Name: 혈액 처리를위한 빠른 방법은 인간의 혈액에서 혈장 펩타이드 수준의 수율을 증가하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 배우세요 인간 혈액에서 RAPID 혈액 처리법을 이용해 내인성 펩타이드 호르몬 수율을 높이는 방법을. 이 기법은 정확한 분자 형태 평가와 연구 환경에서의 적용에 탁월합니다.

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이 작품은 교육 및 연구 03IPT614A (CG)에 대한 독일 연구 재단 STE 1765 / 3-1 (AS)와 독일 정부에 의해 지원되었다. 우리는 조직과 인체 측정의 실행에 대한 도움말은 라인 하르트 Lommel와 페트라 BUSSE 우수한 기술 지원뿐만 아니라 카린 요한슨과 크리스티나 Hentzschel 감사합니다

이 프로토콜은 (/ 10분의 114 프로토콜 번호 EA1) 인간 연구에 대한 로컬 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1. 혈액 처리 <ol><li> 표준 절차 또는 신속한 방법에 따라 팔뚝 정맥 및 프로세스에서 하룻밤 빠른 애프터 07:00 오전 8시 사이의 정맥 혈액을 수집합니다. 혈액 철수하기 전에 운동을 연기하지 않도록 주제를 지시한다. </li><li> 표준 처리를 위해, 4 ℃에서 10 분 동안 3,000 XG에 10 분 이내에 냉장 EDTA 함유 튜브에 혈액을 원심 분리기를 수집합니다. 상층 액을 수집하고 방사 면역 측정법에 의해 추가 처리까지 -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> RAPID 처리 즉시 혈액 희석 빙냉 완충액 1:10 (PH 3.6), 0.1 M 암모늄 아세테이트, 0.5 M NaCl을 함유하는 효소 억제제 (혈액 인출 후 1 분 이내) (diprotin의 A, E-64-D, antipain , 류 펩틴, chymostatin 1 μg의 / ㎖). 그런 다음, 4 ° C에서 10 분 동안 3,000 XG에 10 분 이내에 원심 분리하고 상층 액 우리를 수집쥐 6 이전에 설명 된대로 폴리 프로필렌 튜브에 피펫을 보내고. <ol><li> 100 % 아세토 니트릴 (속도 10 ml / 분)로 충전 크로마토 카트리지 (360 ㎎, 55-105 μm의)는 1 ml의 일정한 속도로 상층 액 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA, 속도 10 ml / 분) 및 부하 평형화 / 주사기 펌프를 사용하여 분. </li><li> 그 후, 3 ㎖ 0.1 % TFA와 함께 카트리지 (속도 10 ml / 분)을 씻어 내고 천천히 0.1 % TFA (2 ㎖ / 분)를 함유하는 2 ml의 70 % 아세토 니트릴로 용출시킨다. </li><li> 방사 면역 측정법에 의한 추가 처리까지 -80 ° C에서 진공 원심 분리 및 저장소를 사용하여 건조 용출 샘플. 참고 : 폴리 프로필렌 (RAPID 처리) 및 보로 실리케이트 (방사 면역 측정법) 특성을 결합 상당히 낮은 표면을 나타낸다 따라서 26 전에 공부 펩티드 대부분의 펩타이드 손실을 최소화 튜브의 모든 단계를 실시한다. </li></ol></li></ol> 2. 측정 참고 :이 섹션의 단계는 실험실에서 수행되어야한다방사성 물질과 작품에 대한 인증을 획득하였습니다. 내가주의해야한다 (125)와 함께 작업을위한 표준주의 사항. <ol><li> 방사성 표지 된 펩티드의 복구 <ol><li> 125 I-방사성 표지 인간의 펩티드를 얻습니다 (예. 아 - 그렐린, GLP-1, 글루카곤, 인슐린, kisspeptin, 렙틴, nesfatin-1, PYY 3-36 및 소마토스타틴-28). </li><li> 다음 갓 0.1 %의 아세트산을 희석 실험까지 분말 형태의 펩티드 유지하고 (~ 10 mL의 CPM). </li><li> 표준 혈액 처리, 튜브, 3,000~6,000 CPM을 함유하는 방사성 50 μL와 튜브로 이송 혈액 1 ㎖를 함유하는 냉장 EDTA 혈액 내로 직접 인출 한 후 (직접 계산 실험이 시작되기 전). </li><li> RAPID 처리, 9 ㎖의 완충액을 RAPID을 함유하는 튜브에 혈액을 EDTA를 포함하는 전송 된 1 ml의 혈액 (조성물 1.3 참조), 500 μL의 방사성 표지는 30,000-60,000 CPM을 함유. radiolabe의 인해 1시 10분 희석 사용에 10 배 높은 볼륨신속한 처리를 위해 리터. </li><li> 이후, 처리 된 샘플은 단계 1.3.2 1.2에 기재. </li><li> 복구 실험을 위해, 진공 원심 분리하지 건조 샘플을 -80 ℃에서 저장하지 않습니다. 