Name: 라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 배우세요 자동 시간 저속 형광 현미경을 사용하여 Bacillus subtilis와 Streptococcus pneumoniae의 단일 세포 성장 및 분열을 실시간으로 관찰하는 방법. 이 기술은 단일 세포 단백질 역학과 세포 행동을 시간에 따라 모니터링할 수 있어 미생물학 연구에 필수적입니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

많은 다른 단일 세포 기술에 대조적으로, 여기에서 설명한 시간 경과 형광 현미경 방법은 그 조상의 행동, 그리고 분열 이벤트에 관한 특정 세포의 역사를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 찬란 표시 대상 발기인 또는 단백질와 함께 구체적인 발달 경로의 활성화는 시간과 단백질 지방화뿐만 아니라 단백질 역학이 박테리아 개발되는 동안 모니터링할 수 있습니다에 따라 수 있습니다. 위에서 표시된 다른 세균 종에 집중 연구는 특정 세균에 대한 요구 사항에 따라 성장 조건을 적응하여 수행할 수 있습니다. 우리가 발생한 유일한 제한은 성장 조건과 샘플의 크기와 관련이 있습니다. 밀폐 환경으로 인해 중간 조건은 실험 기간 동안 변경할 수 없습니다. 또한, 실험 당 4 개의 변종이 최대가 효율적으로 모니터링할 수 있습니다. 몇 가지 중요한 단계를 고려, 단일 세포 분석 방법은 여기에 설명된 쉽게 어떤 자동화된 현미경을 사용하여 적용할 수 있습니다. 다음에서 이러한 중요한 단계의 개요가 주어집니다. 자세한 정보는 주요 텍스트에서 찾을 수 있습니다 일반 준비 사항 :. 그것은 이전 실험 특정 박테리아에 필요한 자동 초점 설정을 확인하는 것이 현명합니다. 가능하면 마찬가지로, 형광의 시각화에 대한 대략적인 최적의 설정은, 사전에 결정되어야합니다. 또한, 준비 시간 라인을 따라하는 것은 시간에 사용할 준비가 모든 자료 (사전 온난, 현미경 챔버를 현미경 설정을 프로그래밍, 세포가 원하는 성장 단계에되기 전에 슬라이드 한 시간 준비를 참조 그림 1)을하는 데 도움이 B.니다. 성장 TLM와 CDM에 subtilis : TLM과 CDM은 화학적으로 기아 미디어를 정의하는 B. subtilis은 천천히 자랍니다. 세포가 언론에서 재배되는 시간 기간은 특정 변형에 따라 연장 될 수도 있습니다. 느린 성장은 서로에 말뚝의 세포를 방지 현미경 샘플의 준비 :. 유전자 프레임, 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이의 공기 방울은 아가로 오스 기반 매체의 광범위한 건조를 방지하기 위해 예방해야합니다. 동일 매체 / 커버 슬립 인터페이스 보유하고 있습니다. 그것은 수영 및 / 또는 여러 계층의 성장을 방지하기 위해, 세포가 충분히 건조하게하는 데있어 매우 중요합니다 시간 경과 형광 현미경 :. 슬라이드뿐만 아니라 환경 챔버 사전 온난 주요 오토포커스 문제를 방지하기 위해 중요합니다. 이들은 실험 (시료가 충분히 건조했습니다 제공) 중 분야와 초점을 유지하기 위해 최고의 기회를 갖고 있기 때문에 세포는 한천 패드의 중간에 선택되어야합니다. 실험 당 10의 위치 최대 여전히 제대로 작동합니다. 선택하는 데 후 관심의 첫 번째 셀은 (자세한 내용은 텍스트를 참조) 초점을 조정하는 소프트웨어를 사용합니다. . 세포가 30 분 간격의 실험 분석의 첫 번째 시간 동안 초점이 아직 있는지 확인하십시오 : 이것은 매체의 배경 형광 채널에서 유사한 가치를 가지고 있는지 사전에 연장 분석 절차를 확인하는 것이 중요합니다. . 작은 먼지 입자, 중간 부품, 더러운 렌즈 또는 작은 아가로 오스의 대단히 짧은 시간 문제 해결을 분석할 수있는 동영상이 어렵거나 불가능하게 만들었 로컬 증가 형광에 기여할 수 세포가 서로의 위에 성장하는 경우,이 중 coverslip가되었음을 나타내고 있습니다 너무 빨리 또는 매체가 microcolony monolayers의 성장에 적합하지 않습니다 첨부. 슬라이드에 다른 세포 행복 나누기 반면 관심 세포가 지속적으로, 일찍 죽으면, 당신은 위치에서 UV - 필터를 넣어 여부를 확인 할 수 있습니다. 또한 오랜 실험 중에 노출 시간이나 빛의 강도를 감소하는 데 도움이 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 진 프레임 </td><td> ABgene </td><td> AB - 0578 </td><td> 1.7 X 2.8 cm </td></tr><tr><td> 고해상도 낮은 용융 아가로 오스 </td><td> 시그마 </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> 큰 커버 슬립 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 24 X 50mm </td></tr><tr><td> 원하는 경우, 멤브레인 염료 예 : FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> 다른 멤브레인 염료도 사용할 수 있습니다 : <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> 환경 챔버와 함께 시간 경과 현미경 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 해당 섹션에있는 장치에 대한 세부 정보를 볼 </td></tr></tbody></table>

