Name: G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 배우세요 세포 주기별 유세포 분류와 고처리량 시퀀싱을 결합한 G2-seq 기법으로 게놈의 늦은 복제 영역을 식별하는 방법을. 이 기술은 DNA 복제 역학과 게놈 안정성 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품 A.B. 부여 NIH GM117446에 의해 지원 되었다

1. 셀에 대 한 준비 흐름 Cytometry 정렬
<ol><li>15 mL 문화 하룻밤 성장 후 1.5 mL 당 107 셀 x 5 x 106 의 밀도 도달 되도록 각 YEPD 국물의 8 mL를 포함 하는 시험관에 접종 (참조 토론 참고 1).</li>
	<li>효 모 세포 (1400 x g, 실 온 또는 4 ° C에서) 5 분에 대 한 15 mL 스크류 캡 원심 관에 다운 스핀, 1.5 mL 70% 에탄올, 실 온에서 1 h 또는 얼음 (에 적어도 3 h이이 앉아 시키는 1.6 mL microfuge 관에 전송 셀 resuspend 4 ° C에서 무기한 저장할 수) (토론 포인트 (2) 참조).</li>
	<li>1 분 동안 microfuge (14000 x g, 4 ° C)에서 효 모 세포를 스핀, 1 분 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2, 스핀 (14000 x g, 4 ° C) 아래에 resuspend, 상쾌한 발음, 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2에서 resuspend 0.25 mg/mL 1 시간 또는 밤새 껏 열 블록 또는 물 목욕에서 37 ° C에서 50 ° C에서 RNAse 솔루션 포함.</li>
	<li>50 µ L 성분을 K 솔루션 (20 mg/mL 10 mM Tris pH 7.5, 2mm CaCl2, 볼륨 글리세롤을 50% 무게에에서 resuspended)를 추가 하 고 50 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어</li>
	<li>셀 (14000 x g, 4 ° C) 다운 스핀, 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2 셀 resuspend, 스핀 다운 (14000 x g, 4 ° C), 진공 상쾌한 발음, 1 mL 1 µ M 녹색 핵 산 피로 50 m m 나트륨 구 연산 염에 resuspended resuspend pH 7.2 및 실 온에서 1 h에 대 한 어둠 속에서 품 어, 2 x 2를 sonicate s 각 (출력 2 와트).</li>
</ol>2. 셀 정렬
<ol><li>그림 1 과 같이 각 세포 주기 단계에서 적어도 1.6 백만 단일 세포를 수집 단계로 G1, S, "초기 g 2는,"와 "늦은 g 2", DNA 내용에 따라 셀 정렬 셀 정렬을 사용 하 여 (토론 포인트 (3) 참조).</li>
	<li>Microfuge 관으로 셀을 전송 하 고 14000 x g는 microfuge에서 4 ° C에 20 분에 대 한 셀 아래로 회전 진공 상쾌한 발음 (-20 ° C에서 무기한 동결 펠 릿을 저장할 수 있습니다; 토론 포인트 (4) 참조).</li>
</ol>3. DNA 추출 및 라이브러리 시퀀싱의 준비
참고: 다음 단계는에 따라 "의정서 I" 효 모 게놈 DNA 추출 키트에에서 ( 재료의 표참조).
<ol><li>"소화 버퍼," 독점 수 있는 버퍼를 효 모 세포 벽, 그리고 효 모 용균성 효소의 5 µ L를 소화, vortexing에 의해 resuspend 및 40-60 분 동안 37 ° C에서 품 어 용균성 효소의 120 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>"세포의 용 해 버퍼," 세제, 그리고 10-20 s 하드 소용돌이 포함 하는 독점 버퍼의 120 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>250 µ L 클로 프롬을 추가-믹스 철저 하 게 1 분.</li>
	<li>2 분 동안 microfuge에서 최대 속도로 회전 합니다.</li>
	<li>DNA 바인딩 열과 1 분 대는 microfuge 최대 속도에서 분리기에 상쾌한 로드.</li>
	<li>"DNA 세척 버퍼," 에탄올, 그리고는 microfuge 최대 속도에서 1 분 동안 원심 분리기를 포함 하는 독점 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다. 흐름을 통해 삭제, DNA 워시 버퍼의 300 µ L을 추가 하 고 세척 과정을 반복.</li>
	<li>신선한 microfuge 관 스핀 열 전송, 물 (안 테)의 60 µ L-1-3 분을 기다릴 더하고 다음 10 원심 elute DNA를 s.</li>
	<li>DNA의 5 µ L dsDNA 높은 감도 버퍼에 희석된 1: 200 그리고 교정;에 대 한 제공 된 표준의 10 µ L를 사용 하는 fluorometer에서 측정 형광 되었습니다 dsDNA 높은 감도 시 약의 195 µ L을 추가 하 여 농도 측정 DNA의 총 10, 50 ng 사이 기대 합니다.</li>
	<li>Sonicate (피크 사건 전력 450, 듀티 계수 30%, 버스트 200, 치료 시간 60 s, 물 레벨 6 초당 사이클) 250-350 bp 파편으로 DNA 헤어.</li>
	<li>DNA 샘플 준비 키트를 사용 하 여 라이브러리를 준비 하 고 빠른 모드에서 DNA 시퀀싱 장비에서 그것은 (적어도 10 백만 50 bp 일자형 읽기)을 시퀀싱 (토론 참고 (5) 참조).</li>
</ol>4. 분석 데이터와 복제의 세대 시퀀싱의 프로필
<ol><li>Saccharomyces cerevisiae sacCer3 게놈 Gsnap12 를 사용 하 여 시퀀스를 정렬 (토론 참고 (6) 참조).</li>
	<li>자료 당 쌍 읽기 Bedtools' "genomeCoverageBed" 소프트웨어13를 사용 하 여 깊이 결정 합니다.</li>
	<li>있는 경우 읽기 깊이에서 artefactual 스파이크를 제거 (토론 참고 (7) 참조).</li>
	<li>부드럽게 읽을 깊이 염색체 R에서 "runMean" 기능을 사용 하 여 창 슬라이딩 20 kb에서 중앙값을 사용 하 여 패키지 "caTools" (토론 참고 (8) 참조).</li>
	<li>플롯 (토론 참고 (9) 참조) 완전히 복제 된 읽기 깊이의 S 단계, 초기 g 2는, 늦은 g 2에 있는 깊이 읽기.</li>
</ol>