대신, 바로 후 감마 계수기를 사용하여 방사능 표지 된 펩타이드의 회수를 평가한다. </li><li> RAPID의 샘플을 사용 방사성 표지의 양의 비교를 얻기 위해 전체 부피의 1/10을 분석하면서, 표준 시료 전체 상등액을 측정한다. 측정을 위해, 감마 카운터로 피팅 튜브로 상청액을 이전 분당 카운트를 평가 </li><li> 100 % 표준으로, 처리를받지 않은 125 I-방사성 표지 된 펩티드의 50 μl를 두 개의 샘플을 사용합니다. 2.1.7에 설명 된 다른 샘플을 동시에 측정한다. </li><li> 각 펩타이드에 대한 실험을 5 ~ 6 번을 수행합니다. </li></ol></li><li> 방사성 표지 된 그렐린의 고성능 액체 크로마토 그래피 <ol><li> C에서 피를 철수튜브 (실험 시작 전에 직접 계산) 15,000-20,000 CPM을 함유하는 200 ㎕의 방사성 표지 된 그렐린 아실을 포함하는 튜브로 전송 1㎖를 함유 hilled EDTA. </li><li> RAPID 처리에 9 ml의 RAPID에게 버퍼를 포함하는 튜브에 1 ㎖의 전달은 혈액 (조성물 1.3 참조), 200 ㎕의 방사성 표지 된 아실 그렐린은 15,000-20,000 CPM을 함유. </li><li> 이후, 처리 된 샘플은 단계 1.3.2 1.2에 기재. </li><li> 역상 HPLC에 의해 추가 분석을 위해, 직접 물에 17 % 아세토 니트릴 평형 안정적인 채권 C18 컬럼 (× 50 mm 2.1 mm, 1.8 μm의) (모두 0.1 % TFA로 보충)에 샘플을로드합니다. </li><li> 5 분의 평형 후, (1 ㎖ / 분의 유량) 40 분에서 샘플을 용리 17~40% 아세토 니트릴의 구배를 사용한다. </li><li> 1 ml의 매 순간의 분수를 수집하고 감마 카운터를 사용하여 방사능을 분석 할 수 있습니다. </li><li> 별도의 실험에서, 부하 200 ㎕의 방사성 표지 아실 그렐린은 15,000-20,000을 포함CPM 직접 열 위에 및 단계 2.2.6에 2.2.4에 설명 된대로 HPLC를 수행합니다. </li></ol></li><li> 방사 면역 측정법 <ol><li> 방사 면역 들어 냉동 상청액 (기본 처리)를 해동하고, 실온에서 건조하여 분말 (RAPID 방법) 진공. </li><li> 직전 방사 면역 측정법, 플라즈마 (500 μL)의 원래 볼륨에 따라 두 번 증류수 H 2 O에 건조 RAPID 샘플을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 방사선 면역 측정법을 사용 12,27 전에 설명 된 바와 같이 kisspeptin 총 (desacyl 및 아실 그렐린 모두 포함)뿐만 아니라 아 그렐린을 평가합니다. 안정적인 펠릿 형성을 허용 붕규산 튜브를 사용합니다. <ol><li> 첫 날에, 24 시간 동안 제조자에 의해 제공된 희석의 분석 완충액과 차 항체 (예. 항 그렐린)로 샘플을 배양한다. </li><li> 하루에 두에서, VO 125 ​​I 트레이서 (예를 들어 125 I-그렐린)를 추가rtex 24 시간 동안 배양한다. </li><li> 하루 세에서 침전 시약, 소용돌이를 추가하고 제조업체에서 권장 품어. 그런 다음, 원심 분리기 튜브 4 ℃에서 20 분 동안 3,000 XG에. 상층 액을 제거하고 감마 카운터를 사용하여 펠렛의 방사능을 계산 </li></ol></li><li> 총 마이너스 아실 그렐린의 차이로 desacyl 그렐린를 계산합니다. 각 샘플 desacyl 그렐린에 의해 아실 나누어 아실 / desacyl 그렐린 비율을 평가한다. </li><li> 모든 샘플을 처리 - 가능한 경우 - 하나의 배치에 간 분석 변동을 방지 할 수 있습니다. 본 실험에서의 내부 분석 변동성은 kisspeptin에 대한 &lt;8 %, &lt;총 7 %와 아 그렐린에 대한 &lt;9 %였다. </li></ol></li></ol> 3. 통계 분석 <ol><li> 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트를 사용하여 데이터의 분배를 결정한다. 평균의 평균 ± 표준 오차 (SEM) 등의 데이터를 표현한다. </li><li> 둘 사이의 차이를 평가t-test를하여 그룹. 홀름 - Sidak 방법 다음에 모든 쌍의 현명한 다중 비교 절차 (Tukey에 사후 테스트) 또는 양방향 ANOVA에 의해 여러 그룹 사이의 차이를 평가합니다. </li><li> 중요한 &lt;0.05 쪽을 고려하고 통계 프로그램을 사용하여 분석을 수행합니다. </li></ol>

