정.</li>
		<li>모든 수를 경로 이름 옆에 있는 각 상자를 선택 하 여 또는 클릭 하 여 경로 네트워크에 시각화 하 농축된 경로 선택 &#34; 모든 &#34; 아래 &#34; 선택 &#34; 선택 상자 위에 열 머리글에서 다음 선택 &#34; 시각화 선택 된 세트 &#34;. 
		참고: 좋습니다 미만 30; 있다면 모든 경로 시각화 30 경로 보다 큰 경우 (입력된 목록에서 유전자의 많은 수를 포함 하는 그들) 최고 30 가장 풍부한 경로 선택 하면 것이 좋습니다.</li>
		<li>조정은 &#34; 상대 오버랩 &#34; 및 &#34; 공유 후보 &#34; desir 페이지의 위쪽 가운데의 중 상자를 선택 하 고 입력 필터,에 드 % 상대 겹치거나 통로 네트워크, 명확 하 고 선택에서 더 많은 관련 있도록 더 엄격한 것 공유 후보자의 수 겹치는 &#34; 적용 &#34;. 
		참고: 좋습니다 0.2, 최소 상대 중복을 연결, 2 경로와 2 공유 후보자의 최소 20% 유전자 중복을 나타내는. 그래프 범례 페이지의 왼쪽 상단에 있는 그래프 범례를 클릭 하 여 볼 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>농축 이동 용어의 결정 <ol><li>하나 클립보드에 풍부한 유전자 온톨로지를 결정 하고자 하는 그룹의 유전자 기호를 복사. 이동 하는 &#39;가 농축 분석 도구 &#39; 유전자 존재론 협회 13에. 유전자 기호 목록 아래에 있는 페이지의 왼쪽에 있는 상자에 붙여 &#34; 여기 당신의 유전자 Id &#8230; &#34;</li> <li>유전자 Id 상자 아래에 나열 됩니다를 사용 하려면 이동 용어 집합 선택: 생물 학적 과정, 분자 또는 세포 구성 요소. (권장) 선택 &#39; 생물 학적 과정 &#39;. 선택 &#39; Danio rerio &#39; 이동 아래 조건 상자와 클릭 &#34; 제출 &#34;. 
		참고: 사용 하 여 좋습니다 0.05의 기본 p-값 컷오프.</li>
	</ol></li></ol> 5. QRT-PCR 확인 참고: RNASeq에 중요 한 유전자 식 변경으로 확인 된 개별 유전자 복제 실험에서 대상된 qRT-PCR에 의해 확인 되어야 한다.
<ol><li>cDNA 합성 <ol><li>섹션 3.1에 설명 된 방법을 사용 하 여 태아에서 RNA를 추출 합니다. RNA 추출.</li>
		<li>CDNA cDNA 변환을 사용 하 게 RNA의 변환 1 µ g 키트 (재료의 표 참조). RNA, dNTPs, 역전사 효소를 결합. 제조 업체에 따르면 thermocycler 반응 수행 &#39; s 사양.</li>
		<li>는 CDNA DEPC 처리 물에 1:3 희석. 1-2 개월까지 4 ° C에서 저장소.</li>
	</ol></li> <li>qRT-PCR 확인 <ol><li>유전자 RNA 시퀀싱 결과에서 qRT-PCR에 의해 확인를 선택 합니다. 식에 높은 배 변화 유전자를 식별 합니다. 또한 높은 읽기 수를 포함 하는 하는이 유전자의 결정이 풍부한 식 나타냅니다.</li>
		<li>높은 배 변화, 유전자의 높은 읽기 수 목록에서에서 10-12 목표를 선택합니다. 적어도 1 intron-엑손 경계에 걸쳐 있는 대상 유전자를 증폭 하는 뇌관 디자인.</li>
		<li>정량 Pcr 뇌관 디자인 사이트 14에 유전자 또는 유전자의 대상된 영역을 입력합니다. 선택은 &#34; 2 정량 Pcr 뇌관 디자인 &#34; 및 뇌관 세트를 만드는 사이트. 
		참고: 샘플 사이의 비교를 정상화 하 내부 제어 뇌관, β-걸, 등을 포함 해야 합니다. Β-말라 뇌관은 f: 5 &#39;-TCGAGCTGTCTTCCCATCCA-3 &#39; r: 5 &#39;-TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3 &#39;.</li>
		<li>는 CDNA, 앞으로 뇌관, 역방향 뇌관, 및 중 합 효소 결합. QRT-PCR 증폭 유전자 15의 상대 식을 결정 하려면 수행.</li>
		<li>상대 부 량 결정 15 관심사의 유전자의 상대적 mRNA 표정 분석.</li>
		<li>QRT-PCR RNASeq 차동 식의 방향을 일치 하는지 확인 결과를 비교.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+body+proteins+regulate+Notch+signaling+through+endosomal+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).</li>
<li>Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li>
<li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318(2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 설명 하는 접근의 전체 또는 특정 정렬된 셀 인구 transcriptome 수준 분석에 대 한 상대적으로 신속 하 고 비용 효과적인 전략을 제공 합니다. Zebrafish는 편리 함과 소재, 유전 구현의 용이성 또는 환경 실험 조건, 및 큰의 가용성을 시작 하는 많은 양의 생성 속도 때문에 연구의이 유형에 대 한 유리한 모델을 제공 합니다. 셀 형 구체적이 고 조직 특정 인구의 격리를 허용 하는 유전자 변형 기자 라인의 스펙트럼.
여기서 설명 하지, 하는 동안이 방법을 수 쉽게 조직 단면도 FACs 및 수집 하는 대신 청소년 이나 성인 물고기에서 수집을 수용 하 게 됩니다. 우리는 또한 기본적인 스프레드시트 명령 및 기존 통로 및 이동 데이터베이스의 사용에만 의존 하는 기본적인 후속 분석 전략을 개발 했다. 이 방법의 주요 장점은 컴퓨터 프로그래밍 이나 데이터베이스 관리에서 높은 수준의 전문성을 필요로 하지 않고 접근의 용이성입니다. 따라서,이 전략은 큰 유전자 ...

