Name: Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 배우세요 제브라피시 배아의 후방 신체 발달을 위한 장기 실시간 이미징 기법을 Danio rerio에서. 이 방법은 정상적인 발달을 유지하면서 세포 행동을 관찰하여 발생생물학 연구에 유용합니다.

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Estelle Hirsinger: 파스퇴르 연구소 및 Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS)의 핵심 자금 지원. 에스텔 히르싱어(Estelle Hirsinger)는 국립과학연구센터(Centre National de la Recherche Scientifique, CNRS) 출신이다. 벤자민 스티븐턴(Benjamin Steventon)은 Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS)의 지원을 받았고, 그 다음에는 루 펠로우십(Institut Pasteur), AFM-Téléthon 펠로우십 (번호 16829)의 지원을 받았습니다. 그는 현재 Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship의 지원을 받고 있습니다.

1. 솔루션의 준비 및 뽑아 유리 바늘 <ol><li> 20 mM 트리스 pH가 8.8에 4 ㎎ / ㎖에서 Tricaine (3- 아미노 벤조산 에틸 에스테르라고도 에틸 3- 아미노 벤조 에이트)의 25 배 스톡 용액을 제조하고 그 용액의 pH에서 4 밀리리터 매장 제 나누어에서 가져 -20 ° C. 참고 : 마취 Tricaine함으로써 근육의 경련 및 운동 (6)을 차단하는 신경 전압 문이 나트륨 채널을 우선적으로 작용한다. </li><li> E3 배아 매체에 0.17 ㎎ / ㎖의 최종 농도 Tricaine의 작동 용액을 만든다. (7) 참고 :이 용액의 pH가 품으로 즉흥적 솔루션을 작업 Tricaine을 확인합니다. </li><li> 전자의 용액을 가열하여 50 ㎖ 튜브에서 E3 배아 배지에서 1.5 %의 최종 농도로 저 융점 아가로 오스를 녹인다. 물 목욕이나 벤치 탑 인큐베이터 중 하나에서 45 ° C -이 솔루션은 42 평형을 보자. 수직에 대한 많은 요리를 준비하는 경우빛 장 영상 (4 단계), 아가로 오스 E3 배아 매체에 1 % 표준 용융의 추가 25 mL로. </li><li> OD 1.20 mm, ID 0.69 mm, 길이 10mm의 크기와 필라멘트 모세 혈관과 붕규산 유리를 사용합니다. </li><li> 날카로운 집게 한 쌍으로, 속도 (50), 시간 (225), 압력 (500) (120)를 당겨, 열 (600), 브레이크 : 모세 혈관은 장비 및 시약, 다음 설정을 사용의 표에 설명 된 가열 필라멘트 바늘 풀러의 종류에 가져온 경우 단지 지점 과거 바늘되는이 배아를 배향하고 초과 아가로 오스를 제거하는 깨끗하고 날카로운 바늘을 만들 구부러. 마이크로 메스 또한 과량 아가 로스를 제거 할 수있다. </li></ol> 거꾸로 또는 수직 현미경을위한 배아 2. 퍼가기 <ol><li> E3 배아 매체에 적절한 단계로 배아를 올립니다. (7) </li><li> 양안 dissec 아래 날카로운 집게 한 쌍의 필수 단계에서, dechorionate 배아팅 현미경. </li><li> Tricaine 작업 용액에 적어도 5 분 동안 dechorionated 배아를 품어. </li><li> 용융 아가 용액을 45 ° C로 냉각되면, E3 매체의 최소한의 전송로 50 ㎖ 튜브에 직접 dechorionated 배아를 전송하는 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다. </li><li> 매체를 장착 약 1 ml의와 함께 배아를 제거하고 약 추가 할 수 있습니다. 10 밀리미터 마이크로 웰과 35mm 유리 바닥 페트리 접시의 중앙 원에 배아와 함께 매체를 장착 100 ㎕. </li><li> 설치 매체가 설정 될 때, 바깥쪽으로 (그림 1A)를 직면 꼬리 아가로 오스의 원의 가장자리로 배아를 이동합니다. 겔이 완전히 설정 될 때까지 원하는 횡 방향 배아를 유지하는 모세관 바늘을 사용한다. 이미지 후방 신체 발달, 가능한 한 측면 오리엔테이션에서 배아의 방향을주의하십시오. 따라서,주의 adjustmen하여이 위치에 배아를 유지모세관 바늘 TS. 주 : 필요한 경우, 여러 개의 배아이 시점에서 장착 접시에 첨가 될 수있다. 이 경우, 제 접시로 오스가 낮은 용융 전송하고 아가 드롭의 중심 배아를 추가한다. 그리고, 유리 링의 에지에 배아를 밀어 원하는 위치로 배향. 여섯 배아까지 아가로 오스가 응고되기 전에이 방법을 장착 할 수 있습니다. </li></ol> 후방 몸 주위 초과 아가로 오스 3. 