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<li>Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+increases+plasma+levels+of+corticotropin-releasing+hormone+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats.</a> Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).</li>
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저자는 공개 아무것도 없어.

우리는 혈액 처리 용 RAPID 방법 래트 6 표준 혈액 처리에 비해 11/12 펩티드 회복을 개선하는 것이 이전에보고 하였다. 본 연구에서 우리는이 방법은 또한 인간의 사용에 적합 것으로 나타났습니다. 신속한 처리에 따라, 시험 구 (125) 9 I-표시 펩티드에 대한 복구는 표준 혈액 처리 (얼음 EDTA 혈액)에 비해 향상되었다. 관찰 된 향상은, 특히 펩티드의 수율이 낮은 경우 만 마스크 할 수 미묘한 차이가 예상되는 상황에서, 관련 가능성 19~39%에서였다. 우리는 또한 보여 주었다 RAPID 혈액 처리 그렐린 표준 혈액 처리 후 2/3 그렐린을 desacyl에 성능이 저하 된 반면, 정확한 분자 형태 (아실 그렐린)를 나타내는 HPLC 후 올바​​른 용출 위치에서 검출 된 후. 아실 그룹 D, 그렐린 수용체 (28)의 결합을 위해 필수적이기 때문에전자 실화 크게 펩타이드의 생물학적 기능을 변경할 것으로 예...

