Name: 선 유도 및 실험실 방법론 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 배우세요 천식과 COPD 등 호흡기 질환 연구를 위한 비침습적 객담 유도법 및 세포 분석 처리 기술입니다. 이 방법은 기도 염증 상태를 평가하고 다양한 생화학 마커를 측정할 수 있습니다.

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이 작품은 대학 병원의 리 (추 리)에 의해 지원 되었다. 우리는 비디오 제작에 대 한 "순간 프로덕션" 인정합니다. 우리는 또한 세 드 릭 프랑수아, 영화에 등장 하는 환자를 인정 합니다.

이 섹션에 설명 된 모든 방법을 리 대학 병원의 윤리 위원회에 의해 승인 되 고 모든 건강 한 과목 참여에 대 한 서 면된 동의 주었다.
1. 선 유도
<ol>
	<li>사전 및 사후 bronchodilator spirometry
	<ol>
		<li>spirometry 수행 (강제로 내쉬는 숨의 볼륨 1 초 [FEV1] 및 강제 중요 한 용량 [FVC] 책략) 미국 흉부 학회 (ATS)에 따르면 / 유럽 호흡기 학회 (ERS) 표준 기준12.</li>
		<li>스페이서 장치를 통해 흡입된 salbutamol의 400 µ g metered 복용량 흡입기 (MDI)에서 관리 합니다. 참고: 성인에서 salbutamol 흡입된의 부작용 떨림 및 심 박 급진13포함.</li>
		<li>반복 spirometry (FEV1 과 FVC 책략) 15 분 후,12의 ATS/ERS 표준 기준 따라 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>초음파 분무기의 준비 참고:는 분무기 해야 합니다 철저 하 게 청소 되며, 제조업체의 지침에 따라 각 사용 하기 전에 소독.<ol>
		<li>권장된 수준까지 증류수로 분무기 챔버를 채우십시오.</li>
		<li>분무기 챔버에 깨끗 한 컵을 넣습니다.</li>
		<li>적절 한 뚜껑 컵 커버.</li>
		<li>후 bronchodilator FEV1 환자에 대 한 고 식 염 수 (5%)의 중 50 mL 컵 채우기 &#62; 65% 예측 또는 예측 후 bronchodilator FEV1≤65 %는 환자에 대 한 isotonic 식 염 수 (0.9%)의 50 mL.</li>
		<li>Salbutamol 황산 솔루션 (5 mg/mL)의 1.75 mL 컵을 추가 합니다.</li>
		<li>튜브와 밸브 제조업체의 지침에 따라 연결 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nebulization 및가 래 컬렉션 참고: 의료 감독 기법을 수행 합니다.<ol>
		<li>환자에 게 절차를 설명 합니다.</li>
		<li>코 클립을 사용 하 여 환자를 부탁 드립니다.</li>
		<li>는 분무기를 돌려 고 졸 및 팬 설정의 최저 수준을 선택 합니다.</li>
		<li>5 분 간만 호흡과 입 조각을 통해에 어로 졸을 흡입 환자를 부탁 드립니다. 참고:에 어로 졸 및 팬 설정 환자의 허용 오차에 따라 증가 수 있습니다.<ol>
			<li>참을 수 없는 기침 또는 구역 질, 절차를 중단 하 고 1.3.5 단계로 이동 합니다.</li>
			<li>가슴 답 답, 호흡 불편 경우 1.3.8 단계로 이동 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>분무기를 해제 합니다.</li>
		<li>코 클립을 제거, 그의 입을 물으로 헹 구 고 싱크대에 그것을 삭제 하기 전에 두 번 양치질을 환자를 부탁 드립니다. 참고: 타 액 셀이 래 샘플을 오염 하 고 사용할 샘플 이어질 수 있습니다.</li>
		<li>플라스틱 용기에가 래를 기침 환자를 부탁 드립니다.</li>
		<li>FEV1측정 spirometry (강제로 내쉬는 숨 작전)을 수행 합니다.</li>
		<li>FEV1 가 다음과 같이 평가: (FEV1 단계 3.8 [mL]에서 측정)-(후 bronchodilator FEV1 단계 1.3 [mL]에서 측정) / (후 bronchodilator FEV1 측정 단계 1.3 [mL]) * 100.<ol>
			<li>FEV1 사후 bronchodilator 값에서 20% 이상 떨어지면, 절차를 중단 합니다. FEV1 다시 10 분 후 측정 합니다. 만약 FEV1 nebulized ipratropium 브 로마 이드 (0.25 mg/2 mL)를 관리 하 고 유지 의료 관찰 아래 환자를 의사에 게 20% 이상 떨어진다. 1.3.10 단계로 이동 합니다.</li>
			<li>FEV1 사후 bronchodilator 값에서 20% 이상 떨어지지 않는다, 반복 단계 3.2 3.9 1 ~ 3 배 10 ~ 20 분의 총 nebulization 시간에 도달. 참고: 총 nebulization 시간 품질 (플러그 또는 점성 부품의 존재)와 래 샘플의 수량에 따라 달라 집니다. 경우 샘플 품질 또는 수량 가난한 nebulization의 10 분 후, 15 ~ 20 분의 총 nebulization 시간 도달 하 절차를 확장 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>가 래 샘플을 처리까지 냉장 하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.가 래 처리
참고: 최적의 세포 생존 능력에 대 한 샘플링의 3 시간 안에가 래를 처리 합니다.