제거 참고 :이 섹션은 아가로 오스는 후방 본체 주변 지역에서 제거하는 절차를 설명합니다. 후방 바디 연신의 경우에는 꼬리 성장 아웃 할 수있는 일반적으로 보장하는 것이 중요하다. 배아 완전히 아가가 포함 된 후, 아가 로스를 제거하여, 배아는 헤드 영역과 난황의 약 절반으로 둘러싸인 남겨진다. <ol><li> 아가 강하가 설정되면, 페트리 디 홍수Tricaine 작업 솔루션을 쉬. </li><li> 전송 된 광 염기 쌍안 해부 현미경 하에서 강한 콘트라스트가 동작을 명확하게 볼 수 아가 로스의 절단이 가능하도록 상기 미러 위치 및 입사광의 각도를 조정한다. </li><li> 절단 실행 1 (도 1) 바로 체절 (5) (5 차의 위치에 형성 심장 필드 후부 위치에서 난황 따라 아가 중도 절단 모세관 바늘 또는 마이크로 메스를 사용 전방 체절). </li><li> 그림과 같이 형성 마음에 인접한 초기 절단, 유리에 아가로 오스를 통해 전체 방법을 시작합니다. </li><li> 최대보고 그림 1과 같이 배 이상 긴 절단을 시작하면서 아래로 천천히 깊은 아가로 오스 내에서 모세관 또는 마이크로 메스를 유지하고. 배아 또는 노른자를 천공하지 않고 가능한 한 배아에 가깝게 잘라. </li><li> 다음에, 절단하게 2, 3 (도 1 </strong&gt;), 배아에 대한 위치에서 유리에 이르기까지 모든 방법을가는 컷으로 시작은 접시를 바닥. 이 제 5 somites 접선되도록 후방 본체의 전개 전체 dorsalward 허용 2 절단 만든다. 노른자면과 90 ° 각도로 삼을 잘라 HEARTFIELD에서 시작합니다. 주 : 완전한 블록 (단계 3.6)로 오스를 제거하는 에이즈 (도 1에 도시 된 바와 같이) 유리 원형의 가장자리까지 아가로 오스를 절단. 그러나, 이것은 필요하지 않다. </li><li> 인하 1과 3의 교차점에서 시작, 천천히 후방 몸을 둘러싼 아가로 오스의 제곱을 제거하기 위해 위쪽으로 들어 올리는 동안 컷 2의 끝으로 천천히 대각선 컷을합니다. 주 : 일부 경우에, 이것은 하나의 블록에 출시되고 동작이 한 번에 완료된다. 다른 사람에서는 DIS-별장에 배아를 둘러싼 모든 아가로 오스를 여러 번 시도해야 할 수 있습니다. </li><li> 날카로운 집게 한 쌍으로, 빠질 B를 제거배아 매체로부터 아가로 오스의 잠금. 이 과정에 도움 접시 측으로 아가 로스 편을 이동시키고, 아가 로스 편을 들어 올리는 동안 지지체로서 배양 접시의 벽을 사용한다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> 그림 1 : 설치 셋업의 다이어그램. (A) 다이어그램은 페트리 접시의 중앙 유리 링 내에 장착 된 배아의 위치를 나타낸다. 오른쪽에있는이 아가로 오스 dottted 빨간 선으로 표시 둘러싸을 통해 각각의 연속 컷 배아의 확대이다. (B)이 탑재 된 배아는 모두 반전 직립 목표에 대한 접근 용이성을 표시하는 측면도에 도시된다. (C) 배아가 수직 광 시트 영상 셋업 마운트 될 수있는 방법을 보여주는 유사한 digram. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">카스티하세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK. <ol start="9"><li> 근육 경련이 완전히 그 시점에서 차단되지 않은 경우, 4 ㎎ / ㎖, pH가 7의 원액에서 Tricaine 방울을 추가합니다. </li></ol> 4. 수직 빛 시트 현미경을위한 배아의 설치 참고 :이 그 위에서 설명한 방법에 변화가 수직 지향 SPIM에 의해 시료의 이미징을위한 여러 목적의 접근을 허용합니다. 이 변화의 뒤에 아이디어는이 영상 목표를 쉽게 액세스 할 수 있도록, 접시의 바닥보다 약간 높은 샘플을 들어 올릴 것입니다. <ol><li> 장착 샘플 전에 코트 5mm의 높이 E3 배지에서 1 % 아가로 오스와 100mm 플라스틱 페트리 접시에 세트 할 수있다. </li><li> 접시의 중앙에 1 ml의 저 융점 아가 방울을 배치하고 설정할 수. </li><li> 그러나 2 항에서와 같은 저 융점 아가로 오스에 포함 된 배아는, 이번에는 50 ㎖ 튜브에서 배아를 제거의 아가로 오스 용액 (0.5 ㎖)의 작은 방울과 접시의 중앙에 떨어 ㎖로 1 위에이 작은 방울을 배치합니다. </li><li> 작은 방울의 중심 배아를 배치하고 겔이 설정 될 때까지의 올바른 방향을 유지하기 위해 모세관 바늘을 사용한다. </li><li> Tricaine 작업 용액으로 요리 홍수와 섹션 3에서와 같이하지만, 1 % 표준 아가로 오스의 쿠션을 통해 절단하지 않고 초과 아가로 오스를 제거합니다. </li></ol>