<ol><li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li>
<li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replication+fork+barrier+at+the+3%27+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li>
<li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li>
<li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li>
<li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li>
<li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li>
<li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+fragile+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li>
<li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li>
<li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li>
<li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li>
<li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment%3A+Enhancements+to+Speed%2C+Accuracy%2C+and+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 기술은 강력 하 고 비교적 똑 바른 동안 앞으로, 특정 주의 다음에 전념 한다.
(1) 문화 차이 매니페스트 세포 주기 배포판에 문화는 접종 후 원하는 밀도 그냥 4 h를 도달 하는 데 후 수확 하는 경우 이후 로그 단계를 도달 하기 전에 적어도 12 h에 대 한 성장 좋습니다. 우리의 가정은 세포 주기 분포는 비교적 안정 된 평형에 도달 했습니다 더 나타내는 "진짜" 로그 단계 배포는 아직 유출 때 포화 문화 양도 되었습니다 최근 신선한 매체 배포 보다.
(2) 고정 하기 전에 셀 아래로 회전의 대신 세포 또한 직접 에탄올의 최종 농도 70% 효 모 문화를 100% 에탄올을 추가 하 여 해결할 수 있습니다. 세포 합성 또는 풍부한 (YEPD) 매체에 성장 될 수 있다.
(3) 세포 주기 단계 530 nm 방출 영역의 기능으로 플로팅 휴대 번호로 정렬에 대 한 시각화 됩니다. ...