주의: 연구실 코트, 보호 장갑 및 고글을 착용.
<ol>
	<li>사전 준비
	<ol>
		<li>제조업체의 지침에 따라 6.5 m m 솔루션의 10 mL를 무 균 증류수와 집중된 dithiothreitol 솔루션 (mucolytic 에이전트)의 10 희석을 확인 합니다. 참고: 방지 하기 위해 주변 공기를 혼합 하는 집중된 dithiothreitol 솔루션, 솔루션에서에서 철수 유리병 멸 균 주사기와 바늘. 일단, 집중된 솔루션 유리병은 실 온에서 보관 고 5 일 이내에 사용 해야 합니다. 희석된의 솔루션은 매일 준비 하 고 있다. 주의: 눈과 피부 자극 위험 때문에 보호 장비 (의류, 장갑, 고글) 착용.</li>
		<li>Trypan 블루 솔루션 (0.4%)의 5 희석와 Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 (DPBS) 0.08% 솔루션을 확인 합니다. 실 온에서이 희석된 솔루션을 유지 하 고 2 주 이내 사용. 주의: 발암 위험 때문에 보호 장비 (의류, 장갑, 고글) 착용.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>가 래 상쾌한의 컬렉션
	<ol>
		<li>50 mL 원뿔 하단 플라스틱 튜브에 전체 선 전송 및 샘플 무게.</li>
		<li>DPBS 솔루션의 3 무게를 추가 합니다.</li>
		<li>천천히 소용돌이 샘플 30 s.</li>
		<li>원심 분리기 800 x g와 4 ° C 10 분.</li>
		<li>멸 균 거 즈의 2 단일 레이어를 통해 샘플을 필터링 하 고 상쾌한 50 mL 원뿔 바닥에 플라스틱 튜브에서를 수집.</li>
		<li>Aliquot 2 mL 플라스틱에서 상쾌한 튜브 및-80 ° c.에서 그들을 저장합니다 참고: 표면에 뜨는 샘플은가 래 액체 단계 구성 요소 시험에 유용.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>가 래 Mucolysis
	<ol>
		<li>필요한 경우, 세포 현 탁 액 5 ml의 총 볼륨에 연결할 셀 펠 릿을 DPBS를 추가 합니다.</li>
		<li>6.5 m m dithiothreitol의 1 볼륨 세포 현 탁 액을 희석. 벤치 로커를 사용 하 여 실 온에서 20 분 동안 세포 현 탁 액을 바위.<ol>
			<li>DPBS와 3 번 이상 반복 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>G와 10 분 동안 4 ° C x 550에 희석된 세포 현 탁 액 원심</li></ol></li></ol>폐기는 상쾌한.