글로벌 유전자 발현의 비교 분석 관찰된 고기에 기여 하는 새로운 유전자를 식별 하는 중요 한 도구입니다. 이러한 분석 일반적으로 사본 풍부 실험 사이 비교의 양적 평가에 의존 및 샘플을 제어. QRT-PCR 등 타겟된 방법을 상대적으로 신속 하 고 정확한 단일 유전자 식 변경의 조사에 대 한 있습니다. RNA 시퀀싱 (RNASeq) 샘플, 그건 지금 그런 수사에 대 한 표준 실험 시스템 사이의 유전자 발현에 중요 한 변화를 식별 하는 광범위 한, 가설-무료 접근을 제공 합니다.
Zebrafish는 많은 질병 분야에 걸쳐 눈에 띄는 모델로 떠오르고 있다. 원래 발달 생물학 연구, 그들의 높은 통치 및 유지 보수, 상대적으로 낮은 비용 때문에 그들의 유틸리티에 대 한 개발 zebrafish의 실험적인 사용 진화 했다 다양 한로 서 뿐만 아니라 성인 단계 배아에서 고기를 포함 한 다양 한 분자의1,2,3분석 실험. 사실, 이러한 장점을 분자 기계 연구 급속 한 만들고 많은 양의 자료를 습득의 용이성 때문에 비용 효율적인 생활의 모든 단계에서 유전과 환경 조작의 용이성과 결합. 또한, zebrafish 태아 그리고 애벌레의 투명 한 자연 세포-조직-특정 유전자 변형 기자 라인 개별 셀 인구4의 비보에 시각화 수 있도록 생성에 대 한 이상적인 게. 같은 라인의 착취 리포터 유전자 발현에 따라 특정 격리 된 세포 유형에서 글로벌 유전자 표정 분석을 허용 합니다.
여기 선물이 zebrafish 태아의 문화 후 RNASeq를 사용 하 여 글로벌 유전자 표정 분석에 대 한 포괄적인 프로토콜. Morpholino (모)를 포함 하 여 유전 실험 조작-기반된 변이 유전자 최저 또는 CRISPR 중재 게놈 편집, 제시 된 다른5,,67. 우리는 따라서 전체 배아에서 RNA의 격리에 대 한 자세한 프로토콜에 초점 또는 경로 도구와 유전자 존재론 (가십시오) 용어를 사용 하 여 RNASeq 결과의 간단한 계산 분석 뒤 유전자 변형 기자 표현 셀 정렬. 마지막으로, 우리 정량 역전사 PCR (qRT-PCR)에 의해 유전자 표현 변경의 유효성 검사에 대 한 전략을 포함 했다. 이러한 프로토콜 zebrafish 태아 다양 한 실험 조건, 유전 돌연변이 또는 환경 조건 비교를 포함 하 여 대상에 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>Commercial Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriZol</td><td>Thermo Scientific</td><td>15596026</td><td>용해 시약</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>해리 버퍼 1</td></tr><tr><td>FACSMax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>해리 버퍼 2</td></tr><tr><td>DEPC 처리된 물</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>FirstStrand cDNA 변환</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1621</td><td>cDNA 변환 키트</td></tr>, <tr><td>2X SYBR Green Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qRT-PCR Master Mix</td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-9042</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td> 이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Zebrafish Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuebingen</td><td>ZIRC</td><td>ZL57</td><td></td></tr><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 미크론 세포 여과기</td><td>Sigma</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>FACS 관</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>결합 탱크 1.0L 교차 탱크 세트</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브 5 mL 폴리 프로필렌 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consensus Path DB</td><td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GO 농축 분석</td><td>http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