<ol><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li>
<li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li>
<li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li>
<li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li>
<li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li>
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<li>Schröter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li>
<li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li>
</ol>

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이 실장 기술은 배아가 현미경 및 여러 길이 스케일에서 후방 신체 신장을 다음 목표로 이상 장기 시간 경과 이미징 실험에 전송하는 동안 계속 유지 될 수 있습니다. 이 모두 수직 및 반전 현미경 셋업에서 촬상이 가능하고,이 제안은 상기 수직 배향 SPIM에 적응 될 수있는 방법에 대해 이루어지는 것을 또한, 다목적. 이 프로토콜의 중요한 단계는이 구조의 정상적인 개발을 허용하는 것이 중요하다 후방 몸을 둘러싼 과잉 아가로 오스의주의 제거하는 것이다. 노른자의 상단 주위에 아가로 오스를 제거 특히, 배아를 손상하지 여기에주의를 기울여야하는 것이 중요하다. 때때로,이 프로세스 중에 몰드로부터 배아를 잃을 수도로서 배아 주위에서 절단 아가 블록을 분리 할 때뿐만 아니라,주의를 기울여야한다. 이러한 이유로, 이것은 낮은 처리량 방법 그쪽은t는 달리 이미 3D 인쇄 플라스틱 금형을 이용하는 방법을 발행하는 동시에 많은 제브라 피쉬 배아의 장착에는 적합하지 않다. <sup class="...