진 핵 게놈 복제 복제, 복제에서 포크 (Fragkos 그 외 여러분, 20151에서 검토) 두 방향에서 진행의 기원 이라고 하는 여러 개별 사이트에서 시작 됩니다. 기원 그들의 타이밍 및 발사의 효율성에서 변화 하 고 몇 가지 기술을 복제 원점 활동을 모니터링 하 고이 변화의 원인 명료 하도록 개발 되었습니다. 개별 근원의 활동의 단일 가닥 DNA2, 활성 기원, 주위는 양식 수준에서 추정 될 수 있다 또는 특정 복제 중간체3모니터를 2 차원 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 둘 다로 검출 될 수 있다 방사성 조사 합니다. 이러한 기술을 모두 기원 전에 특정 알려진된 시퀀스에 제한 때문에 더 쉽게 S. cerevisiae 보다 포유류 세포에 적용 됩니다. Microarrays의 도래와 함께 세계적으로 발사 하는 근원 평가 수 되었다. 이 하 여 무거운 동위 원소와 DNA 라벨, 셀 g 1 블록에서 중간 포함 가벼운 동위 원소에 다음 무거운-가벼운 하이브리드 DNA 게놈4에 걸쳐 형성 모니터링 처음 이루어졌다. 높은 처리량 시퀀싱의 소개 허용 비슷한 게놈 넓은 비싼 동위 원소 라벨의 요구 없이 원산지 활동의 모니터링. 세포는 DNA 내용에 따라 교류 cytometer 및 깊은 시퀀싱을 복종 하는 그들의 DNA에 정렬 했다. 시퀀스 범위 S 단계에 걸쳐 2 x 1 x에서 진행, 때문에 상대 복제 타이밍 G1 또는 g 25,6에 S 단계에 있는 세포의 읽기 깊이 비교 하 여 평가 될 수 있습니다. 특히 효 모에 적용 되는 이러한 기술을 어떻게 DNA 순서, chromatin 구조, 그리고 DNA 복제 단백질 근원 타이밍 및 효율성 규제에 대 한 깊은 이해로 이끌어 냈다.
세포질 확산 중 유전 정보의 충실 한 전송 기원에 이루어지는 DNA 복제의 성공 뿐만 아니라 개시 뿐만 아니라 발생 하는 복제 포크 만나는 복제 성공적으로 완료 해야 합니다. 복제의 개시, 같은 복제의 완료의 타이밍 남은 세포 주기에서 늦게도 복제 되지 않은 특정 지역으로 게놈에 걸쳐 다릅니다. 이러한 지역 특히 활성 복제 기원에서 멀리 떨어져 있을 수 있습니다 또는 시퀀스 또는 DNA polymerases를 방해 하는 염색 질 구조를 포함할 수 있습니다. 늦게 영역 복제 염색체 파손 및 높은 돌연변이 속도와 연결 하 고 암과 노화7,,89에 연루 되어 연약한 사이트로 자신을 나타날 수 있습니다. 그러나, 게놈 안정성의 유지 보수에 DNA 복제의 적절 한 완료의 중요성에도 불구 하 고이 일어난 어디서 및 어떻게의 우리의 이해는 복제 개시의 뒤에 멀리 느껴 지. 그리고 개별 유전자의 늦은 복제 질병과 연관 되었습니다 동안 연구 함께, 예를 들어 정량10, 글로벌 연구 elucidating 위치 및 기본 복제는 부족의 원인에서 감독. 여기는 우리가 "G2 seq"는 우리가 결합 cytometry에 게놈 복제의 완료에 빛을 발산 하는 높은 처리량 시퀀싱으로 효 모11을 참조 하는 기술에 설명 합니다. 사소한 변경,이 프로토콜 흐름 DNA 내용에 따라 정렬 될 수 있는 모든 셀에 적응 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>YeaStar 게놈 DNA 키트</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &마이크로; M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td>은 <td>50mM 구연산 나트륨, pH 7.2</td></tr><tr><td>50mM 구연산 나트륨, pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase 용액 (0.25 mg / mL)</td><td>에</td> 재현탁 Sigma <td>R6513</td><td>0.25 mg / mL RNaseA를 50 mM 구연산 나트륨, pH 7.2에 재현탁시키고 RNase 용액을 처음 사용하기 전에 10 분 동안 끓이고 그 다음에는 -20 °C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>proteinase K 용액 (20 mg / mL)</td> <td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50 % 글리세롤에 재현탁, -20 °C에 보관; C</td></tr><tr><td>모델 50 음파 분석기</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-spin III 컬럼</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 분석 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 형광측정기</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris 모델 LE220 집속-초음파기</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT 샘플 준비 키트</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 기기</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td></td></tr><tr><td>gsnap 정렬 소프트웨어</td><td>오픈 소스 소프트웨어 / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

