혈액 처리를위한 빠른 방법은 인간의 혈액에서 혈장 펩타이드 수준의 수율을 증가하는

이 RAPID 방법의 전반적인 목표는 인간 혈액에서 측정할 내인성 펩타이드 호르몬의 수율을 개선하는 것입니다. RAPID 방법은 최근 쥐에 사용하기 위해 확립되었으며 인간 혈액에도 사용하기에 적합합니다. RAPID 방법은 수율을 개선하고 내인성 펩타이드의 올바른 분자 형태를 검출할 수 있습니다.

RAPID 방법은 사용하기 쉽습니다. 그러나 RAPID 방법은 표준 혈액 샘플링에 비해 시간과 비용이 더 많이 듭니다. 따라서 연구 환경에 더 적합할 수 있습니다.

이 방법을 시각적으로 보여주는 것은 샘플의 적시 희석과 적절한 펩타이드 수준을 보장하기 위해 매우 중요한 용출이기 때문에 매우 중요합니다. 팔뚝 정맥에서 하룻밤 금식 후 정해진 시간에 정맥혈을 수집합니다. 그리고 표준 절차 또는 RAPID 방법에 따라 처리합니다.

피험자들에게 혈액을 뽑기 전에 운동이나 담배를 피우지 말라고 지시한다. 표준 처리의 경우 냉각된 EDTA 함유 튜브와 원심분리기에서 10분 이내에 3000Gs에서 10분 이내에 4도에서 10분 동안 혈액을 수집합니다. 상층액을 수집하고 방사성 면역 분석법으로 추가 처리할 때까지 섭씨 영하 80도를 유지합니다.

RAPID 가공의 경우 얼음처럼 차가운 RAPID 버퍼에 혈액을 즉시 1에서 10으로 희석하십시오. PH 3 점 6, 영점 1 몰 아모늄 아모시 테이트를 포함합니다. 영점 5 몰 염화나트륨 및 효소 억제제.

10분 이내에 섭씨 4도에서 10분 동안 3000Gs의 RAPID 샘플을 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 수집합니다. 다음으로, 크로마토그래피 카트리지를 100% 액티토니트릴로 분당 10밀리리터로 충전합니다. 0.1%trifluoroacetic, 또는 TFA를 가진 평형 후.

주사기 펌프를 사용하여 분당 1ml의 일정한 속도로 RAPID 샘플 상등액을 로드합니다. 0.1%TFA 3밀리리터로 카트리지를 세척한 후 분당 10밀리리터로 0.1%TFA를 함유한 70%아세토니트릴 2밀리리터로 RAPID 샘플을 분당 2밀리리터로 천천히 용리합니다. 진공 원심분리를 사용하여 용출된 샘플을 건조시키고 방사성 면역분석법으로 추가 처리할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

요오드 125 방사 표지 인간 펩타이드를 얻습니다. 실험이 끝날 때까지 펩타이드를 분말 형태로 보관하십시오. 그런 다음 0.1% 아세트산으로 갓 희석합니다.

표준 처리의 경우, 채혈 직후 냉장 EDTA 함유 튜브에 3000-6000 CPM을 함유한 50마이크로리터의 방사선 라벨이 있는 튜브에 1ml의 혈액을 전달합니다. RAPID 처리의 경우 혈액이 들어있는 EDTA 1 밀리리터를 9 밀리리터의 RAPID 완충액이 들어있는 튜브로 옮기고 500 마이크로 리터의 방사선 라벨에는 30, 000에서 60, 000 CPM이 들어 있습니다. 1에서 10까지 희석하기 때문에 RAPID 처리를 위해 10배 더 많은 양의 방사선 라벨을 사용하십시오.

RAPID 방법의 여러 단계를 적용한 직후 감마 계수기를 사용하여 방사성 표지된 펩타이드의 회수율을 평가합니다. 진공 원심분리로 샘플을 건조하지 말고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 측정을 위해 상등액을 감마 카운터에 맞는 튜브로 옮깁니다.

그리고 분당 카운트를 평가합니다. 표준 샘플에서 전체 상등액을 측정합니다. RAPID 샘플에서 전체 부피의 10분의 1을 분석하여 비슷한 양의 방사성 라벨을 사용합니다.

100% 표준으로, 가공을 거치지 않는 50마이크로리터의 요오드 125 방사성 표지 펩타이드가 함유된 두 개의 샘플을 사용하십시오. 모든 샘플의 방사능을 동시에 측정합니다. 냉각된 EDTA 함유 튜브에서 혈액을 채취하고 표준 처리를 위해 15, 000에서 20, 000 CPM을 포함하는 200 마이크로리터의 방사선 표지된 아실 그렐린이 들어 있는 튜브로 1밀리리터를 옮깁니다.