샘플 준비 및 제 브라에서 rnaseq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

글로벌 진 식 변화의 분석 기본 관찰된 phenotypes 소설 경로 식별 하는 데 유용한 도구입니다. Zebrafish는 동물의 많은 수에서 RNA의 분리의 용이성으로 인해 전체 동물 또는 개별 세포 인구에서 전체 transcriptome의 신속한 평가 위한 훌륭한 모델입니다. 여기에서 zebrafish 태아 RNA 시퀀싱 (RNASeq)를 사용 하 여 글로벌 진 식 분석을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 우리는 전체 배아 또는 유전자 변형 동물에서 정렬 셀을 사용 하 여 얻은 세포 인구에서 RNA의 준비를 설명 합니다. 또한 RNASeq 데이터 농축된 경로 및 글로벌 유전자 표현 데이터 세트에 유전자 존재론 (가십시오) 용어를의 분석에 대 한 접근 방식을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 유전자 식 변경 정량 역전사 PCR (qRT-PCR)를 사용 하 여 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 이러한 프로토콜 사용할 수 있습니다 제어의 비교 분석 및 실험 세트 zebrafish의 소설 유전자 표현 변화를 식별 하 고 분자 통찰력의 고기를 제공 합니다.

차동 정렬 유전자 표현:
Zebrafish 모델의 Alström 증후군 및 Bardet Biedl 증후군 (게시판)의 애벌레 단계에서 차동 표현한 유전자를 식별 하기 위해 우리 중 alms1 타겟 또는 주입 bbs1 녹취 록 이전 스플라이스 차단 MOs로 검증 야생-타입 zebrafish 태아16,17. 5 일에서 포스트 수정 (dpf), 제 3 항에에서 설명 된 대로 RNA의 2 개의 복제 배아 제어 모, 주사 뿐만 아니라 각 조건에서 추출 되었다. 각 샘플에서 RNA의 깊이에 시퀀싱 했다 ~ 120 백만으로 읽습니다 ~ 107 백만 읽고 zebrafish 게놈에 정렬. 게놈의 exonic 영역에 매핑된 정렬된 읽기의 85-90% ...

이 프로토콜에서 zebrafish 태아, 애벌레, 전체 transcriptome 분석에 대 한 접근을 제공 하거나 셀을 정렬 합니다. 우리는 RNA의 격리, RNASeq 데이터의 통로 분석 및 유전자 표정 변화의 qRT-PCR 기반 유효성 검사를 포함합니다.

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

제브라피쉬 치어 샘플을 이용한 이 RNASeq 분석의 전반적인 목표는 제브라피쉬 배아 및 치어의 유전자 발현 프로파일을 확인하고, 샘플 간의 유전자 발현 변화에 대해 정량적인 비교 분석을 수행하는 것입니다. 이 방법은 제브라피쉬 배아 또는 치어가 유용한 정보를 제공하는 모든 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 특정 표적 유전자의 억제가 다른 조건과 비교하여 유전자 발현 변화나 특정 경로의 교란을 어떻게 유도하는지 등을 분석할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제브라피쉬를 대량으로 생산할 수 있으며, 동물 전체의 전사체 데이터를 쉽게 얻을 수 있다는 점입니다.또한, 형질전환 동물의 분리법을 사용하여 특정 세포 유형을 쉽게 분리할 수 있습니다. 시연 절차는 제 실험실의 대학원생인 Lain Hostelley와 박사후 연구원인 Jessica Nesmith가 진행하겠습니다. 우선, 배아를 생식 성숙기인 3개월령까지 배양하십시오.배아 수집 전날 저녁, 원하는 계통의 성체 수컷 2마리와 암컷 3마리를 새 시스템 워터가 담긴 분리된 교배 탱크에 나누어 넣습니다. 다음 날 아침, 조명이 켜진 후 분리대를 제거하고 수조 바닥에 배아가 관찰될 때까지 물고기가 자연스럽게 교배하도록 둡니다. 원하는 수의 배아가 수집될 때까지 30분 간격으로 배아 배지가 담긴 별도의 페트리 접시에 배아를 수집합니다.배아의 발달 단계를 설정하려면, 모든 배아의 발달 시기를 일정하게 유지하기 위해 10 centimeter 페트리 접시당 50~75개씩 그룹으로 나누어 배양합니다. 그 다음, 플레이트를 28.5 degrees Celsius로 유지합니다. 분절화 이후부터 수정 후 약 24시간(HPF)까지 체절 수를 이용하여 배아의 연령을 측정하고, 발달 연령에 따라 배아를 분류합니다.텍스트 프로토콜에 따라 원하는 단계에서 배아를 안락사시킨 후, 배아 20개를 라벨이 부착된 1.5 milliliter 미세원심분리관에 옮깁니다. 그다음 미세원심분리관에서 과량의 배아 배양액을 제거합니다. 튜브에 200 microliters의 용해 시약을 첨가합니다.그리고 유발을 사용하여 배아를 기계적으로 균질화합니다. 그다음, 총 부피가 1 mL가 되도록 용해 시약을 800 µL 더 추가합니다. RNA를 추출하려면 수집된 샘플에 용해 시약을 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.사용된 용해 시약 1 mL당 0.2 mL의 클로로포름을 첨가하고, 튜브

