플라즈마 의학-세포 액체에서 처리량 접근 기초 연구

이러한 다중 웰 기반 염기서열 분석의 전반적인 목표는 광학 방출 분광법, 액체 분석 및 세포 활성, 현미경 및 유세포 분석 분석을 사용하여 체외에서 생물학적 반응에 대한 산화제에 대한 저온 물리적 플라즈마의 영향을 더 잘 이해하는 것입니다. 이 방법은 혈장 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 특히 면역원성 암세포 사멸 유도에 중요한 혈장 유래 지시 종과 관련하여 답변하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 반자동 접근 방식이라는 것입니다.

96개의 웰 플레이트를 사용하여 연구 속도와 생산성을 높입니다. 이 기술의 의미는 피부과 또는 종양학과와 같은 미래의 혈장 요법으로 확장됩니다. 그리고 생물학적 반응과 관련된 혈장 유래 지시 종을 식별할 수 있는 수단을 제공하기 때문입니다.

이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Felix Niessner가 맡을 것입니다. 플라즈마 종 모니터링을 위해 기둥 축에 수직인 광학 방출 분광 광도계 앞에 대기 플라즈마 제트를 배치하고 전용 소프트웨어를 사용하여 분당 2개의 표준 리터 공급 가스 플럭스에서 각 가스 상태의 광방출 및 파장을 기록합니다. 플라즈마 처리된 과산화물 분석의 경우, 적절한 처리 시간 및 웰 위치와 함께 XYZ 테이블에 대한 최종 프로토콜을 설정합니다.

그런 다음 갓 준비한 마스터 믹스 100마이크로리터를 바닥이 평평한 투명한 96웰 플레이트의 웰에 3회씩 추가하고 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 550나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 세포 대사 반응에 대한 혈장 처리의 효과를 분석하기 위해 층류 후드에서 평평한 바닥 96 웰 플레이트에서 웰당 완전히 보충된 세포 배양 배지 100마이크로리터에 있는 4개의 관심 세포에 10배를 1회 파종하고 밤새 배양합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양 후 실험 분석에 따라 XYZ 테이블을 사용하여 웰을 플라즈마 또는 가스만으로 처리하고 세포를 다시 20시간 동안 인큐베이터로 되돌립니다.

두 번째 배양이 끝나면 500마이크로몰 Resazurin이 보충된 25마이크로리터의 신선한 세포 배양 배지를 세포와 3개의 백그라운드 컨트롤 Resazurin 전용 웰에 추가합니다. 세포를 인큐베이터로 되돌려 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 마이크로 플레이트 리더에서 형광을 측정합니다.

혈장 처리된 세포의 이미징을 위해 형광을 판독한 후 상층액을 100마이크로리터의 신선한 세포 배양 배지로 교체하고 1밀리리터당 1마이크로그램의 프로피듐 요오드화물을 보충합니다. 플레이트를 전동 현미경 스테이지에 놓고 20x 대물렌즈를 선택하여 세포를 이미지화합니다. 그런 다음 적절한 정량적 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 웰에서 이미징된 모든 시야의 디지털 위상차 이미지에서 총 세포질 면적을 결정합니다.

혈장 처리된 세포의 유세포 분석을 위해 이미징 후 각 웰의 세포를 200마이크로리터의 PBS로 2회 세척하고 세척당 칼슘과 마그네슘을 보충한 다음, 50마이크로리터의 PBS에 항마우스 칼레티큘린 단클론 항체 밀리리터당 15 애너그램과 웰당 칼슘 및 마그네슘을 라벨링합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 15분 후 200마이크로리터의 완전한 세포 배양 배지로 세포를 두 번 세척하고 섭씨 37도에서 20분 동안 각 웰에 100마이크로리터의 세포 분리 용액을 추가합니다. 세포가 분리될 때, 유세포 분석기에 플레이트를 로드하고 일반적으로 생존 가능한 세포와 관련된 전방 및 측면 산란 집단에서 최소 1, 000 이벤트를 획득합니다.

그런 다음 적절한 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 모집단을 게이트하고 칼레티큘린 발현의 평균 형광 강도를 측정합니다. 광학 방출 분광법은 다양한 공급 가스 조건에서 반응성 플라즈마 성분과 연결된 뚜렷한 피크를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 액체의 플라즈마 처리의 경우, 아르곤 가스와 아르곤 플라즈마로 인한 증발이 먼저 결정되며, 플라즈마가 온도에도 영향을 미치기 때문에 조건에 따라 다른 증발 결과가 생성됩니다.

하이드록실 라디칼에 대한 광학 방출 분광법 결과와 유사하게, 과산화수소 증착은 산소 또는 질소 혼합물에서 크게 감소하지만 가습 공급 가스에서는 증가합니다. 또한, 공급 가스에 질소를 첨가하면 아르곤 플라즈마 처리된 액체에 비해 질산염 농도가 크게 높아집니다. 대부분의 초산화물은 건조 아르곤 가스 조건에서 생성되며, 가습된 아르곤 산소 플라즈마가 있는 경우를 제외하고는 산소 및/또는 질소 혼합물이 초산화물 생성을 크게 냉각시킵니다.

레사주린(Resazurin)과 플라즈마(plasma) 처리된 세포의 형광 강도는 세포 배양의 상층액에 대해 육안으로 관찰된 물리적 변화와 유사하며, 이는 장기간의 플라즈마 처리에 따른 세포독성 효과를 확인한다. 총 세포 면적의 감소는 플라즈마 처리에 대한 노출 감소에 대한 반응으로 특히 가습된 공급 가스 조건 하에서 관찰되며, 미렌 흑색종 세포에서 칼레티큘린 염색의 전반적인 상향 조절이 관찰됩니다. 적절하게 수행되면 mytoplex 세포 분석 및 판독을 단 몇 시간 만에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 면역 세포와의 공동 배양 또는 세포 배양 상층액 분석과 같은 다른 방법도 수행할 수 있습니다. 이는 댐(dams), 사이토 클라이언트(cyto client) 또는 리덕스(redux) 단백질의 방출과 혈장 처리된 흑색종 세포의 면역 인식에 대한 추가 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 개발 후 이 기술은 예를 들어 3D 종양 스페로이드와 같은 흑색종 주기에 대한 추가 연구를 위한 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 플라즈마 기체 상태, 반응성 분자 및 액체에 대한 연구, 흑색종 세포의 생물학적 반응에 이르기까지 혈장 의학에서 기본 연구를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.