라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

본 절차의 전반적인 목적은 형광 현미경을 사용하여 성장 및 분열 과정 중의 살아있는 세포를 이미지화함으로써, 박테리아의 세포 발달에 세포 이력과 가계가 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 비교적 영양 농도가 높은 액체 배지에서 액체 기아 배지로 세포를 옮김으로써 수행됩니다. 다음으로, 박테리아 세포가 마이크로 콜로니로 성장하게 될 현미경 슬라이드를 준비합니다.

단층을 준비합니다. 그런 다음 타임랩스 형광 현미경 영상을 기록합니다. 마지막으로, 영상을 처리하고 데이터를 분석합니다.

궁극적으로, 타임랩스 형광 현미경 관찰을 통해 단일 박테리아 세포의 발달 과정을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 유세포 분석이나 표준 현미경 관찰과 같은 기존 기술과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 단일 세포의 단백질 동역학, 세포 행동 및 발달 과정을 시간에 따라 모니터링할 수 있다는 점입니다. 이 과정은 저희 연구실의 박사 과정 학생인 Cone이 시연하겠습니다. B. subtilis를 준비하기 위해, -80 °C 보관 스톡의 세포를 항생제가 필요 시 첨가된 10 mL의 타임랩스 현미경 관찰 또는 TLM 배지가 든 멸균 흔들 플라스크에 접종합니다. 세포를 30 °C, 225 RPM 조건의 멸균 흔들 플라스크에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 세포를 항생제가 없는 예열된 화학적 정의 배지 또는 CDM에 1:10 비율로 희석합니다. B. subtilis 세포를 중기 대수 성장기까지 배양하며, 여기에는 약 4시간이 소요됩니다. 600 nm에서 배양액의 흡광도를 측정하고, 세포를 약 0.035의 A600 농도로 희석합니다.

CDM을 사용합니다. 이 OD 값은 타임랩스 현미경 관찰을 위해 세포 간에 적절한 간격을 둔 단일 세포들이 현미경 슬라이드에 점적되도록 보장합니다. 세포가 대수 증식기 중간 단계에 도달하기 한 시간 전에 수행합니다.

70% ethanol과 물로 유리 슬라이드 2개를 세척하여 현미경 슬라이드를 준비합니다. 유전자 프레임의 플라스틱 커버 중 하나를 제거하되, 프레임 반대편의 플라스틱 커버가 분해되지 않도록 주의하십시오. 유리 슬라이드 한 개의 중앙에 유전자 프레임을 부착하는데, 먼저 한쪽 면을 붙인 다음 손톱으로 나머지 부분을 안내하여 고정합니다.

전자레인지를 사용하여 150 milligrams의 고해상도 저융점 agarose를 녹입니다. 10 milliliters의 CDM 내에서 agarose가 완전히 용해되었는지 확인하여 배경 형광이 발생하는 것을 방지하십시오. 따뜻해진 agarose CDM 500 microliters를 gene frame 중앙에 피펫팅하여, 테두리를 포함한 전체 영역이 완전히 덮이도록 합니다.

아가로스(agarose)가 과도하게 마르는 것을 방지하기 위해 빠르게 작업하십시오. 기포가 생기지 않도록 주의하며, Aros CDM이 채워진 유전자 프레임 위에 두 번째 유리 슬라이드를 놓습니다. 아가로스가 충분히 굳을 수 있도록 샌드위치 구조를 4°C에서 45분 동안 수평으로 둡니다.

한천이 조심스럽게 응고되면 위쪽 유리를 미끄러지듯 제거합니다. 면도날을 사용하여 박테리아가 성장할 너비 약 5mm의 한천 스트립을 절단합니다. 슬라이드당 최대 3개의 스트립을 사용할 수 있으며, 각 스트립의 양옆은 약 4mm 간격으로 띄워 배치합니다.

이 공간들은 Blu 성장에 필수적인 공기를 제공할 것입니다. 유전자 프레임에서 두 번째이자 마지막 플라스틱 커버를 조심스럽게 제거하여 점착면이 드러나게 합니다. agros 패드에 닿지 않도록 상단부터 시작하여, 약 2.5 µL의 액체에 담긴 단일 세포들을 고체 배지 위에 로딩합니다.

피펫 팁을 사용하여 슬라이드를 위아래로 기울여 배지가 고르게 퍼지도록 합니다. 유전자 프레임 위에 깨끗한 현미경 커버 글라스를 올려 완전히 밀착시킵니다. 세포가 로딩된 후 손톱을 사용하여 압력을 가합니다.

세포가 부유하거나 여러 층으로 성장하는 것을 방지하기 위해 액체가 충분히 마를 때까지 기다리는 것이 매우 중요합니다. 하지만 세포를 너무 오래 건조시키면 마이크로 콜론 단일층(micro cholon monolayer)으로 성장하는 데 문제가 생길 수 있습니다. 따라서 슬라이드를 건조하는 데 필요한 시간은 실험에 따라 다르며 일정하게 측정할 수 없습니다.

따라서 당연히 이에 대한 감각을 익혀야 합니다. 타임랩스 실험 초기 단계에서 오토포커스 문제가 발생하는 것을 방지하기 위해, 타임랩스 현미경 관찰을 준비하며 슬라이드를 30 °C에서 1시간 동안 예열하십시오. 환경 챔버는 최소 2시간 동안 예열하십시오. 실험을 시작하기 전, 실험 설정에 맞는 적절한 대물렌즈 필터와 다이크로익 미러를 선택하십시오.

장시간 실험 시에는 광원과 시료 사이에 UV 필터를 설치하십시오. 또한, 가능하면 중성 밀도 필터(neutral density filter)를 사용하여 들뜸 광(excitation light)의 일부를 차단함으로써 노출을 최소화하십시오. 구체적인 실험 설정에 따라 실험을 프로그래밍하십시오.

실제 실험 전에 특정 컨스트럭트에 필요한 빛의 양과 다른 타임랩스 현미경 또는 박테리아에 대한 자동 초점 설정을 결정하는 것이 바람직합니다. 노출 시간을 단축하고 여기광의 수준을 낮추면 표백과 광독성을 최소화할 수 있습니다. 자동 초점 기능에는 경시경 광원을 사용하십시오. 마지막으로, 준비된 슬라이드를 현미경의 예열된 환경 챔버에 넣고 30 °C에서 단일 세포가 마이크로 콜로니 단층으로 성장하는 것을 모니터링하십시오.

성공적인 타임랩스 형광 실험을 수행하면 시야 내에 완전히 위치한 마이크로 콜로니 단층이 생성됩니다. 본 영상의 실험 종료 시점에서 왼쪽은 명시야 영상이며, 오른쪽에서는 형광 영상을 확인할 수 있습니다.

일부 세포가 서로 겹쳐서 자라나, 세포의 이력을 정확하게 추적하거나 형광 수준을 올바르게 측정하기 어려운 B Subtles 마이크로 콜로니의 예시입니다. 이 영상을 시청한 후에는 타임랩스 현미경 관찰을 위한 미세 시료 준비 방법과 타임랩스 형광 현미경 관찰 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. BACE 세포를 이용하여 실험하십시오.