		<li>약 1 ml DPBS의 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	
	
	<li>Hemocytometer 수가 래 샘플 (셀 농도 편평 세포 오염, Trypan 블루 제외 방법으로 생존)의 질적 속성의 평가
	<ol>
		<li>평가 하 고 셀 서 스 펜 션의 정확한 볼륨을 기록.</li>
		<li>0.08 %trypan 블루 솔루션의 50 µ L에 세포 현 탁 액의 50 µ L을 추가 하 고 균질.</li>
		<li>Hemocytometer (Thoma 챔버)의 coverslip 아래 샘플을 넣어 하 고 광학 현미경 (400 X) 두십시오.</li>
		<li>계산 편평 세포, 생활 비 편평 상피 세포 (질된 세포), 그리고 죽은 비 편평 상피 세포 (블루 색 셀). 참고: 너무 낮게 또는 너무 높은 세포 밀도 경우 집중 또는 세포 현 탁 액을 희석 하 고 반복 단계 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>정지, 편평 세포의 비율 및 비 편평 세포의 생존 능력의 비율의 세포 농도 평가 합니다. 참고: 계산가 래의 총 비 편평 세포 수/g: 세포 현 탁 액 (단계 5.4)의 농도 * 볼륨 세포 현 탁 액 (단계 4.8)의 * 비 편평 세포의 % 무게 /가 래 샘플 (2.2.1 단계)의.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>필요한 경우 세포 현 탁 액 및 잔여 세포의 저장과 준비의 얼룩진된 cytospin 슬라이드 참고: 세포 현 탁 액 포함 80% 이상이 편평 세포, 샘플 간주 됩니다 가난한 품질과 cytospin 슬라이드14를 위해 부적 한. 이 경우, 처리를 중단 하 고이 샘플 실패 고려.<ol>
		<li>500, 000 셀/mL에 세포 현 탁 액의 적어도 350 µ L를 DPBS와 세포 현 탁 액의 약 수를 희석.</li>
		<li>조립 셀 집중 장치 제조업체의 지침에 따라.</li>
		<li>이 세포 현 탁 액의 100 µ L 셀 집중의 3 구획의 각각을 채우십시오.</li>
		<li>Cytocentrifuge에서 150 x g 및 실 온에서 2 분 동안 회전. supernatants 삭제 합니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 셀 집중 분해.</li>
		<li>건조 공기를 허용 합니다. 참고:이 단계에서 잔여 세포 저장할 수 있습니다 적절 한 버퍼에 추가 실험을 위해 필요한 경우.</li>
		<li>얼룩 상업 얼룩과 슬라이드 키트 ( 테이블의 자료를 참조), 제조업체의 지침에 따라.</li>
		<li>적합 한 장착 매체와 커버 슬립 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
		<li>기름 침수와 광학 현미경 (600 X) 슬라이드를 놓습니다.</li>
		<li>적어도 500 편평 비 셀: 호 중구, 호 산 구는, 대 식 세포, 림프 톨, 그리고 상피 세포. 참고: 차동 세포 수는 일반적으로 단 하나에 의해 수행 또는 2 전용 interobserver 불일치를 제한 하는 관찰자 훈련.</li>
		<li>레코드의 절대 값 및 각 셀의 비율을 입력합니다.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum+cell+counts%3A+their+usefulness+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice.</a> European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).</li>
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저자는 공개 없다.

유도 선 방법은 기도 구획을 공부 하는 유용한 도구입니다. 이 기술의 몇 가지 가능한 응용 프로그램을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 그것은 면역 세포와 다양 한 호흡기 질환에 관련 된 메커니즘에 대 한 지식을 높일 수 있습니다. 예를 들어,이 기술은 환자의 큰 동료에서 기도 염증의 조사를 허용 했다 그리고 천식 환자의 절반 정도는 비정상적인 기도 감염은 염증15, 특징은 보여왔다 16 , 17, COPD 환자는 일반적으로 올려진된 선 neutrophil 전시 하는 동안18세. 이 기술은 특 발성 폐 섬유 증 환자에서 기도 염증의 더 나은 특성 및 증거 중재자가 병19에 기여할 수에 기여 했다. 둘째, 유도 된가 래의 기술 치료 반응 예측을 유용할 수 있습니다. 예를 들어가 래 호 산 구는의 비정상적인 비율의 존재 코르 티 코 스테로이드 반응성11,18의 예측 마커 되도록 표시 되었습니다. 천식 및 COPD가 래 호 산 구는의 비율을 정상화 코르 티 코 스테로이드의 복용량을 조정 표시 했다11 현재 임상 지침에 따라 치료 조정 보다 exacerbations의 수를 감소에 더 효과적 ,,2021. 셋째, 선 분석 표적으로 한 치료를 개발 하는 데 도움이 있습니다. 예를 들어가 래 COPD와 일부 천식 환자에서 호 중구의 비정상적인 수의 존재 antineutrophilic 치료11의 개발을 주도하 고 있다. 넷째, 기술 진단에 한 역할을 재생할 수 있습니다. 예를 들어가 래 eosinophilia의 존재 비 천식 감염은 기관지염11의 진단을 만들 필요가 있다.
차동 셀 개수 구하기, 외 선 유도의 기술 또한 표면에 뜨는 래 또는 래 세포를 공부 하 여 많은 추가 분석의 성능 수 있습니다. 표면에 뜨는 래와 예로 중재자8,,1922 의 분석 및 호 산 구는22에 대 한 샘플의 혈 활동의 평가 있습니다. 가 래 세포에서 RNA를 추출 수 및 예측에 관한 사용 또는 유전자 발현 분석19,23 . 가 래 셀 흐름 cytometry9,23 사람들과 immunophenotyping 및 셀 정렬 허용 하 여 분석할 수 있습니다. 또한,가 래 세포 배양된10, 수 그리고 그들의 중재자 생산 측정 된 생체 외에서24를 수 있습니다. 이 경우에 지적 가치가 있다, 중재자 콘텐츠는 무엇에서 찾을 수 있습니다 선 표면에 뜨는 다릅니다. 실제로, 표면에 뜨는 래에 중재자 기도 주민 세포에서 분 비 물에 의해 및 플라즈마 나옴가 래 세포 문화 모델24반대에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 마지막으로, immunocytochemistry와 제자리에서 교 잡도 수행할 수 있습니다가 래 세포7를 사용 하 여.