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

지난 몇 년 동안 과학자들은 미생물의 인구 기반의 실험에서 얻은 평균 데이터는 단일 세포의 동작, 상태 또는 표현형 대표하지 않는 점차 알게되었습니다. 때문에이 새로운 통찰력 단일 세포 연구의 번호는 (최근 리뷰를 1,2,3 참조) 지속적으로 상승합니다. 그러나, 적용된 단일 세포 기술을 많은 시간에 한 구체적인 하나의 셀 (예 : 유동세포계측법 또는 표준 현미경)의 개발 및 동작을 모니터링 허용하지 않습니다. 여기서 우리는 다음과 녹음 (의 형광) 바실러스 subtilis 많은 세대를위한 성장과 분열을 통해 연쇄상 구균의 pneumoniae의 개별 세균 세포 수있는 몇 가지 최근의 연구 4, 5, 6, 7,에 사용되는 현미경 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 그 결과 영화는 하나의 공통된 조상에서 유래 인구 이내에 단세포의 역사를 다시 추적하여 phylogenetic 가계 나무를 구성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 시간 - 저속 형광 현미경의 방법뿐만 아니라 성장, 분할 및 개별 세포의 분화를 조사뿐만 아니라, 특정 세포의 행동에 세포의 역사와 조상의 효과를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 시간 경과 현미경은 이상적으로 세균 세포주기 동안 유전자 발현 역학 및 단백질 지방화를 검사 적합합니다. 방법은 박테리아 세포를 준비하고 microcolony에 단일 세포의 가지를 사용하는 현미경 슬라이드를 구성하는 방법에 대해 설명합니다. 즉, 하나의 세포들은 성장 온도 제어 환경 챔버 내에서 형광 현미경으로 분리하는 아가로 오스와 보충 성장 매체로 구성된 반 고체 표면에 발견됩니다. 이미지는 특정 간격으로 캡처하고 나중에 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 분석하고 있습니다.

이 프로토콜은 자동 형광 시간 경과 현미경을 사용하여 시간에 다른 박테리아의 단일 세포의 행동을 모니터하기위한 단계별 절차를 제공합니다. 또한, 우리는 어떻게 현미경 이미지를 분석하는 지침을 제공합니다.

지난 몇 년 동안 과학자들은 미생물 집단 기반 실험에서 얻은 평균 데이터가 ...하지 않다는 점을 점점 더 인식하게 되었습니다.