RAPID 처리를 위해 1 밀리리터의 혈액을 9 밀리리터의 빠른 완충액과 15, 000에서 20, 000 CPM을 포함하는 200 마이크로 리터의 방사선 표지 된 아실 그렐린을 담고있는 튜브로 옮깁니다. 그 후, 이전과 같이 샘플을 가공합니다. 역상 HPLC에 의한 추가 분석을 위해 0.1% TFA가 보충된 물에 17% 아세토니트릴로 평형을 이룬 안정적인 결합 C18 컬럼에 샘플을 직접 로드합니다.

5분 평형 후 17%에서 40%아세토니트릴의 그래디언트를 사용하여 분당 1밀리리터로 40분 내에 샘플을 용리합니다. 1분마다 1밀리리터의 분획을 수집하고 감마 계수기를 사용하여 방사능을 분석합니다. 별도의 실험에서, 15, 000 - 20, 000 CPM을 함유하는 방사성 표지된 아실 그렐린 200 마이크로리터를 컬럼에 직접 로드하고 이전과 같이 HPLC를 수행합니다.

방사성 면역 분석의 경우, 실온에서 냉동 상등액과 진공 건조 분말을 해동합니다. 방사성 면역 분석 직전에 원래 혈장 부피에 따라 이중 증류수에 건조 RAPID 샘플을 다시 현탁시킵니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 상업용 방사성 이무노아세이를 사용하여 키스펩틴과 총 그렐린, 아실 그렐린을 평가합니다.

안정적인 팔레트 형성을 허용하는 붕규산 튜브를 사용하십시오. 첫째 날에는 24시간 동안 제조업체가 제공한 희석액에서 분석 완충액과 1차 아티바디로 샘플을 배양합니다. 둘째 날에는 요오드 125 트레이서, 볼텍스를 추가하고 24시간 동안 배양합니다.

3일차에는 percipitating reagent, vortex를 추가하고 제조업체에서 권장하는 대로 배양합니다. 다음 3, 섭씨 4도에서 20분 동안 000Gs에서 튜브를 원심분리하십시오. 상층액을 제거하고 감마 카운터를 사용하여 팔레트의 방사능을 계산합니다.

desacyl ghrelin을 총 ghrelin에서 acyl ghrelin을 뺀 차이로 계산합니다. 각 개별 샘플에 대해 desacyl ghrelin에 의한 아실을 다이빙하여 acyl, desacyl ghrelin 비율을 평가합니다. 가능한 경우 모든 샘플을 하나의 배치로 처리하여 분석 간 변동성을 방지하십시오.

RAPID 혈액 처리는 표준 혈액 처리와 비교하여 인간 혈액에서 요오드 125 방사성 표지 펩타이드의 수율을 증가시킵니다. 표준 혈액 처리 후, 9개의 펩타이드에서 방사성 표지된 펩타이드의 회수율은 48%에서 68%까지 다양했습니다. RAPID 처리는 모든 요오드 125 표지 펩타이드의 수율을 개선했으며 회수율은 71%에서 98%에 이릅니다. 다음은 표준 또는 RAPID 혈액 처리 후 인간 혈액에서 요오드 125 표지 아실 그렐린의 용출 프로필입니다.

RAPID 처리 후, 요오드 125 표지 그렐린이 예상 위치에서 회피되었습니다. 표준 절차 후에 더 이른 피크가 관찰되었습니다. desacyl ghrelin에 해당할 가능성이 높습니다.

이것은 펩티드의 62% 분해를 나타냅니다. RAPID 혈액 처리는 표준 처리와 비교하여 acyl, desacyl ghrelin 비율을 향상시킵니다. RAPID 처리 후, 정상 체중 피험자의 혈액 내 아실, 데사실 그렐린 비율은 1 대 3이었습니다.

표준 혈액 처리 후 1-23명과 비교됩니다. 거식증과 비만 상태에서도 비슷한 결과가 관찰되었다. RAPID 혈액 처리는 표준 처리에 비해 내인성 키스펩틴 혈액 수치를 증가시킵니다.

거식증 환자와 정상 체중 피험자 모두에서, 순환 내인성 키스펩틴 수치는 표준 처리에 비해 RAPID 후 훨씬 더 높았습니다. 그 차이는 비만 조건에서는 유의하지 않았다. 일단 숙달되고 적절하게 수행되면 이 기술은 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 방법은 펩타이드의 예상 농도가 낮거나 그룹 간의 차이가 작을 때 특히 중요합니다. 펩타이드에 대한 일반적인 권장 사항은 제공할 수 없습니다. 각 펩티드에 대한 잠재적 이점은 처음에 한 번 테스트해야 합니다.

이 기술은 다양한 분야의 연구자들이 수율을 탐구하고 더 중요하게는 내인성 펩타이드 호르몬의 올바른 분자 형태를 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간의 혈액 처리에 RAPID 방법을 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.