유도 선 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 감 응 작용은 의료 감독 하에 수행 되어야 합니다. 또한 환자에 게 철저 한 지침 연산자에 대 한 필수적 이다. 호흡 노력 필요에 따라 다른 한계는 협력 및 환자의 건강 상태를 포함 합니다. 아이 들에 있는이 기술의 타당성에 관한 여러 연구 결과 그것이 성공적이 고 6 세25이상의 어린이 안전 보고 있다. 자식에는 데이터 &#60; 나이의 6 년25, 부족 하지만 선 유도 그 아이 들14에서 수행 하기 어려운. 기술은 현재 연구 서비스 및 전문된 센터 때문에 기술적으로 까다로운, 시간이 걸리는, 그것은 훈련된 한 직원1필요 제한 됩니다. 또 다른 한계 선 유도 및 분석의 기술 항상 성공, 읽을 수 있는 cytospin는 항상26을 취득 하지 의미 하지는 않다는 것입니다. 그러나, 성공률은 일반적으로 80% 환자4,26,27,,2829의 다른 동료에 약. 마지막으로, 환자의 래 셀 수30,31영향을 같이 했다 나이 일치에 관한 다른 동료를 비교할 때 주의 촬영 해야 합니다. 마찬가지로, 성별 및 담배 습관 같은 다른 매개 변수 또한가 래 셀 수29,32방해할 수로 일치 해야 합니다. 환자 일치 하는 것은 불가능 하다, 나이, 성별, 흡연 상태 고려해 야 하는 또 다른 방법은 이러한 특성에 대 한 통계 분석을 조정입니다.
생체 검사와 bronchoalveolar lavages, 같은 항공에서 세포를 수집을 허용 하는 다른 기술에 비해 유도 선 방법 간단한, 잘 용납, 안전, 재현성, 비용, 및 비-침략 적 되 고의 이점이 있다. 이러한 장점을 수행 할 큰 규모에서 반복적으로 시간이 지남에, 유도 선 기술을 허용 하 고 기도 샘플링에 대 한 선택의 대안. Bronchosorption 기도 중재자33평가 점 막 내벽 액체의 수집을 허용 하는 다른 기술입니다. 이 기술은 (필요한 상계) 유도 래 보다 더 많은 침략 하는 동안 타 액과 어떤 오염 든 지 고 bronchoalveolar 게33보다 중재자의 높은 농도 얻기의 이점이 있다.
중요 한 단계는 프로토콜에 주의가 필요합니다. 첫째, 주의 이러한 두 개의 매개 변수는 결과 영향을 미칠 수 있기 때문에 그러므로 표준화 된34,35를 해야 염 분 농도 유도 시간에 관한 촬영 해야 합니다. 둘째, DTT와 mucolysis는 처리의 중요 한 단계 이다. PBS, 비교 DTT가 래 셀7, cytopsin 슬라이드 품질을 향상 하 고 재현할 수 셀 카운트2필수적입니다 더 나은 분산 표시 했다. 그러나, mucolytic 에이전트는 생 화 확 적인 부품의 측정을 방해할 수 있습니다.급상승 실험 다음 수행 되어야 한다 새로운 생 화 확 적인 화합물36를 측정 하는 경우. 마지막으로, 프로시저의 또 다른 중요 한 단계는 안정적이 고 해석할 결과 숙련 된 기술자에 의해 수행 해야 단계를 계산 하는 셀입니다.
전체 선 대신가 래 플러그 (점성 또는 밀도 부품)를 사용 하 여 다른 방법 또한 문학7에 설명 되어 있습니다. 두 방식 모두 장단점이 있다. 전체 선 기술은 더 빠른7, 처리 수 수 하지만 자주 타 액 샘플을 dilutes cytospins2,7의 품질을 줄일 수 있으며 오염 된. 플러그 선택 기법으로 타 액 오염 감소, 즉 그 샘플 들은 액체 단계 중재자의 복용량에 대 한 고 cytospin 슬라이드7에 대 한 더 나은 품질의. 그러나 처리는 더 이상7 하 고 선택한 플러그 전체 샘플37의 대표 되지 않을 수 있습니다. 그것은 또한 모든 샘플 제한 될 수 있습니다 플러그 포함 지적 가치입니다. 두 방법 모두는 검증 되 고 재현, 그리고 현재는 이러한 두 방법에서 얻은 차동 셀 카운트는 다른14,38증거.
