G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

세포주기 단계에 따라 유동 분류된 세포에서 DNA를 심층 염기서열분석하기 위한 이 절차의 전반적인 목표는 세포주기에서 매우 늦게 복제되는 게놈 영역을 식별하는 것입니다. 이 방법은 DNA 복제를 완료하는 데 문제가 있는 게놈의 영역과 같은 DNA 복제 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으므로 게놈 재배열에 특히 취약합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 실험적 관점에서는 매우 간단하지만 게놈 복제의 역학에 대한 놀라울 정도로 풍부한 관점을 제공한다는 것입니다.

먼저 8ml의 YEPD가 포함된 15ml 시험관에 관심 효모 세포를 접종합니다. 합성 또는 풍부한 매체가 허용됩니다. 실제 로그 단계 분포 동안 세포를 수집하기 위해 최소 12시간 동안 밤새 세포를 배양합니다.

다음 날 배양액이 밀리리터당 5-1,500만 개의 세포 밀도에 도달하면, 세포를 스핀다운하고 1.5밀리리터의 70% 에탄올로 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 현탁액을 1.6ml 마이크로분리 튜브로 옮기고 세포를 실온에서 한 시간 동안 또는 얼음 위에서 최소 3시간 동안 배양합니다. 접종 후, 세포를 스핀다운하고 1ml의 시트르산나트륨에 재현탁시킵니다.

마지막으로, 세포를 두 번 짧게 초음파 처리합니다. 그런 다음 원심분리 주기를 반복하고 RNase를 함유한 1ml의 시트르산나트륨에 효모를 재현탁합니다. RNase가 열 블록 또는 수조에서 섭씨 50도에서 한 시간 동안 또는 섭씨 37도에서 밤새 효모와 반응하도록 합니다.

RNase 처리 후 혼합물에 50마이크로리터의 proteinase K 용액을 첨가하고 섭씨 50도에서 한 시간 동안 반응을 계속합니다. 그런 다음 세포를 스핀다운하고 1ml의 구연산나트륨에 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 세포를 원심분리하고 진공을 사용하여 상층액을 흡

그런 다음 희미한 빛에서 녹색 핵산 염색과 함께 1ml의 구연산 나트륨에 세포를 재현탁시킵니다. 이제 실온에서 한 시간 동안 어두운 곳에서 효모에서 배양하십시오. 계속하려면 530나노미터 방출 데이터를 사용하는 세포 분류기를 사용하여 세포를 계수합니다.

DNA 함량에 따라 세포주기 단계, G1 S, 초기 G2 및 후기 G2로 분류합니다. 각 단계에서 최소 160만 개의 반수체 세포를 수집합니다. 세포를 분류한 직후 20분 동안 회전시킵니다. 상층액을 흡인하고 펠릿을 섭씨 영하 20도에서 동결하여 보관합니다.

우리는 이 절차에서 가장 중요한 단일 단계는 세포를 수집한 후 즉시, 분류 후 가장 많은 시간이 걸리는 세포를 회전시키는 것임을 발견했습니다. 이 추출은 효모 게놈 DNA 추출 키트를 기반으로 합니다. 120마이크로리터의 소화 완충액과 5마이크로리터의 효모 용해 효소를 추가하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 와류를 사용하여 세포를 반응 혼합물에 혼합하고 혼합물을 섭씨 37도에서 40-60분 동안 배양합니다. 다음으로, 120마이크로리터의 용해 완충액을 추가하고 혼합물을 10-20초 동안 고속으로 와류로 가열합니다. 그런 다음 250마이크로리터의 클로로포름을 넣고 1분 동안 튜브 내용물을 완전히 섞습니다.

그런 다음 2분 동안 최대 속도로 튜브를 회전시킵니다. 그런 다음 상등액을 DNA 결합 컬럼으로 옮깁니다. 1분의 최대 속도 원심분리 주기를 사용하여 컬럼을 통해 상층액을 회전시킵니다.

컬럼 멤브레인의 DNA를 세척하려면 컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고 300마이크로리터의 DNA 세척 버퍼를 적용합니다. 그런 다음 1분 동안 최대 속도로 원심분리를 반복합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.

DNA를 수집하려면 스핀 컬럼을 새 튜브로 옮깁니다. 물 60마이크로리터를 넣고 1-3분 정도 기다립니다. 그런 다음 10초 동안 최대 속도로 컬럼을 원심분리하여 용리된 DNA가 포함된 물을 분리합니다.

이제 1-200 농도의 시약을 포함하는 5-195 마이크로 리터의 이중 가닥 DNA 고감도 완충액을 추가하십시오. 그런 다음 샘플의 형광을 측정하여 수율을 계산합니다. 10에서 50 나노그램 사이의 DNA를 수집할 것으로 예상됩니다.

이제 초음파 처리를 사용하여 DNA를 250에서 350 염기쌍 사이의 단편으로 분해합니다. 그런 다음 표준 키트를 사용하여 DNA 라이브러리를 준비하고 최소 1,000만 개의 50 염기쌍 단일 말단 판독을 사용하여 염기서열을 분석합니다. 설명된 절차는 발아 효모에서 후기 복제 부위를 식별하는 데 사용되었습니다.

정상 세포는 탈아세틸화효소 단백질인 Sir2가 없는 세포와 비교되었습니다. 원시 데이터에는 대부분 TY 요소의 존재로 인해 큰 스파이크가 포함되어 있습니다. 이러한 스파이크는 각 샘플에 대한 판독 깊이를 빨간색 깊이 중앙값의 2.5배로 제한하여 제거되었습니다.

그런 다음 스파이크가 제거된 데이터를 20kb 슬라이딩 윈도우로 다듬었습니다. 마지막으로, 데이터를 정규화하고 G1의 수준에 대한 비율로 표시했습니다. 완전히 복제되지 않은 셀은 0.5에 나타나고 완전히 복제된 셀은 1에 나타납니다. 7번 염색체에서 얻은 이 데이터에는 Sir2 돌연변이에서 알려진 후기 복제 영역의 증거가 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 DNA 복제를 마지막으로 완료하기 때문에 DNA 절단 및 후기 복제와 관련된 기타 문제에 특히 취약한 게놈 영역을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.