Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

이 방법의 전반적인 목표는 생체 이미징을 위해 제브라피시 배아를 장착하여 후체 부위의 정상적인 성장을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 발달 중인 제브라피시의 다른 영역을 이미징하는 데 적용할 수 있습니다. 이 기술은 개별 세포 행동이 전체 조직 수준에서 형태 형성으로 이어지는 방법과 같은 발달 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 배아를 올바른 방향으로 유지하면서 후체의 자유로운 순간을 가능하게 한다는 것입니다. 시작하려면 50 밀리리터 튜브에 E3 배지에 최종 농도 1.5 %의 저 융점 아가로 로즈를 추가하고 전자 레인지에서 가열하여 아가로 로즈를 용해시킵니다. 용액이 수조 또는 벤치 탑 인큐베이터에서 섭씨 42도에서 45도로 평형을 이루도록 합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 유리 바늘을 당긴 후. 한 쌍의 집게를 사용하여 바늘이 구부러지는 지점을 지나 바늘을 부러뜨려 배아의 방향을 잡고 과도한 아가로스를 제거하기 위한 깨끗하고 날카로운 바늘을 만듭니다. 배아를 E3 배지의 적절한 단계까지 올립니다.

그런 다음 양안 해부 현미경으로 한 쌍의 날카로운 집게를 사용하여 배아를 제거한다. 탈이온화된 배아를 트리카인 작업 용액에서 최소 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 최소한의 E3로 탈코리온화된 배아를 섭씨 45도의 아가로스의 50밀리리터 튜브로 직접 옮깁니다.

약 1밀리리터의 장착 아가로스와 함께 배아를 제거하고 배아와 함께 약 100마이크로리터의 배지를 35mm 유리 바닥의 페트리 접시 바닥에 있는 10mm 마이크로웰의 중앙으로 옮깁니다. 장착 매체가 설정되면 꼬리가 바깥쪽을 향하도록 배아를 아가로스 원의 가장자리로 이동합니다. 모세혈관 바늘을 사용하여 배아를 가능한 한 옆으로 배치하여 후체 발달을 이미지화합니다.

그런 다음 모세혈관을 사용하여 겔이 완전히 굳을 때까지 배아를 원하는 측면 방향으로 유지합니다. 아가로스 방울이 굳으면 트리카인 작업 용액을 사용하여 페트리 접시를 범람시킵니다. 그런 다음 투과광 베이스가 있는 해부 현미경으로 거울 위치와 입사광의 각도를 조정하여 강한 대비로 아가로스의 절단을 명확하게 볼 수 있도록 합니다.

절단을 수행하려면 모세관 바늘 또는 마이크로 메스를 사용하여 아가로스를 위아래로 톱질하는 동작으로 난황을 따라 중간, 형성 심장 필드 바로 뒤에서 다섯 번째 전방 소마이트 아래로, 그리고 아가로스를 통해 유리로 완전히 자릅니다. 여기서 중요한 것은 노른자 자루 위에서 아가로즈를 자르는 동안 배아가 손상되지 않도록 하는 것입니다. 다음으로, 배아에서 시작하여 유리까지 두 번째 및 세 번째 절단을 수행하여 처음 5개의 소마이트와 접하여 뒤쪽 몸체의 등쪽 전개를 허용합니다.

그런 다음 절단 1과 3의 교차점에서 시작하여 절단 3의 끝을 향해 천천히 대각선으로 절단하면서 천천히 위로 들어 올려 뒤쪽 몸체를 둘러싼 아가로스의 사각형을 제거합니다. 한 쌍의 날카로운 집게를 사용하여 아가로스 조각을 들어 올리면서 페트리 접시의 벽을 지지대로 사용하여 배아 배지에서 제거된 아가로스 블록을 제거합니다. 시료를 장착하기 전에 E3에서 1% 아가로스를 사용하여 100mm 플라스틱 접시를 5mm 높이로 코팅하고 굳힙니다.

그런 다음 1ml의 저융점 아가로스를 접시 중앙에 한 방울 떨어뜨리고 굳히도록 합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 저융점 아가로스에 배아를 삽입합니다. 그러나 이번에는 더 작은 용액 한 방울로 아가로스 50 밀리리터 튜브에서 배아를 제거하고이 작은 방울을 접시 중앙의 1 밀리리터 방울 위에 놓습니다.

모세관 바늘을 사용하여 배아를 작은 방울의 중앙에 배치하고 겔이 굳을 때까지 올바른 방향을 유지합니다. 마지막으로 트리카인 작업 용액을 사용하여 접시를 범람시키고 과도한 아가로스를 제거합니다. 광전환성 형광 단백질 kikumeGR에 대한 mRNA 인코딩을 주입한 다음 15 somite 단계에 장착하고 12시간 동안 타임랩스 상상을 한 제브라피시 배아의 예가 이 애니메이션 비디오에 나와 있습니다.

후체는 자유롭게 움직일 수 있으며 정상적인 배양 조건에서 융모막이 자유롭게 발달할 수 있는 배아에서 볼 수 있는 것과 유사한 형태 변화를 보입니다. 이 비디오에서 배아는 핵을 표시하는 히스톤 2BRFP와 세포막을 표시하는 CAAXGFP를 인코딩하는 mRNA를 16 세포 단계에서 주입했습니다. 꼬리 싹 형성 중 세포 행동을 시각화하기 위해 10 솜 단계에서 25X 침수 대물렌즈가 있는 직립 다광자 현미경으로 3시간 동안 이미지를 촬영했습니다.

세포는 꼬리 새싹이 정상적으로 형성됨에 따라 활성 돌출부와 방향 이동을 생성하는 것을 볼 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 20분 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 아가로스 겔이 굳는 동안 배아가 측면 위치에 있는지 확인하는 것이 중요합니다.

그렇지 않으면 이미징 중에 관심 영역이 시야에서 빠르게 이동합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 후체 신장의 실시간 이미징을 위해 제브라피시 배아를 장착하는 방법을 명확하게 이해하게 될 것입니다.