1,2- 비만의 세계적인 보급 증가에 비추어, 음식 섭취 조절 분야에서의 연구는 중요성을 얻고있다. 지금까지 단 하나의 펩티드 둘레 생성하는 것으로 알려져 중앙 지난 수십 년 내에 음식 섭취, 즉 그렐린 (3)을 자극하는 역할을하는 반면, 펩티드의 다양한 예 : 음식물 섭취를 줄이는 것이 확인되었다. 렙틴, 펩티드 YY (PYY)과 같은 글루카곤 유사 펩티드 -1 (GLP-1) 및 인슐린 (4), 따라서, 기아 포만 펩티드 레벨의 조절 메커니즘을 조사하는 연구들은 평가되고 동시에, 상정 검토 펩타이드 안정적인 플라즈마 형성시 높은 수율로 회수된다. 예에 대한 이전 바와 같이 단, 자주 이는 급속한 내인성 고장이 아니다. 그렐린 5 desacyl하는 아에서 분해되는 그렐린. 따라서, 우리는 최근 혈액 처리 용 빠른 방법을 설명R educed 온도하는 cidification를 사용하는 쥐에서 노래, P 나는 외생 컨트롤 및 D의 ilution 6 sotopic, 억제를 rotease. 이 방법 (11) (12)의 테스트 펩타이드 (얼음 EDTA 혈액) 표준 혈액 처리에 비해 정확한 순환하는 분자 형태를 결정하기위한 허용 6 회복을 향상시켰다. 이 방법은 부 신피질 자극 호르몬 방출 인자 (13)뿐만 아니라 그렐린 순환을 검출하기위한 몇 가지 후속 연구 7-12에 사용되어왔다. 따라서,이 방법은 설치류에서 펩타이드 연구에 유용 입증되었습니다. 설치류 연구는 다른 종 항상 병진 아니므 그러나,이 방법도 사람의 혈액에서 사용하기 위해 설정되어야한다. 본 연구의 목적은 광범위 14 U 자주 추천 표준 혈액 처리 얼음 EDTA 혈액에 비하여 인간의 혈액 처리를위한 신속한 방법을 시험했다임상과 연구 환경에서 나오지. 최근 다음 처리 (식품 섭취에 대한 효과를 표 1에 나타낸다) 규제 공급에 중요한 역할을 제안 확립 펩타이드뿐만 아니라 새로운 후보 비롯한 음식 섭취의 조절에 관여하는 125 I 표지 된 펩타이드의 선택 회수 시험 두 가지 방법으로. 호르몬은 또한 다른 길이 및 충전 (표 2)의 펩티드를 표현하기 위해 선택되었다. 또한, 그렐린을 위해 우리는 표준 및 RAPID 방법에 따라 분자 형태 (들)을 조사 하였다. 마지막으로, 내생 그렐린 (아실 desacyl 그렐린)뿐만 아니라 kisspeptin 레벨 최근 RAPID 또는 표준 처리 다음 15,16 음식 섭취의 조절에 중요한 역할을 제안 펩타이드를 평가 하였다. 또,도 possib을 연구 (10.2-67.6 kg 범위 / m 2) 체질량 지수의 광범위한 환자의 집단에서 이러한 펩티드 수준을 조사만성 변경 체중 관련 르 차이. <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/53959/53959table1.jpg" /><img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/53959/53959table2.jpg" /> 진단, 평가 및 계획 : 연구 참여자 모든 연구 참가자는 새로 샤리 테 - Universitätsmedizin 베를린에서 정신 신체 의학 부문 (포함 병원에 입원 이틀 이내) 환자를 입원하고 동의서를 작성했다. 성별의 영향 만 여성 환자가 포함되었다을 방지합니다. 42 과목의 총이 연구에 참여하고 세 그룹으로 나누었다 : 정상 체중 (BMI 18.5-25 kg / m 2, N = 12), 신경성 식욕 부진 (BMI &lt;17.5 kg / m 2, N = 15)과 비만 (BMI&gt; 30kg / m 2, N = 15). 식욕 부진과 비만 환자였다질병-10의 국제 분류에 따라 진단 각각 체중 증가 (신경성 식욕 부진) 또는 체중 감소 (비만), 병원에 입원. 모든 정상 체중 환자 인해 관련 신체 장애없이 신체형 증상에 독점적으로 병원에 입원했다. 위장 신체형 증상이나 위장 수술의 병력이있는 환자는 제외 하였다. 제외 기준은 시대 &lt;십팔년, 현재 임신​​과 치료 정신 질환에 포함. 채혈은 각각 증가하거나, 체중을 감소시키기 위해식이 요법 치료를 받기 전에 입원 후 2 일 또는 3 일에 수행 하였다. 인체 파라미터는 같은 날에 평가 하였다.

