샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

제브라피쉬 치어 샘플을 이용한 이 RNASeq 분석의 전반적인 목표는 제브라피쉬 배아 및 치어의 유전자 발현 프로파일을 확인하고, 샘플 간의 유전자 발현 변화에 대해 정량적인 비교 분석을 수행하는 것입니다. 이 방법은 제브라피쉬 배아 또는 치어가 유용한 정보를 제공하는 모든 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 특정 표적 유전자의 억제가 다른 조건과 비교하여 유전자 발현 변화나 특정 경로의 교란을 어떻게 유도하는지 등을 분석할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제브라피쉬를 대량으로 생산할 수 있으며, 동물 전체의 전사체 데이터를 쉽게 얻을 수 있다는 점입니다.

또한, 형질전환 동물의 분리법을 사용하여 특정 세포 유형을 쉽게 분리할 수 있습니다. 시연 절차는 제 실험실의 대학원생인 Lain Hostelley와 박사후 연구원인 Jessica Nesmith가 진행하겠습니다. 우선, 배아를 생식 성숙기인 3개월령까지 배양하십시오.

배아 수집 전날 저녁, 원하는 계통의 성체 수컷 2마리와 암컷 3마리를 새 시스템 워터가 담긴 분리된 교배 탱크에 나누어 넣습니다. 다음 날 아침, 조명이 켜진 후 분리대를 제거하고 수조 바닥에 배아가 관찰될 때까지 물고기가 자연스럽게 교배하도록 둡니다. 원하는 수의 배아가 수집될 때까지 30분 간격으로 배아 배지가 담긴 별도의 페트리 접시에 배아를 수집합니다.

배아의 발달 단계를 설정하려면, 모든 배아의 발달 시기를 일정하게 유지하기 위해 10 centimeter 페트리 접시당 50~75개씩 그룹으로 나누어 배양합니다. 그 다음, 플레이트를 28.5 degrees Celsius로 유지합니다. 분절화 이후부터 수정 후 약 24시간(HPF)까지 체절 수를 이용하여 배아의 연령을 측정하고, 발달 연령에 따라 배아를 분류합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 원하는 단계에서 배아를 안락사시킨 후, 배아 20개를 라벨이 부착된 1.5 milliliter 미세원심분리관에 옮깁니다. 그다음 미세원심분리관에서 과량의 배아 배양액을 제거합니다. 튜브에 200 microliters의 용해 시약을 첨가합니다.

그리고 유발을 사용하여 배아를 기계적으로 균질화합니다. 그다음, 총 부피가 1 mL가 되도록 용해 시약을 800 µL 더 추가합니다. RNA를 추출하려면 수집된 샘플에 용해 시약을 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.

사용된 용해 시약 1 mL당 0.2 mL의 클로로포름을 첨가하고, 튜브를 손으로 15초 동안 뒤집어 섞습니다. 샘플을 실온에서 2~3분 동안 배양한 후, 12,000 ×g, 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 분리된 수성층을 새 튜브로 옮기고, 사용된 용해 시약 1 mL당 0.5 mL의 이소프로판올을 첨가합니다.

튜브를 상온에서 10분 동안 배양한 후, 시료를 10분 동안 원심분리합니다. 다음으로, RNA에 75% ethanol을 첨가하고 7,500 ×g, 4 °C에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 완전히 제거하고 시료를 상온에서 자연 건조시킵니다.

그런 다음, RNA를 15~30 µL의 DEPC 처리수로 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 펠릿을 추출하고 샘플을 세척한 후 고순도 RNA를 정제하려면, 흡광 분광광도계를 사용하여 추출된 RNA의 농도와 순도를 분석하십시오. 시퀀싱 리드 정량화에 기반한 RNASeq 및 유전자 발현 변화 분석을 위해 RNA 샘플을 업체나 기관에 보내기 전, 260/230 값이 약 2.0인지 확인하십시오.

단일 실험 조건과 대조군을 비교하려면 스프레드시트 관리 소프트웨어에서 차별 발현 유전자 데이터를 엽니다. 정렬 버튼 옆의 드롭다운 화살표를 선택하고, 스프레드시트 내에서 사용자 지정 정렬을 선택합니다. 팝업 창이 나타나면 열 아래의 상자를 선택하고 LFC 열을 기준으로 정렬하도록 선택합니다.

정렬 기준 열에서 '값'이 선택되었는지 확인하십시오. 정렬 순서 열에서 내림차순(큰 값에서 작은 값 순)으로 정렬하도록 선택하고 확인을 클릭하십시오. 두 실험 조건에서 발견된 차등 발현 유전자를 결정하려면, '실험군 대 대조군' 스프레드시트의 빈 열에 있는 첫 번째 셀을 선택하십시오.

그런 다음, 셀에 다음 수식을 입력하십시오. 엔터(Enter) 또는 리턴(Return) 키를 눌러 수식을 실행합니다. 수식이 포함된 셀을 선택하고 셀의 오른쪽 하단 모서리에 있는 상자를 클릭하십시오.

