선 유도 및 실험실 방법론

유도 가래 기술은 90년대 초반에 개발되었습니다. 이 기술은 천식, COPD와 같은 폐쇄성 기도 질환에 대한 새로운 정보를 조사하기 위해 제안되었으며, 최근에는 폐 섬유증에 대한 새로운 정보를 살펴보는 데에도 관심이 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 기관지 내시경 검사와 달리 상대적으로 비침습적이라는 것입니다.

이 가공에는 실험실 작업이 필요하고 시간이 걸리기 때문에 상당히 까다롭고 시간이 많이 걸리며 실험실에 대한 전문 지식이 필요하기 때문에 모든 센터에서 얻기 어려운 기술임이 분명합니다. 유도 가래 기술은 두 부분으로 구성되며, 첫 번째 부분은 유도이고 두 번째 부분은 처리입니다. 가래를 유도하기 전에 폐활량 측정을 수행해야 하는데, 이는 환자가 생산할 수 있는 양과 유속을 평가하는 것입니다.

그리고 객담 유도 자체가 기관지 경련을 유발할 수 있기 때문에 환자의 폐활량 측정의 기준선 값을 절대적으로 알아야 합니다. 그래서 우리는 먼저 폐활량 측정을 실시한 다음 환자에게 기관지 확장제를 투여하고 보통 400마이크로그램의 살부타몰을 투여하여 환자의 기도를 최대한 개방하고 유도 단계에서 발생할 수 있는 기관지 경련을 예방합니다. 그리고 15분 후, 폐활량 측정을 다시 측정하여 폐활량 측정의 기준선 값이라고 부르는 것을 얻고, 특히 환자가 1초 이내에 내쉴 수 있는 부피인 FEV1을 확인합니다.

증류수를 권장 수준까지 분무기 챔버에 붓습니다. 분무기 챔버에 깨끗한 컵을 놓습니다. 채워진 뚜껑을 적절한 뚜껑으로 덮습니다.

기관지 확장제 후 FEV1이 예측된 65%보다 큰 경우 50mL의 긴장 식염수 5%를 컵에 채우고, 기관지 확장제 후 FEV1이 예측된 65% 미만인 경우 50mL의 등장성 식염수 9%를 채웁니다. 컵에 ml당 5 밀리그램의 농도에 1.75 salbutamol 황산염 해결책을 추가하십시오. 제조업체 지침에 따라 튜브와 밸브를 연결하십시오.

이 기술은 의사의 감독 하에 수행되어야 합니다. 환자에게 검사의 원리를 설명합니다. 환자에게 코 클립을 사용하도록 요청하십시오.

분무기를 시작하고 가장 낮은 수준의 에어로졸 및 팬 설정을 선택합니다. 환자에게 조수 호흡과 함께 마우스피스를 통해 에어로졸을 흡입하도록 요청합니다. 에어로졸 및 팬 설정의 수준은 환자의 내성에 따라 증가할 수 있습니다.

흉부 압박감이 호흡기 불편감으로 느껴지는 경우, 시술을 중단하고 폐활량 측정을 실시하여 환자의 FEV1 수치를 측정하십시오. 5분 동안 숨을 들이마신 후 또는 기침이나 메스꺼움이 있는 경우 분무기를 중지하십시오. 환자에게 코 클립을 제거하고 입을 헹구고 수돗물로 두 번 가글을 한 다음 이 물을 싱크대에 버리도록 요청하십시오.

그런 다음 환자가 가래를 기침하고 목구멍에서 나오는 것을 플라스틱 용기에 뱉습니다. FEV1을 측정하기 위해 첫 번째 호흡 조작을 수행합니다. 가래 생성의 각 잠정 후에, 우리는 FEV1 값을 측정합니다.

FEV1 값이 20% 이상 떨어지면 시술을 중단하고 환자에게 항콜린제인 이프라트로퓸 브로마이드를 분무하여 시술 중에 이미 투여한 베타 2 작용제와 함께 작용합니다. FEV1 값이 20% 이상 떨어지지 않으면 환자가 생성하는 가래의 질과 양에 따라 총 10-20분 동안 시술을 진행합니다. 가래 샘플을 얻으면 가공할 때까지 냉장고에 보관하십시오.

따라서 두 번째 부분은 가래 처리로 구성되며, 이를 위해 먼저 이 처리에 사용할 두 가지 솔루션을 준비해야 합니다. 그래서 우리는 DTT라고도 알려진 Dithiothreitol을 준비해야 합니다. 용액은 6.5 밀리몰 용액을 얻기 위해 DTT를 멸균수로 희석하여 준비해야 합니다.

따라서 DTT를 주변 공기에 노출시키지 않아야 하며 이를 위해 주사기와 바늘을 사용합니다. 둘째, 트리판 블루 용액을 준비해야 하며, 이를 위해 DPBS를 트리판 블루로 희석하여 0.08%의 용액을 얻어야 합니다.따라서 가래에 관해서는 50mL 원뿔형 바닥 플라스틱 튜브에 가래 전체를 옮기고 샘플의 무게를 측정해야 합니다. DPBS 용액의 3배 무게를 추가합니다.