미래에, 유도 선 조사, 진단, 및 염증 성 호흡기 질환의 모든 종류의 관리에 대 한 바이오 마커를 제공 하기 위해 임상 도구로 사용 될 수 있습니다.

여러 가지 방법을 조사 기도 염증에 사용 됩니다: 직접 측정 (예: 기관지 생 검 또는 bronchoalveolar lavages)와 간접 방법 (증상 평가, 같은 혈액 샘플 분석 및 폐 기능 검사)1. 직접 기술을 안정적으로 평가 하는 기도 염증의 이점이 있다 하지만 그들은 침략과 가능 하지에 대규모 환자 불편 때문에 고 위험 발생1. 간접적인 방법에 관해서는 그들은 제대로 기도 염증1의 직접 평가와 연관.
가 래 컬렉션 기도에서 샘플 셀에 다른 방법 이며, 기도 염증의 직접적인 평가 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 자발적으로 래를 생산 품질의 샘플을 이어질 수 있습니다 그리고 모든 환자2불가능. 가 래 생산2유도 하 초음파 nebulized 마 식 염 수를 사용 하 여이 문제를 극복 되었습니다 했다. 이 메서드와 Pneumocystis carinii 폐 렴3 의 진단을 위한 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염 환자에서 처음 사용 되었다 건강 한 과목과 19924천식에 대 한 적응 했다. 가 래 유도 또한 isotonic 식 염 수5를 사용 하 여 더 심한 환자에서 가능 합니다. 비록 일반적으로 잘 용납 하 고, 염 분의 흡입 hyperresponsive 항공5환자의 bronchospasm을 발생할 수 있습니다. 따라서, 절차1전에 짧은 행동 beta 주 작동 근을 관리 하는 것이 좋습니다. 또한, 우리는 이전 것이 위험6감소 더 salbutamol 초음파 분무기에 소금물을 추가 보여주었다. 선 유도의 장점 그것은 비 침략 적2 5촬영 때 적절 한 안전 예방 조치 이다.
가 래 샘플 처리에 대 한 두 가지 방법에서에서 현재 사용 문학: 전체 선 기술과 플러그 선택7. 우리의 실험실에서 전체 선 기술 수행 됩니다. 선 처리의 기본 목적은 염증 기도 루멘에의 종류 공부 차동 세포 수를 얻을 것입니다. 그러나, 많은 추가 분석 추가 선 표면에 뜨는8 에서 중재자를 공부 하거나가 래 셀에 자세한 조사를 수행 하 여 염증 성 프로세스와 면역 메커니즘을 조사 수 있습니다 (예: , flow cytometry9, 셀 문화10, 유전체학10, proteomics10, immunocytochemistry7, 제자리 교 잡7, 등)
선 유도 및 분석의 기법 때문에 기술적으로 까다로운, 시간이 걸리는, 훈련된 직원1필요 서비스 및 임상 연습에서 전문화 된 센터를 현재 제한 됩니다. 기도 염증과 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 만성 기침, 또는 특 발성 폐 섬유 증11같은 다양 한 호흡기 질환에 대 한이 방법으로 조사 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>폐량계 - Spirobank</td><td>MIR France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol MDI - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0135-913</td><td>국가에서 사용 가능한 약물 참조</td></tr><tr><td>Nebulizer UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>UltraNeb U3000</td><td></td></tr><tr><td>Devilbiss UltraNeb 일회용 컵 & 뚜껑</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>100HD-647</td><td></td></tr><tr><td>DeVilbiss 세균 필터 UltraNeb 네뷸라이저용</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>1001005879</td><td></td></tr><tr><td>단방향 밸브</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41664</td><td></td></tr><tr><td>단방향 밸브</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41665</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 T-커넥터&nbsp;</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41077</td><td></td></tr><tr><td>환기 회로 모노브랜치 골판지</td><td>Int'Air Medical France</td><td>TA30A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5 %&nbsp;</td><td>우리</td><td></td> <td>병원 약국</td></tr><tr><td>Mini-Plasco NaCl 0.9%</td><td>B.Braun Medical에서 생산&nbsp; Diegem 벨기에</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0094-987</td><td>국가에서 사용 가능한 약물 참조</td></tr><tr><td>Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent</td><td>Boehringer