<table><tbody><tr><td>Diprotin A</td><td>펩타이드 국제, 루이빌, 켄터키, 미국</td><td>IDP-4132</td><td></td></tr><tr><td>E-64-d</td><td>펩타이드 국제, 루이빌, 켄터키, 미국</td><td>IED-4321-V</td><td></td></tr><tr><td>Antipain</td><td>펩타이드 국제, 루이빌, 켄터키, 미국</td><td>IAP-4062</td><td></td></tr><tr><td>루펩</td><td>틴 펩타이드 국제, 루이빌, 켄터키, 미국</td><td>ILP-4041</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatin</td><td>Peptides International, Louisville, Ky, USA</td><td>ICY-4063</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 카트리지</td><td>Waters Corporation, Milford, MA, USA</td><td>WAT051910</td><td>360 mg, 55-105 &micro; m</td></tr><tr><td>Acyl-ghrelin</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9088-HK</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>GLP-1</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9035-HK</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9030</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9011S</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>Leptin</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9081-HK</td><td>방사성</td></tr><tr><td>키스펩틴-10</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-048-56</td><td>방사성</td></tr><tr><td>Nesfatin-1</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-003-26</td><td>방사성</td></tr><tr><td>PYY3-36</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-059-02&nbsp;</td><td>방사성</td></tr><tr><td>Somatostatin-28</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-060-16&nbsp;</td><td>방사성</td></tr><tr><td>ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 컬럼</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA</td><td>822700-902</td><td>2.1 mm x 50 mm, 1.8 &micro; m</td></tr><tr><td>애질런트 1200 LC&nbsp;</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>HPLC, 여러 구성 요소, 따라서 단일 카탈로그 번호</td></tr><tr><td>없음 Kisspeptin&nbsp; RIA</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td># RK-048-56</td><td>방사성</td></tr><tr><td>총 그렐린 RIA</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td># GHRT-89HK&nbsp;</td><td>방사성</td></tr><tr><td>활성 ghrelin RIA</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA#</td> <td>GHRA-88HK</td><td>방사성</td></tr><tr><td>SigmaStat 3.1</td><td>시스템 소프트웨어, 산호세, 캘리포니아, 미국</td><td>온라인 다운로드</td><td></td></tr></tbody></table>

혈액 처리를위한 빠른 방법은 인간의 혈액에서 혈장 펩타이드 수준의 수율을 증가하는

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

음식 섭취 조절 분야에서의 연구는 중요성을 얻고있다. 이것은 종종 음식 섭취를 조절하는 펩타이드의 측정을 포함한다. 펩티드의 농도의 정확한 결정을 위해, 그 피 처리 동안에 안정해야한다. 그러나,이 신속 내인성 펩티다아제에 의해 분해되는 여러 펩티드의 경우에는 아니다. 최근에, 우리는 R educed 온도하는 cidification를 사용하는 혈액 처리 방법을 개발, P 나는 외생 컨트롤과 쥐의 사용을위한 D의 ilution (RAPID)를 sotopic, 억제를 rotease. 여기서 우리는 인간의 사용을위한이 기술을 확립 및 복구, 분자 형태와 음식 섭취 조절 호르몬의 순환 농도를 조사 하였다. 신속한 방법은 크게 125 I 표지 된 소마토스타틴 -28 (+ 39 %), 글루카곤 유사 펩티드 -1 (+ 35 %)을위한 복구 아실 그렐린 글루카곤 (+ 32 %), 인슐린 kisspeptin (+ 29 % 향상 ) nesfatin-1 (+ 28 %), 렙틴(+ 21 %) 및 표준 처리 (얼음 EDTA 혈액, P &lt;0.001)에 비해 펩티드 YY 3-36 (+ 19 %). 표준 후 처리 아실 그렐린의 62 % 가능성 desacyl 그렐린을 나타내는 피크 이전에 얻어진 분해 동안 고성능 액체 크로마토 그래피는 RAPID 처리 후의 예상 위치 내인성 아실 그렐린의 용출 하였다. 표준 처리 하였다 (p = 0.03) 다음 1시 23분에 비해 3 : 신속한 처리 후 정상 체중 환자의 혈액에서 아 / desacyl 그렐린의 비는 1. 또한 내인성 kisspeptin 레벨 표준 처리에 비해 RAPID 후에 높았다 (+ 99 %, p = 0.02). 신속한 혈액 처리 방법은 인간에서 사용될 수있는 더 높은 펩티드 농도를 산출하고 정확한 분자 형태의 평가를 허용한다.

RAPID 피 처리 표준 혈액 처리에 비해 인간의 혈액 125 I-방사성 표지 된 펩티드의 수율을 증가시킨다. 표준 혈액 처리 (얼음 EDTA 혈액) 한 후, 방사성 표지 된 펩티드의 회복 (- K 48-68%, 그림 1A에 이르기까지) 9/9 펩타이드에 ~ 60 %였다. RAPID 처리 즉 소마토스타틴-28에서, 모든 125 I 표지 된 펩티드에 (+ 39 %,도 1a)을 수율 향상, 글루카곤 유사 펩티드 -1 (+ 35 %,도 1b), 아실 그렐린 (N- 옥타 노일 그렐린, + 32 %,도 1C), 글루카곤 (+ 32 %,도 1D), 인슐린 (+ 29 %,도 1E) kisspeptin (+ 29 <stro...

