라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 형광 현미경을 사용하여 성장과 분열을 통해 살아있는 세포를 이미지화하여 박테리아의 세포 발달에 대한 세포 이력과 조상의 영향을 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 먼저 영양소 농도가 상대적으로 높은 액체 배지에서 액체 기아 배지로 세포를 이동시킴으로써 달성됩니다. 다음으로, 박테리아 세포가 마이크로 콜로니로 성장하는 미세한 슬라이드

단층이 준비되어 있습니다. 그런 다음 타임랩스 형광 현미경 검사 동영상을 녹화합니다. 마지막으로 영화가 처리되고 데이터가 분석됩니다.

궁극적으로 타임 랩스 형광 현미경을 통해 단일 박테리아 세포의 발달을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 유세포 분석 및 표준 현미경 검사와 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 단백질 역학, 세포 거동 및 단일 세포의 발달을 적시에 모니터링할 수 있다는 것입니다., 절차가 원뿔에서 이루어질 것임을 입증합니다., 내 연구실의 박사 과정 학생이 섭씨 영하 80도에서 세포를 접종할 준비를 하기 위해, 필요한 경우 항생제를 보충한 멸균 쉐이크 플라스크에 10ml의 타임 랩스 현미경 또는 TLM 배지를 저장하고, 다음 날 아침 멸균 쉐이크 플라스크에서 섭씨 30도 및 225RPM으로 밤새 세포를 성장시켜 항생제 없이 화학적으로 정의된 배지 또는 CDM에서 1에서 10까지 세포를 약탈하고, 꿀벌의 가장 미묘한 세포를 중간 기하급수적 단계로 성장시킵니다. 약 4시간이 걸립니다. 600나노미터에서 배양물의 흡광도를 측정하고 세포를 약 600의 0.035로 희석합니다.

CDM 사용. 이 OD는 타임 랩스 현미경 검사를 위해 세포 사이에 적절한 간격을 둔 단일 세포가 현미경 슬라이드에서 발견되도록 합니다. 세포가 중간 기하급수적 성장에 도달하기 1시간 전.

70% 에탄올과 물로 두 개의 유리 슬라이드를 청소하여 현미경 슬라이드를 준비합니다. 유전자 프레임에서 플라스틱 덮개 중 하나를 제거하되 프레임의 다른 쪽에 있는 플라스틱 덮개가 분해되지 않도록 주의하십시오. 유리 슬라이드 중 하나의 중간에 유전자 프레임을 먼저 한쪽에 붙인 다음 손톱으로 나머지를 안내하여 부착합니다.

전자레인지를 사용하여 150mg의 고해상도, 저융점 아로를 용해시킵니다. 10ml의 CDM에서 aros가 완전히 용해되어 배경 형광을 방지하는지 확인하십시오. 500 마이크로 리터의 따뜻한 agro CDM을 유전자 프레임의 중간에 피펫으로 넣어 테두리를 포함한 전체 영역이 완전히 덮이도

aros의 과도한 건조를 방지하기 위해 신속하게 작업합니다. 두 번째 유리 슬라이드를 Aros CDM으로 채워진 유전자 프레임에 놓고 기포를 피하려고 합니다. 샌드위치를 섭씨 4도의 수평 위치에 45분 동안 놓아 아그로스가 충분히 굳을 수 있도록 합니다.

아로스가 조심스럽게 굳어지면 위쪽 유리를 밀어냅니다. 면도날을 사용하여 박테리아가 자랄 너비가 약 5mm 인 농산물을 잘라냅니다. 슬라이드당 최대 3개의 스트립을 사용할 수 있으며 양쪽에 약 4mm의 공간으로 구분됩니다.

이 공간은 Blu 성장에 필수적인 공기를 제공할 것입니다. 유전자 프레임에서 두 번째와 마지막 플라스틱 덮개를 조심스럽게 제거하여 끈적한 면을 노출시킵니다. 고체 매체에 약 2.5마이크로리터의 액체에 단일 셀을 건드리지 않고 아그로스 패드 상단에서 시작하여 로드합니다.

피펫 팁을 사용하여 슬라이드를 위아래로 기울여 매체가 고르게 퍼지도록 합니다. 유전자 프레임에 깨끗한 현미경 커버를 씌워 커버 슬립을 완전히 부착합니다. 손톱을 사용하여 압력을 가하십시오 그래서 세포가 적재 된 후.

액체가 충분히 마를 때까지 기다렸다가 헤엄치는 세포와 여러 층으로 성장하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 그러나 세포가 너무 오래 건조되면 마이크로 콜론 단층으로 성장하는 데 문제가 있습니다. 따라서 슬라이드를 건조하는 데 필요한 시간은 실험에 따라 다르며 측정할 수 없습니다.

그리고 결과적으로, 당연히 그에 대한 느낌을 얻어야 합니다: 타임랩스 실험의 처음 몇 시간 동안 자동 초점 문제를 방지하기 위해 타임랩스 현미경을 준비하기 위해 섭씨 30도에서 1시간 동안 슬라이드를 예열합니다. 환경 챔버를 최소 2시간 동안 예열합니다. 실험을 시작하기 전에 실험 설정에 따라 적절한 대물렌즈 필터와 다이크로익 미러를 선택하십시오.

긴 실험의 경우 광원과 샘플 사이에 UV 필터가 배치되어 있는지 확인하십시오. 또한 가능한 경우 중성 밀도 필터를 사용하여 여기광의 일부를 차단하여 노출을 최소화하십시오. 특정 실험 설정에 따라 실험을 프로그래밍합니다.

실제 실험에 앞서 특정 구조물에 필요한 빛의 양과 다른 타임랩스 현미경 또는 박테리아에 대한 자동 초점 설정을 결정하는 것이 현명합니다. 노출 시간이 짧고 여기광 수준이 낮으면 표백 및 광독성이 최소화됩니다.자동 초점 기능을 위해 스코픽 라이트를 사용합니다. 마지막으로, 준비된 슬라이드를 현미경의 예열 환경 챔버에 놓고 단일 세포가 섭씨 30도의 마이크로 콜로니 단층으로 성장하는 것을 모니터링합니다.

성공적인 타임 랩스 형광 실험은 시야 내에 완전히 위치한 마이크로 콜로니 단층을 생성합니다. 이 영화의 실험이 끝나면 밝은 필드가 왼쪽에 있고 형광을 볼 수 있습니다. 오른쪽.

다음은 B Subtles 마이크로 콜로니의 예로, 일부 세포가 서로 겹쳐서 성장하여 이력을 정확하게 추적하고 형광 수준을 올바르게 측정하기 어렵게 만듭니다. 이 동영상을 시청한 후에는 타임 랩스 현미경 검사를 위해 현미경 샘플을 성공적으로 준비하는 방법과 타임 랩스 형광 현미경 검사를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. BACE 세포로 실험해 보십시오.