DNA 복제는 세포 주기의 S 단계의 진행에 따라 수많은 기술 개발 되었습니다. 이러한 기술의 대부분의 위치 및 게놈 중복 보다는 그것의 완료의 개시의 타이밍으로 지시 되어 있다. 그러나, 그것은 우리가이 지역 돌연변이, 염색체 파손의 높은 수준의 고통 때문에 마지막 복제를 완료 하는 게놈의 지구를 이해 하 고 그들은 질병과 노화와 연관 된 중요 한. 여기 우리는 어떻게 우리가 대신 마지막 완전 한 복제에 게놈의 그 영역을 식별에 복제 개시를 모니터링 하는 데 사용 된 기술 확장을 설명 합니다. 이 방법은 cytometry 및 높은 처리량 시퀀싱의 조합을 기반으로 합니다. 이 보고서에서는 효 모에이 기술 적용, 접근 교류 cytometer DNA 내용에 따라 정렬 될 수 있는 모든 세포와 함께 사용할 수 있습니다.

싹 트는 효 모에 늦게 복제 사이트 식별 위에서 설명한 절차를 사용 했습니다. 테스트는 인공 염색체에 알려진된 늦은 복제 영역을 사용 하 여이 이렇게 정확 하 고 신뢰할 수 있는 기술을 입증 했다. 우리의 결과 또한 시연 복제의 적시 완료의 생물학 중요성 우리가 우리의 G2-seq 결과 근거 하 여 늦은 복제로 식별, 염색체 7에 늦게 복제 영역 손실 되었음을 표시 하 여 약 three-fold는 유사한 보다는 더 빈번 하 게 지역11제어 합니다.
G2-seq와 결과의 특정 한 예는 그림 2에 표시 됩니다. 우리 했다 가설을 거기 것 이다 특히 늦은 세포 복제 게놈의 지역 부족 단백질 deacetylase Sir2 라는. 그림 2A...

Cytometry 및 높은 처리량 연속 게놈 늦게 복제 영역을 식별 하는 기술을 설명 합니다.