신속한 혈액 처리 방법은 인간에 사용되는 더 높은 펩티드 농도를 얻을뿐만 아니라 올바른 분자 형태의 평가를 허용 할 수있다. 따라서,이 방법은 펩타이드 연구에 귀중한 도구가 될 것입니다.

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

이 RAPID 방법의 전반적인 목표는 인혈액 내에서 측정될 내인성 펩타이드 호르몬의 회수율을 향상시키는 것입니다. RAPID 방법은 최근 쥐를 대상으로 확립되었으며, 인혈액 분석에도 적합합니다. RAPID 방법은 회수율을 높여 내인성 펩타이드의 정확한 분자 형태를 검출할 수 있게 합니다.RAPID 방법은 사용법이 간단합니다. 하지만 RAPID 방법은 표준 혈액 샘플링과 비교하여 시간이 더 많이 소요되고 비용이 더 많이 듭니다. 따라서 연구 환경에서 더 적합할 수 있습니다.적절한 펩타이드 수준을 확보하기 위해서는 샘플의 적시 희석과 용출이 매우 중요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 필수적입니다. 하룻밤 동안 금식한 후 표준화된 시간에 전완 정맥에서 정맥혈을 채취하십시오. 그 다음 표준 절차 또는 RAPID 방법에 따라 처리하십시오.피험자에게 채혈 전 운동이나 흡연을 하지 않도록 안내하십시오. 표준 처리 절차를 위해, 냉장된 EDTA 함유 튜브에 혈액을 수집하고 10분 이내에 4°C에서 3000 Gs로 10분 동안 원심분리하십시오. 상층액을 수집하여 방사면역측정법으로 추가 처리할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.RAPID 처리를 위해, 혈액을 얼음처럼 차가운 RAPID 버퍼에 즉시 1:10으로 희석하십시오. 이 버퍼는 0.1 M ammonium acetate, 0.5 M sodium chloride 및 효소 억제제를 포함하며 pH는 3.6입니다.10분 이내에 RAPID 샘플을 4°C에서 3000 Gs로 10분 동안 원심분리하고, 피펫을 사용하여 상층액을 수집합니다. 다음으로, 크로마토그래피 카트리지를 100% acetonitrile로 분당 10 mL의 속도로 충전합니다. 그 후 0.1% trifluoroacetic 또는 TFA로 평형화합니다.시린지 펌프를 사용하여 RAPID 샘플 상층액을 분당 1 mL의 일정한 속도로 로딩합니다. 0.1% TFA 3 mL를 사용하여 분당 10 mL의 속도로 카트리지를 세척한 후, 0.1% TFA가 포함된 70% acetonitrile 2 mL를 사용하여 분당 2 mL의 속도로 RAPID 샘플을 천천히 용리합니다. 용리된 샘플은 진공 원심분리기를 사용하여 건조시키고, 방사면역측정법(radioimmunoassay)으로 추가 처리할 때까지 -80 °C에서 보관합니다.요오드 125(iodine 125)로 방사성 표지된 인간 펩타이드를 준비합니다. 실험 전까지 펩타이드를 분말 형태로 보관하십시오. 그 후 0.1% acetic acid로 새로 희석합니다.표준 처리의 경우, 채혈 직후 냉장 EDTA 튜브에 담긴 혈액 1 mL를 3,000에서 6,000 CPM을 포함하는 방사성 표지물 50 µL가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. RAPID 처리의 경우, EDTA가 포함된 혈액 1 mL를 RAPID 버퍼 9 mL가 들어 있는 튜브로 옮기며, 30,000에서 60,000 CPM을 포함하는 방사성 표지물 500 µL를 사용합니다. 1:10 희석으로 인해 RAPID 처리 시에는 10배 더 많은 부피의 방사성 표지물을 사용하십시오.RAPID 방법의 각 단계를 적용한 직후, 감마 카운터를 사용하여 방사성 표지 펩타이드의 회수율을 평가하십시오. 진공 원심분리기로 샘플을 건조하지 마십시오. 또한 -80 °C에서 보관하지 마십시오. 측정을 위해 상층액을 감마 카운터에 맞는 튜브로 옮기십시오.그리고 분당 계수(counts per minute)를 평가합니다. 표준 샘플의 경우 상층액 전체를 측정합니다. RAPID 샘플의 경우, 사용된 방사성 표지 양을 유사하게 맞추기 위해 전체 부피의 10분의 1만 분석합니다.100% 표준물질로, 가공 처리를 거치지 않은 50 µL의 iodine 125 방사성 표지 펩타이드 샘플 두 개를 사용하십시오. 모든 샘플의 방사능을 동시에 측정하십시오. 냉장 보관된 EDTA 함유 튜브로 혈액을 채취하고, 표준 가공 처리를 위해 15,000에서 20,000 CPM을 함유하는 200 µL의 방사성 표지 acyl ghrelin이 들어 있는 튜브에 혈액 1 mL를 옮기십시오.RAPID 처리를 위해서는 혈액 1 mL를 rapid buffer 9 mL와 15,000~20,000 CPM의 방사성 표지 acyl ghrelin 200 µL가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 그 후, 이전과 동일하게 시료를 처리합니다. 