속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

이 실험의 전반적인 목표는 식물 세포벽 다당류를 특성화하는 것입니다. 이 방법은 글루코만난의 구조 및 양을 포함한 식물 세포벽 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 전문 교육이나 값비싼 장비가 필요하지 않다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 겔을 해석하는 데 어려움을 겪을 것이므로 설명된 모든 대조군을 포함하고 이해하는 것이 중요합니다. 알코올 및 용해성 잔류물 또는 AIR은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수확된 식물 재료에서 미리 제조됩니다. 15ml 원심분리기 튜브에 6mg의 AIR를 넣고 물을 1밀리리터당 2mg의 최종 농도로 추가합니다.

균일한 서스펜션을 달성하기 위한 Vortex. 500마이크로그램을 마이크로분리 튜브에 분주합니다. 진공 원심분리기를 사용하여 섭씨 30도에서 밤새 건조 부분 표본을 만듭니다.

효소가 없는 공기 제어를 위한 분취액을 포함한 공기를 실온에서 1시간 동안 1몰로 전처리합니다. 1시간 후 각 튜브에 물 200마이크로리터와 염산 1몰 20마이크로리터를 추가하여 수산화나트륨을 중화합니다. 1 마이크로 리터를 제거하고 종이 pH 표시기 스트립에 얼룩을 만들어 pH가 약 6-7인지 테스트하십시오.

pH 6.0 1몰 암모늄 아세테이트 완충액 50마이크로리터를 추가하고 각 튜브에 총 500마이크로리터의 물을 추가합니다. 이 절차를 시작하려면 미리 결정된 양의 만나나아제를 AIR 부분 표본 및 완충액에 추가합니다. 적절한 negative control과 positive control을 포함합니다.

와류를 일으킨 다음 잠시 회전하여 튜브 바닥에 반응 혼합물을 수집합니다. 섭씨 37도에서 밤새 부드럽게 저어 배양합니다. 다음 날에는 섭씨 95도에서 20분 동안 배양하여 반응을 멈춥니다.

10분 동안 최대 속도로 원심분리기를 사용합니다. 상등액을 저장하고 각 펠릿을 250마이크로리터의 물에 재현탁합니다. 다시 원심분리기를 하고 상층액을 유지하십시오.

두 상층액을 결합하고 섭씨 30도의 진공 원심 분리기에서 약 3시간 동안 건조시킵니다. 유도체화 절차 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 시약을 준비합니다. 0.2 몰 ANTS의 원액을 섭씨 60도까지 가열하여 고체를 완전히 용해시킵니다.

각 샘플에 5마이크로리터의 ANTS, 5마이크로리터의 2-피콜린-보란, 10마이크로리터의 유도체화 완충액을 추가합니다. 짧게 회전하여 튜브 바닥에 모이고 완전히 소용돌이친 다음 다시 짧게 회전합니다. 빛을 차단한 섭씨 37도에서 밤새 샘플을 배양합니다.

다음 날, 섭씨 30도의 진공 원심 분리기에서 약 2시간 동안 샘플을 건조시킵니다. 각 샘플을 올리고당 표준물과 3 몰 요소 100 마이크로 리터에 재현탁합니다. 섭씨 영하 20도에서 보관하고 필요할 때까지 빛으로부터 보호하십시오.

젤 주조 장비의 조립은 브랜드에 따라 다릅니다. 이 시연에 사용된 장비의 경우 1개의 젤은 50밀리리터에 해당합니다. 50ml 원심분리기 튜브에 물 20.2ml, 10x PACE 완충액 5ml, 40%아크릴아미드/비스-아크릴아미드 24.6ml, APS 200마이크로리터 및 TEMED 20마이크로리터를 혼합합니다.

부드럽게 뒤집어 섞이면서 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 혈청학적 피펫 또는 기타 대용량 피펫을 사용하여 분해 젤을 유리판 상단 아래 약 4cm까지 붓습니다. 젤에 이소프로필 알코올을 조심스럽게 바르십시오.

젤이 20-30분 동안 중합되도록 합니다. 맨 위 층을 붓습니다. 압지를 사용하여 여분의 액체를 말리십시오.

다음으로 스태킹 젤을 만듭니다. 15ml 원심분리기 튜브에 물 6.8ml, 10x PACE 완충액 1ml, 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 2.8ml, APS 80마이크로리터 및 TEMED 8마이크로리터를 혼합합니다. 뒤집어서 혼합하고 중합된 분해 겔 위에 오버레이합니다.