본 절차의 전반적인 목적은 형광 현미경을 사용하여 성장 및 분열 과정 중의 살아있는 세포를 이미지화함으로써, 박테리아의 세포 발달에 세포 이력과 가계가 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 비교적 영양 농도가 높은 액체 배지에서 액체 기아 배지로 세포를 옮김으로써 수행됩니다. 다음으로, 박테리아 세포가 마이크로 콜로니로 성장하게 될 현미경 슬라이드를 준비합니다.단층을 준비합니다. 그런 다음 타임랩스 형광 현미경 영상을 기록합니다. 마지막으로, 영상을 처리하고 데이터를 분석합니다.궁극적으로, 타임랩스 형광 현미경 관찰을 통해 단일 박테리아 세포의 발달 과정을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 유세포 분석이나 표준 현미경 관찰과 같은 기존 기술과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 단일 세포의 단백질 동역학, 세포 행동 및 발달 과정을 시간에 따라 모니터링할 수 있다는 점입니다. 이 과정은 저희 연구실의 박사 과정 학생인 Cone이 시연하겠습니다. B. subtilis를 준비하기 위해, -80 °C 보관 스톡의 세포를 항생제가 필요 시 첨가된 10 mL의 타임랩스 현미경 관찰 또는 TLM 배지가 든 멸균 흔들 플라스크에 접종합니다. 세포를 30 °C, 225 RPM 조건의 멸균 흔들 플라스크에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 세포를 항생제가 없는 예열된 화학적 정의 배지 또는 CDM에 1:10 비율로 희석합니다. B. subtilis 세포를 중기 대수 성장기까지 배양하며, 여기에는 약 4시간이 소요됩니다. 600 nm에서 배양액의 흡광도를 측정하고, 세포를 약 0.035의 A600 농도로 희석합니다.CDM을 사용합니다. 이 OD 값은 타임랩스 현미경 관찰을 위해 세포 간에 적절한 간격을 둔 단일 세포들이 현미경 슬라이드에 점적되도록 보장합니다. 세포가 대수 증식기 중간 단계에 도달하기 한 시간 전에 수행합니다.70% ethanol과 물로 유리 슬라이드 2개를 세척하여 현미경 슬라이드를 준비합니다. 유전자 프레임의 플라스틱 커버 중 하나를 제거하되, 프레임 반대편의 플라스틱 커버가 분해되지 않도록 주의하십시오. 유리 슬라이드 한 개의 중앙에 유전자 프레임을 부착하는데, 먼저 한쪽 면을 붙인 다음 손톱으로 나머지 부분을 안내하여 고정합니다.전자레인지를 사용하여 150 milligrams의 고해상도 저융점 agarose를 녹입니다. 10 milliliters의 CDM 내에서 agarose가 완전히 용해되었는지 확인하여 배경 형광이 발생하는 것을 방지하십시오. 따뜻해진 agarose CDM 500 microliters를 gene frame 중앙에 피펫팅하여, 테두리를 포함한 전체 영역이 완전히 덮이도록 합니다.아가로스(agarose)가 과도하게 마르는 것을 방지하기 위해 빠르게 작업하십시오. 기포가 생기지 않도록 주의하며, Aros CDM이 채워진 유전자 프레임 위에 두 번째 유리 슬라이드를 놓습니다. 아가로스가 충분히 굳을 수 있도록 샌드위치 구조를 4°C에서 45분 동안 수평으로 둡니다.한천이 조심스럽게 응고되면 위쪽 유리를 미끄러지듯 제거합니다. 면도날을 사용하여 박테리아가 성장할 너비 약 5mm의 한천 스트립을 절단합니다. 슬라이드당 최대 3개의 스트립을 사용할 수 있으며, 각 스트립의 양옆은 약 4mm 간격으로 띄워 배치합니다.이 공간들은 Blu 성장에 필수적인 공기를 제공할 것입니다. 유전자 프레임에서 두 번째이자 마지막 플라스틱 커버를 조심스럽게 제거하여 점착면이 드러나게 합니다. agros 패드에 닿지 않도록 상단부터 시작하여, 약 2.5 µL의 액체에 담긴 단일 세포들을 고체 배지 위에 로딩합니다.피펫 팁을 사용하여 슬라이드를 위아래로 기울여 배지가 고르게 퍼지도록 합니다. 유전자 프레임 위에 깨끗한 현미경 커버 글라스를 올려 완전히 밀착시킵니다. 세포가 로딩된 후 손톱을 사용하여 압력을 가합니다.세포가 부유하거나 여러 층으로 성장하는 것을 방지하기 위해 액체가 충분히 마를 때까지 기다리는 것이 매우 중요합니다. 