Ingelheim Germany</td><td>CNK: 1543-305</td><td>해당 국가에서 사용 가능한 약물 참조</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>LONZA 벨기에</td><td>BE17512F</td><td></td></tr><tr><td>Sputolysin 시약</td><td>Calbiochem</td><td>56000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4% 용액 100 mL</td><td>LONZA Bio Whittaker Belgium</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>혈구계 - Thoma chamber</td><td>Labor Optik Lancing UK</td><td>1500000</td><td></td></tr><tr><td>Hemacolor Stainig set</td><td>Merck Belgium</td><td>1116610001</td><td>Alternative product&nbsp; : Diff Quik Staining Set &nbsp; 메디온 진단&nbsp;</td></tr><tr><td>장착 매체 - Entellan</td><td>Merck Belgium</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Statspin Cytofuge 12&nbsp;</td><td>벡크만쿨터 벨기에</td><td>X00-003066-001</td><td></td></tr></tbody></table>

선 유도 및 실험실 방법론

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

선 유도 및 처리의 기술 수집 및 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 같은 다양 한 호흡기 질환에 흥미 롭 기도에서 세포의 분석을 수 있도록 인식된 비-침략 적 방법입니다. 만성 기침, 또는 특 발성 폐 섬유 증입니다. 이 기술은 잘 용납 하 고, 안전 하 고 비-침략 적, 하지만 현재 연구 서비스 및 전문된 센터 임상 연습에서 기술적으로 까다로운, 소모, 그리고 숙련 된 직원을 필요로 하기 때문에. 선 유도 및 분석의 성공률은 약 80%.
여기, 우리는 래 샘플의 유도 및 실험실 처리를 설명합니다. 가 래는 salbutamol와 마 또는 isotonic 식 염 수의 흡입에 의해 유발 됩니다. 처리를 위해 전체 선 기술을 사용 하 고. Dithiothreitol (DTT)는가 래 샘플의 mucolysis를 허용 하는 데 사용 됩니다. 가 래 처리의 기본 목적은 기도 루멘에 셀 유형을 공부 하 차동 세포 수를 얻을 것입니다. 추가 분석은 또한 표면에 뜨는 래과가 래 세포, 염증 성 프로세스와 면역 메커니즘에 대 한 조사를 더 수 수행할 수 있습니다. 예로 표면에 뜨는 래에 중재자를 공부 하 고 cytometry, genomics, proteomics 등가 래 세포에 분석의 큰 스펙트럼을 수행 있습니다.
마지막으로, 건강 한 컨트롤, 천식, COPD 환자에 선 분석의 대표적인 결과 표시 됩니다.

Hemocytometer 일반적인 이미지는 hemocytometer를 사용 하 여 현미경으로 시각화는 그림 1 에 표시 됩니다. 편평 세포는 쉽게 식별 합니다, 그들은 비 편평 세포 보다 훨씬 더 큰. 이 편평 상피 세포는 상피 세포는 입에서 나오는. 두 종류의 세포는 Trypan 블루 때 죽은 물 들 다. 주의 효 모, 박테리아 및 스크랩 방지로 이동 해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
그림 1 : 죽은 비 편평 상피 세포, 그리고 (C)는 편평 상피 세포 (A) 생계 비 편평 상피 세포, (B)를 보여주는 Hemocytometer 그림. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
Cytospin 슬라이드: 그림 2 는 선 처리 후 얻은 cytospin 슬라이드의 대표 이미지. 다른 세포 유형 (호 중구, 호 산 구는, 대 식 세포, 림프 톨, 그리고 상피 세포) 그들의 형태학 및 채색에 의해 분화 될 수 있다. 경우에 따라 편평 상피 세포에 의해 오염 중요 한 있을 수 있습니다 그리고, 편평 세포의 비율 80% 보다 큰 경우, 샘플 실패 (그림 3) 것으로 간주 됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
그림 2 : Cytospin 슬라이드 그림 표시 (A) neutrophil, (B)는 대 식 세포, (C)는 eosinophil (D)는 림프 구 및 (E)는 상피 세포. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
그림 3 : 와 품질 cytospin 슬라이드의 예 &gt; 편평 세포의 80%. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
성공률 우리 부서에서 (성공적인 유도 및 읽을 수 있는 cytospin 결합) 절차의 1,129 환자 (건강 한 과목 이나 천식, COPD 환자)의 샘플에 따라, 82% (924/1,129). 환자의 유형에 따라 하위 분석에서 성공률 이며 건강 한 과목에서 75% (57/76), 82% (827/1,004) 천식, COPD 환자의 82% (40/49).
