Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

이 방법의 전반적인 목표는 제브라피시 배아를 라이브 이미징을 위해 고정하여 후방 신체 영역의 정상적인 성장을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 발달 중인 제브라피시의 다른 영역을 이미징하는 데에도 적용할 수 있습니다. 본 기술은 개별 세포의 행동이 어떻게 전체 조직 수준의 형태 형성을 유도하는지와 같은 발생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다.

이 기술의 주요 장점은 배아를 올바른 방향으로 유지하면서 후방 체절의 자유로운 움직임을 가능하게 한다는 점입니다. 우선, 50밀리리터 튜브에 담긴 E3 배지에 최종 농도가 1.5%가 되도록 저융점 아가로스를 첨가하고, 전자레인지로 가열하여 아가로스를 용해합니다. 해당 용액을 항온수조 또는 벤치탑 인큐베이터에서 42~45도로 평형화하십시오.

텍스트 프로토콜에 따라 유리 니들을 제작합니다. 핀셋을 사용하여 니들이 굴곡지는 지점 바로 윗부분을 부러뜨려, 배아의 방향을 잡거나 과잉 아가로스를 제거하는 데 사용할 수 있도록 깨끗하고 날카로운 니들을 만듭니다. E3 배지에서 배아를 적절한 단계까지 성장시킵니다.

그 다음, 실체 현미경 하에서 날카로운 핀셋을 사용하여 배아의 난막을 제거합니다. 난막이 제거된 배아를 트리카인(tricaine) 작업 용액에서 최소 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 난막이 제거된 배아를 최소량의 E3 용액과 함께 45 °C 아가로스(agarose)가 담긴 50 mL 튜브로 직접 옮깁니다.

약 1mL의 마운팅 아가로스와 함께 배아를 제거한 후, 배아가 포함된 배지 약 100µL를 35mm 유리 바닥 페트리 접시 바닥에 있는 10mm 마이크로웰 중앙으로 옮깁니다. 마운팅 배지가 굳어짐에 따라, 꼬리가 바깥쪽을 향하도록 배아를 아가로스 원의 가장자리로 이동시킵니다. 모세관 바늘을 사용하여 배아를 최대한 측면으로 정렬하여 후신체 발달 과정을 촬영합니다.

그 다음 모세관을 사용하여 겔이 완전히 굳을 때까지 배아를 원하는 측면 방향으로 유지합니다. 아가로스 방울이 굳으면, 트리케인(tricaine) 작동 용액을 사용하여 페트리 접시를 가득 채웁니다. 그런 다음, 투과광 베이스가 장착된 해부 현미경 아래에서 거울의 위치와 입사광의 각도를 조절하여, 강한 대비를 통해 아가로스의 절단 부위가 명확하게 보이도록 합니다.

첫 번째 절개를 수행하려면, 모세관 바늘이나 마이크로 메스를 사용하여 난황의 인접한 중간 지점, 형성 중인 심장 영역 바로 뒤쪽부터 다섯 번째 전방 체절까지 아가로스를 위아래로 톱질하듯 절개하며, 아가로스를 완전히 통과해 유리판까지 절단하십시오. 이때 난황낭 위의 아가로스를 절개하는 동안 배아가 손상되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 다음으로, 배아에서 시작하여 유리판까지, 처음 다섯 개의 체절에 접하도록 두 번째와 세 번째 절개를 수행하여 후방 신체가 등쪽으로 펼쳐지게 합니다.

그런 다음, 1번과 3번 절단면이 만나는 지점에서 시작하여 3번 절단면의 끝을 향해 천천히 대각선으로 절단하면서, 천천히 위로 들어 올려 후방 몸체를 둘러싸고 있는 아가로스 사각형 조각을 분리합니다. 날카로운 핀셋을 사용하여, 페트리 접시의 벽면을 지지대로 삼아 아가로스 조각들을 들어 올려 배아 배지에서 제거합니다. 시료를 고정하기 전에, 1% agarose in E3를 사용하여 100mm 플라스틱 접시에 5mm 높이로 도포하고 굳힙니다.

그런 다음 1 mL의 저융점 아가로스 한 방울을 디시 중앙에 떨어뜨리고 마찬가지로 굳을 때까지 기다립니다. 이 비디오의 앞부분에서 시연한 것처럼 배아를 저융점 아가로스에 매립합니다. 다만, 이번에는 50 mL 아가로스 튜브에서 작은 방울의 용액으로 배아를 꺼낸 다음, 이 작은 방울을 디시 중앙에 있는 1 mL 방울 위에 올립니다.

모세관 바늘을 사용하여 배아를 작은 액적의 중앙에 위치시키고, 겔이 굳을 때까지 올바른 방향을 유지하십시오. 마지막으로, 트리카인(tricaine) 작업 용액을 디시에 가득 채워 과잉의 아가로스를 제거하십시오. 광전환 형광 단백질 kikumeGR을 인코딩하는 mRNA가 주입된 후 15 소마이트(somite) 단계에서 마운팅되어 12시간 동안 타임랩스 이미징을 거친 제브라피시 배아의 예시가 이 애니메이션 비디오에 나와 있습니다.

후방 신체 부위가 자유롭게 움직이도록 하며, 이는 일반 배양 조건에서 난막 없이 발달하는 배아에서 관찰되는 것과 유사한 형태적 변화를 보입니다. 본 영상에서는 16세포기 배아에 핵을 표지하는 histone 2BRFP와 세포막을 표지하는 CAAXGFP를 인코딩하는 mRNA를 주입하였습니다. 꼬리눈(tail bud) 형성 과정 중의 세포 거동을 시각화하기 위해, 10소마이트(somite) 단계부터 3시간 동안 25X 수침 대물렌즈가 장착된 정립 다광자 현미경으로 이미지를 촬영하였습니다.

꼬리아(tail bud)가 정상적으로 형성됨에 따라 세포가 활성 돌기를 생성하고 방향성 이동을 하는 것을 관찰할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 20분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 아가로스 겔이 굳을 때 배아가 측면 위치에 있도록 유지하는 것이 중요합니다.

그렇지 않으면, 이미징 중에 관심 영역이 시야 밖으로 빠르게 벗어나게 됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 후방 신체 신장(posterior body elongation)의 라이브 이미징을 위해 제브라피시 배아를 마운트하는 방법에 대해 명확히 이해하게 될 것입니다.