마우스 클릭을 유지한 채 선택 영역을 열의 맨 아래까지 드래그하여 마지막 기능 ID까지 선택함으로써 열의 각 셀에 수식을 복사합니다. 사용자 지정 정렬을 다시 선택하고 왼쪽 하단의 플러스 아이콘을 클릭하여 두 번째 정렬 수준을 추가합니다. 첫 번째 수준의 '정렬 기준' 내 '열'에서 duplicate를 선택합니다.

'정렬 기준'에서 '값'을 선택하고, '순서'에서 'Z에서 A'를 선택하십시오. 두 번째 수준의 '다음 기준'에서 '열'의 'LFC'를 선택하십시오. '정렬 기준'에서 '값'을 선택하고, '순서'에서 '큰 값에서 작은 값'으로 선택한 후 '확인'을 누르십시오. 계속하기 전에 유전자 기호 열에서 괄호를 제거하려면, 유전자 기호가 포함된 열 전체를 선택하십시오.

드롭다운 파일 메뉴에서 편집을 선택한 다음 바꾸기를 선택하십시오. 바꾸기 창의 찾을 내용란에 열기 괄호, 별표, 닫기 괄호를 입력하고, 바꿀 내용란은 비워 두십시오. 모든 괄호를 제거하려면 모두 바꾸기를 선택하십시오.

농축된 경로를 결정하려면, 원하는 유전자 기호를 클립보드에 복사하십시오. ConsensusPathDB로 이동하여 웹페이지 왼쪽 사이드바에서 gene set analysis를 선택한 다음, over-representation analysis를 선택하십시오. 유전자 및 단백질 식별자 목록 붙여넣기 상자에 유전자 목록을 붙여넣으십시오.

유전자/단백질 식별자 유형 상자에서 유전자 기호를 선택하고 proceed를 클릭하십시오. 경로 기반 세트 섹션에서 경로 데이터베이스에 의해 정의된 경로 옆의 상자를 선택하십시오. find enriched sets를 선택하여 입력 목록의 유전자를 포함하는 경로 목록을 얻으십시오.

경로 이름 옆의 각 상자를 선택하거나, 선택 상자 위의 열 헤더에 있는 'select' 항목에서 'all'을 클릭하여 경로 네트워크에서 시각화할 모든 농축 경로를 선택하십시오. 그런 다음, 'visualize selected sets'를 선택하십시오. 페이지 상단 중앙에 있는 상자 중 하나를 선택하고 원하는 백분율, 상대적 중첩도 또는 공유 후보 수를 입력한 뒤 'apply'를 선택하여 상대적 중첩 및 공유 후보 필터를 조정하십시오.

농축된 유전자 온톨로지를 결정하려면, 해당 그룹의 유전자 기호를 클립보드에 복사하십시오. Gene Ontology Consortium의 GO Enrichment 분석 도구로 이동합니다. 페이지 왼쪽에 있는 'your gene IDs here' 아래의 상자에 유전자 기호 목록을 붙여넣으십시오.

유전자 ID 상자 아래에서 GO term의 biological process를 선택하십시오. 그다음 GO terms 상자 아래에서 danio rerio를 선택하고 submit을 클릭하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 QRT PCR을 수행하고 RNASeq 결과와 비교하십시오.

alms1 또는 bbs1에 대항하는 Morpholino를 주입한 유충에서 추출한 RNA를 시퀀싱한 결과, Alstrom 및 BBS 모델에서 독특하게 상향 및 하향 조절된 유전자와 두 모델 모두에서 유의하게 변화된 유전자들이 밝혀졌습니다. Alstrom 모델의 분자적 프로파일을 더욱 명확히 규명하기 위해, 차별적으로 발현된 유전자에서 풍부하게 나타나는 경로와 유전자 온톨로지를 식별하였습니다. 여기에서 알 수 있듯이, 총 31개의 경로가 상향 조절되었습니다.

대사라는 광범위한 그룹 외에 가장 큰 영향을 받은 경로는 각각 32개와 20개의 유전자가 포함된 선천 및 적응 면역 체계였습니다. 하위 B 세포 수용체 신호 전달 이벤트 또한 농축되었습니다. Alstrom 증후군이 일차 섬모 기능 장애와 연관되어 있다는 점과 일관되게, 상향 조절된 유전자들 사이에서 여러 신호 전달 경로 또한 농축되었습니다.

또한, GPR40에 결합된 지방산, 유리 지방산, 그리고 아세틸콜린과 관련된 인슐린 분비 경로 세 가지가 상향 조절되었습니다. 마지막으로, Alstrom 모델의 상향 조절된 유전자들 사이에서 적혈구 분화, 적혈구 항상성, 골수성 세포 항상성 및 항상성 과정을 포함한 6개의 GO 항이 풍부하게 나타났습니다. 숙달되면 경로 및 GO 항 분석은 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 경로 파라미터와 컷오프 값의 선택이 RNASeq 발현 비교 결과를 해석하는 데 있어 가장 중요한 고려 사항임을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 세포 유형의 전사체 프로파일링 및 특정 유전자의 제어 하에 있는 유전자 발현 변화와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 돌연변이 라인 적용 및 단일 세포 유형의 전사체 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 RNASeq으로 생성된 제브라피시 전사체 데이터를 사용하여 실험 샘플 간의 유의미한 유전자 발현 변화를 식별하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.