건강 한 과목에 결과 우리 부서, 중앙값 (interquartile 범위)에서 289 건강 한 과목의 일련의 회 고 분석에 선 무게 3.72 g (2.46 g-5.54 g의 interquartile 범위) 이었고,가 래의 메디아 총 비 편평 세포 수/g x 106 (0.59 0.37 x 10의 interquartile 범위6 -1.29 x 106).
그 건강 한 주제에서 편평 세포의 비율이 19% (10%-34%)에 낮은 이며 생존은 66% (54-78%)에서 높은. 다른 세포 유형의 비율에 대 한 결과 그림 4A에서 요약 된다. 우리는 대 식 세포 (49% [31-68%])의 백분율은 동안 세포 (2% [1-3%])의 비율 (34% [14%-60%]), 호 중구의 비율 보다 높은, 호 산 구는 (0% 0%-0%)과 상피 세포 (4% [2-11%])는 낮은 볼 수 있습니다. 이러한 결과 비슷한 데이터 절대 값 (그림 4B)에서 표시 됩니다 때.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
그림 4 : 건강 한 과목에서 차동 세포 수의 대표적인 결과 절대 값 (A) 백분율 또는 (B)로 표현 합니다. 결과 중간 (interquartile 범위)로 표시 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
그것은 또한 환자의 나이 고려 하는 것이 중요입니다. 실제로, 강한 상관 관계는가 래 샘플 (그림 5)에 환자의 나이 및 호 중구의 비율 사이 존재. 마찬가지로, 10 년 나이 그룹 (그림 6)에 따라 환자를 분류 하는 경우 연령 증가 함께 호 중구 백분율에 상당한 증가 관찰 합니다. 따라서, 다른 동료에서 결과 비교할 때이 변수를 고려 한다 그리고 과목의 일치에 주의 이동 해야 합니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
그림 5: 나이 및가 래 호 중구 백분율 사이 상관 관계 상관 관계 계산 Spearman 테스트와 함께. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
그림 6: 나이 카테고리에 따라 호 중구 백분율의 진화. ANOVA의 p-값이 &lt; 0.0001 호 중구 백분율 나이 클래스 간의 비교에 대 한. 여러 비교 던의 여러 비교 테스트 했다. P-값은 다음과 같이 표시 됩니다: * p &lt; 0.05, * * p &lt; 0.01, 그리고 * * * p &lt; 0.001. 결과 중간 (interquartile 범위)로 표시 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
호흡기 질환으로 고통 받아 환자에 있는 결과 유도 된가 래의 기술 주로 천식 환자에서 염증 성 셀 프로 파일을 평가 하기 위해 사용 됩니다.이 기술은 또한 COPD, 다른 염증 성 호흡기 질환으로 고통 받아 환자에 적용할 수 있습니다. 비교할 때 건강 한 과목, 천식, COPD 환자 (나이, 성별, 그리고 담배 습관에 대 한 일치 되는 3 그룹), 염증 성 셀 프로 파일은이 동료 (그림 7) 사이 아주 다른 관찰 합니다. 실제로, 천식 환자는 보통 특징 제기 래 호 산 구는가 래 호 중구의 비율은 COPD 환자의 건강 한 컨트롤에 비해 일반적으로 더 높은 질병 심각도에 연결 되는.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
그림 7 : 건강 한 과목의가 래 염증 셀 프로 파일 (n = 45), 천식 환자 (n = 108), 및 COPD 환자 (n = 54). 3 그룹은 성별, 나이, 및 담배 습관에 대 한 일치 했다. ANOVA의 p-값 &lt; 0.05, &lt; 0.0001, 및 &lt; 0.0001 호 중구, 호 산 구는, 및 세포 그룹 간의 비교에 대 한 각각. 여러 비교 던의 여러 비교 테스트 했다. P-값은 다음과 같이 표시 됩니다: * p &lt; 0.05와 * * * p &lt; 0.001. 결과 중간 (interquartile 범위)로 표시 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기는 선 유도의 기술에 설명합니다. 이 프로토콜도 선 차동 세포 수를 수행 하 고 표면에 뜨는 래를 수집 처리 및 추가 분석에 대 한 셀을 설명 합니다.