G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

세포 주기 단계에 따라 유세포 분석으로 분리된 세포의 DNA를 심층 시퀀싱하는 이 절차의 전반적인 목표는 세포 주기에서 매우 늦게 복제되는 게놈 영역을 식별하는 것입니다. 이 방법은 게놈의 어느 영역이 DNA 복제를 완료하는 데 어려움이 있으며, 그 결과 게놈 재배열에 특히 취약한지와 같은 DNA 복제 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실험적 관점에서는 매우 간단하지만, 게놈 복제 역학에 대해 놀라울 정도로 풍부한 시각을 제공한다는 점입니다.먼저, 8 mL의 YEPD가 들어 있는 15 mL 시험관에 분석 대상 효모 세포를 접종합니다. 합성 배지 또는 풍부 배지 모두 사용 가능합니다. 세포가 실제 로그 성장기 분포 단계에 있을 때 수집할 수 있도록 최소 12시간 동안 밤새 배양합니다.다음 날 배양액의 밀도가 ml당 500만에서 1,500만 개 세포에 도달하면, 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후 1.5 ml의 70% ethanol에 재현탁합니다. 그런 다음 현탁액을 1.6 ml 마이크로 튜브로 옮겨 실온에서 1시간 동안 또는 얼음 위에서 최소 3시간 동안 세포를 배양합니다. 접종 후, 세포를 원심 분리하여 가라앉히고 1 ml의 sodium citrate에 재현탁합니다.마지막으로, 세포를 짧게 두 번 초음파 처리합니다. 그 다음 원심분리 사이클을 반복하고 RNase가 포함된 1 mL의 시트르산나트륨에 효모를 재현탁합니다. 히트 블록이나 항온 수조를 사용하여 50 °C에서 1시간 동안, 또는 37 °C에서 하룻밤 동안 RNase가 효모와 반응하도록 둡니다.RNase 처리 후, 혼합물에 50 µL의 proteinase K 용액을 첨가하고 50 °C에서 1시간 동안 반응을 지속합니다. 그런 다음 세포를 원심 분리하여 가라앉히고, 1 mL의 sodium citrate에 세포를 재현탁합니다. 이어서 세포를 원심 분리하고 진공 장치를 사용하여 상층액을 흡입 제거합니다.그런 다음 어두운 조명 아래에서 녹색 핵산 염색제가 포함된 1 mL의 sodium citrate에 세포를 재현탁합니다. 이제 효모를 실온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다. 계속해서 530 nm 방출 데이터를 이용해 세포 분석기(cell sorter)로 세포 수를 측정합니다.DNA 함량에 따라 세포 주기 단계인 G1, S, 초기 G2 및 후기 G2로 분류하십시오. 각 단계에서 최소 1.6 million개의 반수체 세포를 수집하십시오. 세포 분류 직후, 20분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 흡입하여 제거하고, 펠렛을 -20 °C에서 동결하여 보관하십시오.본 절차에서 가장 결정적인 단계는 세포 수집 후, 특히 분리 후 최대 1시간 이내에 신속하게 세포를 원심 분리하여 침전시키는 것임을 확인하였습니다. 이 추출법은 효모 게놈 DNA 추출 키트를 기반으로 합니다. 먼저 120 µL의 소화 완충액(digestion buffer)과 5 µL의 효모 용해 효소(yeast lytic enzyme)를 첨가하며 시작하십시오.그 다음, 볼텍서를 사용하여 세포를 반응 혼합물에 섞고, 혼합물을 37 °C에서 40~60분 동안 배양합니다. 이어서, 120 µL의 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가하고 고속으로 10~20초 동안 볼텍싱합니다. 그런 다음, 250 µL의 클로로포름을 첨가하고 1분 동안 튜브의 내용물을 충분히 혼합합니다.다음으로, 튜브를 최대 속도로 2분 동안 원심 분리합니다. 그 후 상층액을 DNA 결합 컬럼으로 옮깁니다. 1분간 최대 속도로 원심 분리하여 상층액을 컬럼으로 통과시킵니다.컬럼 막에 있는 DNA를 세척하려면, 컬럼을 새로운 수집 튜브로 옮기고 300 µL의 DNA 세척 버퍼를 가합니다. 그런 다음 최대 속도로 1분 동안 원심분리를 반복합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.DNA를 수집하려면 스핀 컬럼을 새 튜브로 옮깁니다. 60 µL의 물을 넣고 1~3분 동안 기다립니다. 그런 다음 컬럼을 최대 속도로 10초 동안 원심 분리하여 용출된 DNA가 포함된 물을 분리합니다.이제 1:200 농도로 희석된 시약이 포함된 5~195 µL의 이중 가닥 DNA 고감도 버퍼를 추가합니다. 그다음 시료의 형광을 측정하여 수율을 계산합니다. 10~50 ng의 DNA를 회수할 수 있을 것으로 예상됩니다.이제 초음파 분쇄(sonication)를 사용하여 DNA를 250에서 350 base pairs 사이의 조각으로 분쇄합니다. 그 후 표준 키트를 사용하여 DNA 라이브러리를 제작하고, 최소 1,000만 개의 50 base pairs single-end read로 시퀀싱을 수행합니다. 설명된 절차는 출아 효모의 후기 복제 부위를 식별하는 데 사용되었습니다.정상 세포를 탈아세틸화 효소 단백질인 Sir2가 결여된 세포와 비교하였습니다. 원시 데이터에는 주로 TY 요소의 존재로 인해 큰 스파이크가 포함되어 있었습니다. 이러한 스파이크는 각 샘플의 중앙값 리드 깊이의 2.5배로 리드 깊이를 제한함으로써 제거하였습니다.스파이크가 제거된 데이터는 20 kb 슬라이딩 윈도우를 사용하여 평활화되었습니다. 마지막으로, 데이터를 정규화하고 G1 수준에 대한 비율로 도식화했습니다. 완전히 복제되지 않은 세포는 0.5에 나타나고, 완전히 복제된 세포는 1에 나타납니다. 7번 염색체에서 얻은 이 데이터에서 Sir2 돌연변이체의 알려진 후기 복제 영역의 증거가 확인되었습니다.이 영상을 시청한 후, DNA 복제가 가장 마지막에 완료되는 게놈 영역을 식별하는 방법과, 따라서 후기 복제와 관련된 DNA 단절 및 기타 문제에 특히 취약한 영역을 확인하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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배우세요 세포 주기별 유세포 분류와 고처리량 시퀀싱을 결합한 G2-seq 기법으로 게놈의 늦은 복제 영역을 식별하는 방법을. 이 기술은 DNA 복제 역학과 게놈 안정성 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

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