30초 동안 샘플을 천천히 소용돌이치고 섭씨 4도에서 10분 동안 800g으로 원심분리합니다. 두 개의 단일 멸균 거즈를 통해 여과한 후 50mL 원뿔형 바닥 플라스틱 튜브에 상층액을 수집합니다. 2mL 플라스틱 튜브에 상등액을 할당하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

상등액 샘플은 가래의 3상 성분으로 유용합니다. 셀 팰릿 부피가 5mL 미만인 경우 DPBS를 추가하여 5mL 부피의 세포 현탁액에 도달합니다. 세포 현탁액을 6.5 millimolar에서 1 부피의 DTT로 희석합니다.

벤치 작업자와 함께 실온에서 20분 동안 세포 현탁액을 흔듭니다. DPBS로 세포 현탁액을 최소 3회 희석합니다. 희석된 세포 현탁액을 550g에서 섭씨 4도에서 10분간 원심분리합니다.

상등액을 버리십시오. 약 1ml DPBS에서 셀 팔레트를 일시 중단합니다. 세포 현탁액의 정확한 부피를 평가하고 기록합니다.

50 μl의 세포 현탁액을 50 μlit의 희석된 trypan blue 용액에 첨가하고 균질화합니다. 샘플을 hemocil cytometer의 커버 슬립 아래에 놓고 광학 현미경 아래에 놓습니다. 세포 현탁액의 세포 농도, 편평 세포의 비율 및 비편평 세포의 생존율 비율을 평가합니다.

DPBS로 현탁액 할당을 희석하여 mL당 500, 000 세포에서 최소 350마이크로리터의 세포 현탁액을 얻습니다. 제조업체 지침에 따라 cell concentrator를 조립합니다. cell concentrator의 3개 compartment 각각에 100μl의 cell suspension을 추가합니다.

세포 원심분리기에서 실온에서 150g으로 2분간 돌립니다. 상등액을 버리십시오. 슬라이드를 자연 건조시키십시오.

제조업체 지침에 따라 div quick 또는 니켈 원자가 염색 키트로 슬라이드를 염색하십시오. 장착 매체와 커버 슬립으로 장착합니다. 오일 침지와 함께 광학 현미경 아래에 슬라이드를 놓습니다.

최소 500개의 비편평 세포, 호중구, 호산구, 대식세포, 림프구 및 상피 세포를 세고 절대값과 백분율 및 세포 유형을 기록합니다. 결과와 관련하여, 혈구계를 사용하여 착색되지 않은 살아있는 비편평 세포를 세어야 합니다. 또한 파란색으로 표시된 죽은 비편평 세포

그리고 편평 세포. 이 세포는 입에서 나오는 상피 세포입니다. 그들은 크기 때문에 작은 인간 세포에 비해 쉽게 알아볼 수 있습니다.

따라서 박테리아, 효모 또는 스크랩을 세는 것도 피해야 합니다. 세포 현탁액에 편평 세포가 80% 이상 포함되어 있는 경우 이 샘플은 품질이 좋지 않고 사이토스핀 슬라이드에 적합하지 않은 것으로 간주됩니다. 따라서 이 샘플은 실패한 것으로 간주됩니다.

염색된 사이토스핀(cytospin)에 대한 계수는 세포의 색상과 형태에 따라 수행됩니다. 호중구의 주요 특징은 세포를 쉽게 식별할 수 있도록 하는 다엽 핵입니다. 이 세포는 둥글고 작으며 중성 분홍색으로 착색되어 있습니다.

호산구, 이 세포는 붉은 과립으로 구성되어 있어 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 세포의 크기는 호중구에 가깝습니다. 대식세포는 호중구보다 2배에서 5배 더 크며 파란색으로 착색되어 있습니다.

세포질에는 파편과 액포가 포함될 수 있습니다. 림프구인 이 세포는 둥글고 작으며 파란색을 띠고 크고 조밀한 핵을 가지고 있습니다. 상피 세포는 원주 모양을 가지고 있으며 분홍색으로 착색되어 있으며 종종 상단에 섬모가 있습니다.

다음은 편평 세포가 80% 이상인 판독할 수 없는 사이토스핀 샘플의 몇 가지 예입니다. 매우 유용한 기술이라고 생각하지만 객담 유도는 의사의 감독 하에 이루어져야 하기 때문에 매우 조심해야 하지만 객담 유도 기술은 기도에 있는 환자의 염증 상태에 대한 많은 정보를 제공합니다. 이를 통해 상층액에서 다양한 생화학적 마커를 측정할 수 있으며 세포 부분에서도 다양한 것을 측정할 수 있으므로 유도 객담을 통해 유세포 분석, 단백질체학, 전사체학 및 유전체학을 수행할 수 있습니다.