후방 바디 신장 배아 몸 축 큰 부분을 형성하기 위해 연장되는 배아 발달에 필수적인 과정이다. 이는 다중 셀 동작 개별 조직의 형태 형성 수준을 생성하는 역할을 배위하는 복잡한 형태 형성 공정의 일례이다. 이러한 차동 조직 변형은 전체 구조 수준에서 후방 본체의 신장을 생성하도록 함께 작용한다. 이러한 프로세스 제어 및 개발 과정에서 조정하는 방법을 이해하려면, 우리는 (분자, 세포, 세포 집단과 조직의 수준에서 즉) 여러 규모에서 이러한 프로세스를 수행 할 수 있어야하고, 전체 구조의 형태 형성에 직접 연관에 . 자신의 광학 투명성과 작은 크기는 최소 침습 광 이미징의 응용 프로그램에 대해 허용하는 제브라 피쉬 배아는 거실에 적합 접근 이미징 후방 신체 신장에 이상적입니다전자 영상. 한 이것은 분자 레벨에서 후방 본체 개발을 밝혀왔다 최근 공보의 시리즈에 의해 입증 된 2 단 전지 4뿐만 아니라 세포 집단 및 전체 기관의 수준에서 3 간 조직 행동. (5) 이러한 공 초점, 다 광자 현미경 선택적 평면 조명 현미경 (SPIM)와 같은 고급 이미징 기술은 광 독성 광 표백 효과의 감소와 개발 프로세스의 장기 영상을 가능하게한다. 실제 샘플의 장착을위한 견고한 방법이 세 가지 목표를 달성하기 위해 필요하다 : 1) 충분한지지가 현미경 및 수집 동안 전송하는 동안 올바른 방향으로 샘플을 유지하기 위해, 2) 샘플의 이동 충분한 자유의 생장을 허용하는 정상 (STABLE)에 영향을주지 않고 후방 바디 영역opment, 그리고 마지막으로 3) 장착 방법의 다양성에 어느 정도의 다양한 영상 셋업에 영상을 허용합니다. 이 프로토콜은 제브라 D. 레 리오의 개발을 이미징 실장 기술을 소개한다. 이 기술은 일반적으로 신장 및 개발 후방 바디 영역을 남기면서 머리와 난황 낭 영역이 거의 아가 로스에 포함되도록 배아 장착 포함한다. 이와 같이,도 아가 표준 광 이미징 기술에 의해 촬상 가능으로 현상 신체의 다른 영역의 장기 촬상에 적합한 방법이다. 이 바꾸는 방향에서 배아를 탑재하는 것도 가능하지만,이 프로토콜은, 횡 방향으로 배아의 장착을 보여줍니다. 그것은 또한, 수직 반전 및 수직 빛 시트 현미경 설정하는 방법을 적용하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>CONSUMABLES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35mm 페트리 접시, 10mm 마이크로웰. No. 1.5 커버 유리</td></tr><tr><td>주사 바늘용 모세 혈관</td><td>&nbsp; 셔터&nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>우리는 필라멘트, OD 1.20mm, ID 0.94mm, 길이 10cm의 오로실리케이트 유리를 사용합니다. 그러나 필라멘트 바늘은 필요하지 않으며 대부분의 주입 표준 바늘이 작동해야 합니다.</td></tr><tr><td>마이크로 메스</td><td>페더</td><td>P-715</td><td>플라스틱 손잡이가 있는 마이크로 페더 일회용 안구 메</td></tr>스 <tr><td>파스퇴르 피펫</td><td></td><td></td><td>230mm 길이</td></tr><tr><td><강력한>시약</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리카인</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>< 강력한>장비</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세밀한 집게&nbsp;</td><td>파인 사이언스 툴 GMBH&nbsp;</td><td>11252-30&nbsp;</td><td>뒤몽 #5</td></tr><tr><td>바늘 풀러&nbsp;</td><td>셔터&nbsp;</td><td>P97</td><td>가열 필라멘트 바늘 끌어당기는 기계</td></tr><tr><td>쌍안 해부 현미경</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

제브라 피쉬 배아 인해 접근성과 광 투과성의 용이성 복잡한 형태 형성 과정을 연구 할 수있는 이상적인 실험 시스템을 제공합니다. 특히, 후방 본체 신도 여러 조직 변형 몸 축의 큰 부분의 형성을 유도하기 위해 함께 작용하는 배아 발달에 필수적인 과정이다. 장기간 시간 경과 화상이 과정을 관찰하기 위해 충분한 지원 현미경 및 취득을 전송하는 동안 올바른 방향으로 샘플을 유지할 수있게 장착 기술을 활용하는 것이 필요하다. 또한, 장착은 정상적인 발달에 영향을주지 않고 후방 바디 영역의 생장에 대한 충분한 이동 자유를 제공한다. 마지막으로, 다양한 영상 셋업에 영상을 수 있도록 장착 방법의 다양성에 어느 정도가 있어야합니다. 여기서, 우리는 후방 바디 elongatio 개발을 이미징 실장 기술을 제시n은 제브라 피쉬 D. 레 리오한다. 이 기술은 일반적으로 신장 및 개발 후방 바디 영역을 남기면서, 헤드 및 난황 낭 영역이 거의 아가에 포함되도록 배아 장착 포함한다. 우리는이 똑바로 반전 및 수직 빛 시트 현미경 셋업에 대해 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 후방 몸 이미징을위한 배아를 장착에 초점을 맞추고 있지만, 쉽게 제브라 피쉬 개발의 여러 측면의 라이브 영상에 대해 적용 할 수 있습니다.

위에서 설명한 프로토콜은 장기간의 시간 경과 이미징을위한 제브라 피쉬 배아의 장착을위한 다양한 방법을 자세히 설명합니다. 이것의 예는도 2a 및 / 비디오 애니메이션도 1에 도시된다. 배아는 mRNA의이 photoconvertible 형광 단백질 kikumeGR을 인코딩으로 1 세포 단계에서 주입 하였다. 10 배 목표와 거꾸로 공 초점 현미경에 상술 한 바와 12 시간 동안 몇 군데로 15 체절 단계에서 그들은 장착되었다. 도시 된 바와 같이 생성 된 촛점 스택이 최대로 표시 될 것으로 예상되었다. 이 영화는 분명히 후방 본체 무비의 지속 시간에 걸쳐 자유롭게 이동시키고, 정상 배양 조건에서 자유롭게 융모막의 개발을 허용 배아에서 본 형태의 유사한 변화를 보여준다 것을 보여준다. 추가적인 예 F의 ...