하지만 세포를 너무 오래 건조시키면 마이크로 콜론 단일층(micro cholon monolayer)으로 성장하는 데 문제가 생길 수 있습니다. 따라서 슬라이드를 건조하는 데 필요한 시간은 실험에 따라 다르며 일정하게 측정할 수 없습니다.따라서 당연히 이에 대한 감각을 익혀야 합니다. 타임랩스 실험 초기 단계에서 오토포커스 문제가 발생하는 것을 방지하기 위해, 타임랩스 현미경 관찰을 준비하며 슬라이드를 30 °C에서 1시간 동안 예열하십시오. 환경 챔버는 최소 2시간 동안 예열하십시오. 실험을 시작하기 전, 실험 설정에 맞는 적절한 대물렌즈 필터와 다이크로익 미러를 선택하십시오.장시간 실험 시에는 광원과 시료 사이에 UV 필터를 설치하십시오. 또한, 가능하면 중성 밀도 필터(neutral density filter)를 사용하여 들뜸 광(excitation light)의 일부를 차단함으로써 노출을 최소화하십시오. 구체적인 실험 설정에 따라 실험을 프로그래밍하십시오.실제 실험 전에 특정 컨스트럭트에 필요한 빛의 양과 다른 타임랩스 현미경 또는 박테리아에 대한 자동 초점 설정을 결정하는 것이 바람직합니다. 노출 시간을 단축하고 여기광의 수준을 낮추면 표백과 광독성을 최소화할 수 있습니다. 자동 초점 기능에는 경시경 광원을 사용하십시오. 마지막으로, 준비된 슬라이드를 현미경의 예열된 환경 챔버에 넣고 30 °C에서 단일 세포가 마이크로 콜로니 단층으로 성장하는 것을 모니터링하십시오.성공적인 타임랩스 형광 실험을 수행하면 시야 내에 완전히 위치한 마이크로 콜로니 단층이 생성됩니다. 본 영상의 실험 종료 시점에서 왼쪽은 명시야 영상이며, 오른쪽에서는 형광 영상을 확인할 수 있습니다.일부 세포가 서로 겹쳐서 자라나, 세포의 이력을 정확하게 추적하거나 형광 수준을 올바르게 측정하기 어려운 B Subtles 마이크로 콜로니의 예시입니다. 이 영상을 시청한 후에는 타임랩스 현미경 관찰을 위한 미세 시료 준비 방법과 타임랩스 형광 현미경 관찰 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. BACE 세포를 이용하여 실험하십시오.

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면역학 및 감염학

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Streptomyces venezuelae 수명주기의 형광 타임랩스 이미징

출처: Makowski, Ł. 외 타임랩스 형광 현미경을 이용한 박테리아 포식자 Bdellovibrio bacteriovorus 의 생세포 영상. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 아가로스 패드 아래 고정된 대장균을 포식하는 Bdellovibrio bacteriovorus의 타임랩스 형광 영상을 시연하여, 박테리아 포식 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 있어 세포 내 복제와 자손 방출을 실시간으로 시각화할 수 있게 합니다.

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우리는 박테리아 FtsZ-링의 구조 조직, 세포 분열에 필수적인 장치에 꼽는 영상 방법 수퍼 해상도를 설명합니다. 이 방법은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 이미지의 정량 분석​​에 기반을두고 있으며 다른 세균 cytoskeletal 단백질에 적용 할 수 있습니다.

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배우세요 자동 시간 저속 형광 현미경을 사용하여 Bacillus subtilis와 Streptococcus pneumoniae의 단일 세포 성장 및 분열을 실시간으로 관찰하는 방법. 이 기술은 단일 세포 단백질 역학과 세포 행동을 시간에 따라 모니터링할 수 있어 미생물학 연구에 필수적입니다.

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