빗 이빨 아래에 기포가 갇히지 않도록 빗을 부드럽게 삽입하십시오. 젤이 중합된 후 촉촉한 티슈로 싸서 비닐 랩으로 싸서 필요할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 적재 순서를 추적하고 빗이 제거된 후 우물이 어디에 있는지 식별하는 데 도움이 되도록 영구 마커를 사용하여 유리의 우물 위치에 레이블을 지정합니다.

빗을 제거합니다. 웰을 one-X PACE 버퍼로 채웁니다. 10마이크로리터 마이크로주사기를 사용하여 2마이크로리터의 표준물질과 샘플을 웰에 로드합니다.

샘플을 제대로 실행하지 않는 경향이 있는 가장 바깥쪽 레인을 사용하지 말고 샘플 사이에 빈 레인을 남겨 두십시오. 겔 러닝 장치의 상부 챔버를 조립하고 one-X PACE 버퍼가 들어 있는 냉각된 러닝 탱크에 겔을 넣습니다. 상부 챔버를 one-X PACE 버퍼로 채웁니다.

전원을 켜고 젤을 200볼트에서 30분 동안 실행합니다. 30분 후 1시간 40분 동안 전압을 1, 000볼트로 높입니다. 젤을 빛으로부터 보호하십시오.

먼저 촉촉한 보푸라기가 없는 티슈로 젤 이미징 시스템을 닦아 먼지가 없는지 확인합니다. PACE 탱크에서 젤을 제거하고 젤이 유리판에 있는 동안 잠시 관찰하여 염료 전면이 여전히 젤에 있는지 확인합니다. 쐐기 도구를 사용하여 젤을 열고 젤이 하나의 유리판에 있는 동안 염료 앞면이 젤에 남아 있는 경우 피자 커터를 사용하여 스태킹 젤과 젤 바닥을 모두 제거합니다.

약 5 밀리리터의 물을 transilluminator의 표면에 분배 한 다음 gel을 transilluminator로 직접 옮깁니다. 소프트웨어를 사용하여 필터를 UV 605로 설정하고 장파 UV 투과광기를 켭니다. 다양한 노출 시간으로 여러 이미지를 촬영하고 형광 저하를 방지하기 위해 이미지 사이의 UV 광선을 끄십시오.

두 개 이상의 이미지에 채도 대역이 없는지 확인합니다. 파일을 고해상도 TIFF 이미지로 저장합니다. 세포벽 만난 함량에 대한 표준 PACE 분석의 대표적인 겔이 표시됩니다.

1, 2, 3번 레인은 각각 5, 10, 50 피코몰 농도에서 상업적으로 구매한 올리고당의 사다리를 보여줍니다. 4번째 줄은 효소 및 완충염의 존재 하에서 효소 분해와 유도체화 반응 모두에 대한 양성 대조군 역할을 하는 곤약 글루코만난의 만나나제 분해를 보여줍니다. 5번 열은 야생형 애기장대 줄기의 PACE 지문을 보여줍니다.

6번 줄은 주요 줄기인 만난 합성효소(mannan synthase)가 결핍된 애기장대(Arabidopsis) 식물 줄기의 PACE 지문을 보여줍니다. 야생형과 비교했을 때, 소량의 만난만이 존재하며, 이는 모든 만나나아제 유래 올리고당의 밴드 강도가 감소한 것에서 알 수 있습니다. 10번 열은 갈락토글루코만난을 함유하고 있는 소나무의 PACE 지문을 보여주며, 애기장대와는 확연히 다른 올리고당의 방출 패턴을 가지고 있습니다.

레인 7, 8, 9 및 11은 분석에서 제외해야 하는 별표로 표시된 비특이적 밴드를 나타내는 다양한 음성 대조군입니다. 이 비디오를 시청하고 나면 PACE를 사용하여 만난의 구조를 분석하는 방법을 정말 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 마스터하면 다른 글리코실 가수분해효소를 사용하여 관심 있는 다른 다당류에 적용할 수 있습니다.

우리는 이 기술을 애기장대 외에도 많은 다른 식물 종과 효모 만나난과 같은 다른 비식물 종에 적용하는 데 성공했습니다.