여기에서는 정상적인 발달을 방해하지 않고 살아있는 제브라피시 배아의 후체 발달을 장기간 타임 랩스 이미징할 수 있는 다목적 장착 방법을 제시합니다.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

이 방법의 전반적인 목표는 제브라피시 배아를 라이브 이미징을 위해 고정하여 후방 신체 영역의 정상적인 성장을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 발달 중인 제브라피시의 다른 영역을 이미징하는 데에도 적용할 수 있습니다. 본 기술은 개별 세포의 행동이 어떻게 전체 조직 수준의 형태 형성을 유도하는지와 같은 발생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다.이 기술의 주요 장점은 배아를 올바른 방향으로 유지하면서 후방 체절의 자유로운 움직임을 가능하게 한다는 점입니다. 우선, 50밀리리터 튜브에 담긴 E3 배지에 최종 농도가 1.5%가 되도록 저융점 아가로스를 첨가하고, 전자레인지로 가열하여 아가로스를 용해합니다. 해당 용액을 항온수조 또는 벤치탑 인큐베이터에서 42~45도로 평형화하십시오.텍스트 프로토콜에 따라 유리 니들을 제작합니다. 핀셋을 사용하여 니들이 굴곡지는 지점 바로 윗부분을 부러뜨려, 배아의 방향을 잡거나 과잉 아가로스를 제거하는 데 사용할 수 있도록 깨끗하고 날카로운 니들을 만듭니다. E3 배지에서 배아를 적절한 단계까지 성장시킵니다.그 다음, 실체 현미경 하에서 날카로운 핀셋을 사용하여 배아의 난막을 제거합니다. 난막이 제거된 배아를 트리카인(tricaine) 작업 용액에서 최소 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 난막이 제거된 배아를 최소량의 E3 용액과 함께 45 °C 아가로스(agarose)가 담긴 50 mL 튜브로 직접 옮깁니다.약 1mL의 마운팅 아가로스와 함께 배아를 제거한 후, 배아가 포함된 배지 약 100µL를 35mm 유리 바닥 페트리 접시 바닥에 있는 10mm 마이크로웰 중앙으로 옮깁니다. 마운팅 배지가 굳어짐에 따라, 꼬리가 바깥쪽을 향하도록 배아를 아가로스 원의 가장자리로 이동시킵니다. 모세관 바늘을 사용하여 배아를 최대한 측면으로 정렬하여 후신체 발달 과정을 촬영합니다.그 다음 모세관을 사용하여 겔이 완전히 굳을 때까지 배아를 원하는 측면 방향으로 유지합니다. 아가로스 방울이 굳으면, 트리케인(tricaine) 작동 용액을 사용하여 페트리 접시를 가득 채웁니다. 그런 다음, 투과광 베이스가 장착된 해부 현미경 아래에서 거울의 위치와 입사광의 각도를 조절하여, 강한 대비를 통해 아가로스의 절단 부위가 명확하게 보이도록 합니다.첫 번째 절개를 수행하려면, 모세관 바늘이나 마이크로 메스를 사용하여 난황의 인접한 중간 지점, 형성 중인 심장 영역 바로

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

이 기사에서는 장기 이미징을 위해 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비용 효율적이며 도립 현미경에서 이미징하기 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 서로 다른 농도의 아가로스 층에서 수행됩니다.

Layered Agar Mounting: 도립 현미경을 사용한 장기 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 준비

이 비디오는 저융점 아가로스를 사용하여 6웰 플레이트에 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대한 단계별 지침을 설명합니다. 또한 살아있는 배아의 이미지를 획득하고 소프트웨어를 사용하여 분석하는 프로세스를 제공합니다.

한천 장착(Agar Mounting): 장기 이미징을 위해 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 기본 방법

제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치)는 compartmentalized 장치 방향 및 zebrafish 애벌레를 억제 하도록 설계 되었습니다. 디자인 꼬리 transection 및 상처 치유와 재생의 고해상도 형광 현미경 이미지의 장기 수집을 허용합니다.

Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치

이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

배우세요 제브라피시 배아의 후방 신체 발달을 위한 장기 실시간 이미징 기법을 Danio rerio에서. 이 방법은 정상적인 발달을 유지하면서 세포 행동을 관찰하여 발생생물학 연구에 유용합니다.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

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