sample-preparation-analysis-rnaseq-based-gene-expression-data-from

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

양질의 절연이 손상 RNA는 많은 실험실 프로토콜에서 필수적인 단계입니다. 여기, 우리는 전체 zebrafish의 배아 및 유전자 표현 microarray 분석 등 다양한 실험 절차에 후속 응용 프로그램에 대한 cDNA 합성에서 RNA 추출을 보여줍니다.

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

유전자 microarrays는 게놈 전체의 수준에서 유전자 발현 프로 파일링에 강력한 도구입니다. 이 기술은 발달 생물학 및 독성학을 포함한 생물 학적 다양한 분야에 응용 프로그램을하고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 세부 zebrafish에 대한 포괄적인 oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석을위한 프로토콜을.

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

이 기사는 자연스러운 짝짓기와 발달 단계 분류를 통해 제브라피시 배아를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 형질전환 어류를 사용하여 췌장 β세포를 분석하는 데 추가로 사용됩니다.

짝짓기와 난자 발굴: 배아를 생성하고 발달 단계별로 분류하는 방법

제브라 피쉬의 심장 개발하는 동안 심장 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위해, 총 RNA는 고립 된 마음에서 추출해야합니다. 여기서 우리는 심장 별의 mRNA를 얻기 위해 제브라 피쉬 배아에서 빠른 설명서를 해부하여 기능 / 구타 마음을 수집하기위한 프로토콜을 제시한다.

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

Zebrafish 최근 연구 개발 하는 동안 DNA 복제 타이밍을 vivo에서 모델 시스템으로 사용 되었다. 여기 상세한 프로필 복제 타이밍에 zebrafish 태아를 사용 하기 위한 프로토콜. 이 프로토콜 돌연변이, 개별 세포 유형, 질병 모델, 그리고 다른 종에서 복제 타이밍을 공부 하기 쉽게 적응 될 수 있다.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

우리는 신경 세포, 대 식 세포 및에서 생리 및 병 적인 조건 하에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia 분리 프로토콜을 제시. 절연, 시 RNA 유전자 식 프로필 분석 하이 셀에서 추출 됩니다. 이 프로토콜 정량 및 transcriptomics 같은 다운스트림 분석에 대 한 높은-품질 RNA의 컬렉션에 대 한 수 있습니다.

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

여기, 우리는 성인 zebrafish의 자연 병원 체 진 균 marinum를 사용 하 여에 프로토콜 모델 인간의 결핵을 제시. 추출 된 DNA와 RNA 감염 된 zebrafish의 내부 장기에서 총 mycobacterial를 물고기와 정량으로 호스트의 면역 반응에 로드 공개를 사용할 수 있습니다.

진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

골격 근 재생 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 손상 되는, 그리고이 재생 하는 근육의 무능력 결과. 여기서는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사할 수 있는 프로토콜을 설명합니다.

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

반응성 친전자필 및 산화제(Z-REX)를 표적으로 하는 제브라피쉬는 반응성 소분자 신호 조사를 위한 화학 생물학 기반 방법입니다. 이 기술은 다양한 발달 단계의 활어에 적용 할 수 있습니다. 여기에서는 신호 전달 경로 분석을 위해 제브라피쉬의 표준 분석과 Z-REX를 결합합니다.

유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

여기에서는 제브라피시 유충에서 형광 단백질 태그로 단백질을 라벨링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 새로 개발 및 수정된 생체 내 시스템으로, 제브라피시의 저농도 단백질을 시각화하는 데 특히 유용합니다.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

배우세요 제브라피시 배아 및 유충에서 RNASeq 기반 전사체 분석 방법을 통해 유전자 발현 프로파일을 식별하고 정량적 비교를 수행하는 기술입니다. 이 방법은 발달생물학 및 신경과학 연구에 활용됩니다.

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

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