역상 HPLC를 이용한 추가 분석을 위해서는, 0.1% TFA가 첨가된 17% acetonitrile 수용액으로 평형화된 stable bond C18 컬럼에 시료를 직접 로딩합니다.5분간의 평형화 후, 17에서 40% acetonitrile 기울기 용리를 사용하여 분당 1 mL의 유속으로 40분 동안 시료를 용리합니다. 매분 1 mL씩 분획물을 수집하고, 감마 카운터를 사용하여 방사능을 분석합니다. 별도의 실험에서는 15,000에서 20,000 CPM의 방사성 표지 acyl ghrelin 200 µL를 컬럼에 직접 로딩하고 이전과 동일하게 HPLC를 수행합니다.방사면역측정을 위해, 냉동된 상층액과 진공 건조된 분말을 실온에서 해동하십시오. 방사면역측정 직전에, 건조된 RAPID 샘플을 원래의 혈장 부피에 맞춰 2중 증류수에 재현탁하십시오. 제조사의 프로토콜에 따라 상용 방사면역측정법을 사용하여 kisspeptin과 total ghrelin 및 acyl ghrelin을 분석하십시오.안정적인 펠렛 형성이 가능한 붕규산 유리 튜브를 사용하십시오. 첫째 날에는 제조사에서 제공한 희석 배율로 어세이 버퍼 및 1차 항체와 함께 샘플을 24시간 동안 배양합니다. 둘째 날에는 iodine 125 트레이서를 첨가하고, 볼텍싱한 후 24시간 동안 배양합니다.3일 차에 침전제를 첨가하고, 볼텍싱한 후 제조사의 권장 사항에 따라 배양합니다. 그다음, 4 °C에서 3,000 Gs로 20분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고 감마 카운터를 사용하여 펠릿의 방사능을 측정합니다.전체 ghrelin에서 acyl ghrelin을 뺀 차이값으로 desacyl ghrelin을 계산하십시오. 각 개별 샘플에 대해 acyl ghrelin을 desacyl ghrelin으로 나누어 acyl/desacyl ghrelin 비율을 평가하십시오. 분석 간 변동성을 방지하기 위해 가능하면 모든 샘플을 한 배치로 처리하십시오.RAPID 혈액 처리 방식은 표준 혈액 처리 방식과 비교하여 인간 혈액 내 iodine 125 방사성 표지 펩타이드의 수율을 증가시킵니다. 표준 혈액 처리 후, 9가지 펩타이드의 방사성 표지 펩타이드 회수율은 48%에서 68% 사이였습니다. RAPID 처리는 모든 iodine 125 표지 펩타이드의 수율을 향상시켰으며, 회수율은 71%에서 98% 사이였습니다. 여기에는 표준 또는 RAPID 혈액 처리 후 인간 혈액 내 iodine 125 표지 acyl ghrelin의 용출 프로파일이 나타나 있습니다.RAPID 공정 처리 후, iodine 125가 표지된 ghrelin이 예상된 위치에서 용출되었습니다. 반면 표준 절차를 거친 후에는 더 이른 피크가 관찰되었으며, 이는 desacyl ghrelin에 해당하는 것으로 보입니다.이는 펩타이드의 62% 분해를 나타냈습니다. RAPID 혈액 처리는 표준 처리와 비교하여 acyl ghrelin과 desacyl ghrelin의 비율을 개선합니다. RAPID 처리 후, 정상 체중 피험자의 혈액 내 acyl ghrelin 및 desacyl ghrelin 비율은 1:3이었습니다.표준 혈액 처리 후 1~23과 비교했을 때, 식욕부진 및 비만 조건에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다. RAPID 혈액 처리는 표준 처리에 비해 내인성 kisspeptin 혈중 농도를 증가시킵니다.거식증 환자와 정상 체중 피험자 모두에서, RAPID 처리 후의 혈중 내인성 kisspeptin 수치는 표준 처리 방식과 비교하여 유의하게 더 높았습니다. 비만 조건에서는 이러한 차이가 유의미한 수준에 도달하지 않았습니다. 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면, 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 방법은 펩타이드의 예상 농도가 낮거나 그룹 간의 차이가 적을 때 특히 중요합니다. 펩타이드에 대한 일반적인 권장 사항을 제공할 수는 없습니다. 각 펩타이드에 대한 잠재적 이점은 처음에 한 번 테스트해야 합니다.이 기술은 다양한 분야의 연구자들이 내인성 펩타이드 호르몬의 수율과 더 중요한 올바른 분자 형태를 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 영상을 시청하고 나면, 인간의 혈액 처리를 위해 RAPID 방법을 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인간의 혈소판 lysate 성장 요인 풍부한 소스와 세포 배양에서 강력한 보충이다. 이 프로토콜은, 혈소판 풍부 혈장부터 몇 동결 - 해동 사이클을 수행하고 혈소판 조각을 파괴하여 인간의 혈소판 lysate의 큰 수영장을 준비하는 과정을 보여줍니다.

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여기서, 우리는 질량 분광법 기반 정량적 단백질 분석을 위한 자동화된 혈장 단백질 소화 방법을 제시한다. 이 프로토콜에서는 단백질 변성, 감소, 알킬화 및 트립신 소화 반응을 위한 액체 전달 및 배양 단계가 간소화되고 자동화됩니다. 원하는 정밀도로 96웰 플레이트를 준비하는 데는 약 5시간이 걸립니다.

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이 프로토콜은 100% 자가 섬유아세포 배양 시스템에서 세포의 시험관 내 확장을 촉진하기 위해 PRP를 생성하는 장치를 제시합니다.

In Vitro 인간 섬유아세포 확장을 촉진하기 위한 자가 혈소판 풍부 혈장 생산

혈소판 풍부 혈장(PRP)은 말 근골격계 질환의 치료에 사용됩니다. 다양한 기술은 다양한 혈소판 및 백혈구 농도로 PRP를 생성합니다. 이 기사에서는 말의 혈액에서 PRP를 얻는 방법에 대해 설명합니다.

말 혈액에서 혈소판이 풍부한 혈장을 얻는 간단한 이중 원심분리관 방법

저밀도 호중구(LDN)는 여러 질병에서 크게 증가합니다. LDN은 일반적으로 세포 분류를 통해 분리됩니다. 순수하고 실행 가능한 LDN을 얻는 실용적인 방법을 제시합니다. 말초 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 세포를 자성 마이크로비드와 함께 배양한 다음 LDN을 자기 컬럼을 통해 분리합니다.

저밀도 호중구의 효율적인 정제를 위한 신속한 자기-마이크로비드 방법

효과적으로 정화가 자주 필요한 면역 세포 집단의 기능을 연구합니다. 보완 고갈은 고순도와 면역 세포 인구의 격리를위한 신속하고 저렴한 방법입니다.

보완 고갈에 의해 특정 세포 집단의 고갈

배우세요 인간 혈액에서 RAPID 혈액 처리법을 이용해 내인성 펩타이드 호르몬 수율을 높이는 방법을. 이 기법은 정확한 분자 형태 평가와 연구 환경에서의 적용에 탁월합니다.

혈액 처리를위한 빠른 방법은 인간의 혈액에서 혈장 펩타이드 수준의 수율을 증가하는

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