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

유도 가래 기술은 90년대 초반에 개발되었습니다. 이 기술은 천식, COPD와 같은 폐쇄성 기도 질환에 대한 새로운 정보를 조사하기 위해 제안되었으며, 최근에는 폐 섬유증에 대한 새로운 정보를 살펴보는 데에도 관심이 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 기관지 내시경 검사와 달리 상대적으로 비침습적이라는 것입니다.이 가공에는 실험실 작업이 필요하고 시간이 걸리기 때문에 상당히 까다롭고 시간이 많이 걸리며 실험실에 대한 전문 지식이 필요하기 때문에 모든 센터에서 얻기 어려운 기술임이 분명합니다. 유도 가래 기술은 두 부분으로 구성되며, 첫 번째 부분은 유도이고 두 번째 부분은 처리입니다. 가래를 유도하기 전에 폐활량 측정을 수행해야 하는데, 이는 환자가 생산할 수 있는 양과 유속을 평가하는 것입니다.그리고 객담 유도 자체가 기관지 경련을 유발할 수 있기 때문에 환자의 폐활량 측정의 기준선 값을 절대적으로 알아야 합니다. 그래서 우리는 먼저 폐활량 측정을 실시한 다음 환자에게 기관지 확장제를 투여하고 보통 400마이크로그램의 살부타몰을 투여하여 환자의 기도를 최대한 개방하고 유도 단계에서 발생할 수 있는 기관지 경련을 예방합니다. 그리고 15분 후, 폐활량 측정을 다시 측정하여 폐활량 측정의 기준선 값이라고 부르는 것을 얻고, 특히 환자가 1초 이내에 내쉴 수 있는 부피인 FEV1을 확인합니다.증류수를 권장 수준까지 분무기 챔버에 붓습니다. 분무기 챔버에 깨끗한 컵을 놓습니다. 채워진 뚜껑을 적절한 뚜껑으로 덮습니다.기관지 확장제 후 FEV1이 예측된 65%보다 큰 경우 50mL의 긴장 식염수 5%를 컵에 채우고, 기관지 확장제 후 FEV1이 예측된 65% 미만인 경우 50mL의 등장성 식염수 9%를 채웁니다. 컵에 ml당 5 밀리그램의 농도에 1.75 salbutamol 황산염 해결책을 추가하십시오. 제조업체 지침에 따라 튜브와 밸브를 연결하십시오.이 기술은 의사의 감독 하에 수행되어야 합니다. 환자에게 검사의 원리를 설명합니다. 환자에게 코 클립을 사용하도록 요청하십시오.분무기를 시작하고 가장 낮은 수준의 에어로졸 및 팬 설정을 선택합니다. 환자에게 조수 호흡과 함께 마우스피스를 통해 에어로졸을 흡입하도록 요청합니다. 에어로졸 및 팬 설정의 수준은 환자의 내성에 따라 증가할 수 있습니다.흉부 압박감이 호흡기 불편감으로 느껴지는 경우, 시술을 중단하고 폐활량 측정을 실시하여 환자의 FEV1 수치를 측정하십시오. 5분 동안 숨을 들이마신 후 또는 기침이나 메스꺼움이 있는 경우 분무기를 중지하십시오. 환자에게 코 클립을 제거하고 입을 헹구고 수돗물로 두 번 가글을 한 다음 이 물을 싱크대에 버리도록 요청하십시오.그런 다음 환자가 가래를 기침하고 목구멍에서 나오는 것을 플라스틱 용기에 뱉습니다. FEV1을 측정하기 위해 첫 번째 호흡 조작을 수행합니다. 가래 생성의 각 잠정 후에, 우리는 FEV1 값을 측정합니다.FEV1 값이 20% 이상 떨어지면 시술을 중단하고 환자에게 항콜린제인 이프라트로퓸 브로마이드를 분무하여 시술 중에 이미 투여한 베타 2 작용제와 함께 작용합니다. FEV1 값이 20% 이상 떨어지지 않으면 환자가 생성하는 가래의 질과 양에 따라 총 10-20분 동안 시술을 진행합니다. 가래 샘플을 얻으면 가공할 때까지 냉장고에 보관하십시오.따라서 두 번째 부분은 가래 처리로 구성되며, 이를 위해 먼저 이 처리에 사용할 두 가지 솔루션을 준비해야 합니다. 그래서 우리는 DTT라고도 알려진 Dithiothreitol을 준비해야 합니다. 용액은 6.5 밀리몰 용액을 얻기 위해 DTT를 멸균수로 희석하여 준비해야 합니다.따라서 DTT를 주변 공기에 노출시키지 않아야 하며 이를 위해 주사기와 바늘을 사용합니다. 둘째, 트리판 블루 용액을 준비해야 하며, 이를 위해 DPBS를 트리판 블루로 희석하여 0.08%의 용액을 얻어야 합니다.따라서 가래에 관해서는 50mL 원뿔형 바닥 플라스틱 튜브에 가래 전체를 옮기고 샘플의 무게를 측정해야 합니다. DPBS 용액의 3배 무게를 추가합니다.30초 동안 샘플을 천천히 소용돌이치고 섭씨 4도에서 10분 동안 800g으로 원심분리합니다. 두 개의 단일 멸균 거즈를 통해 여과한 후 50mL 원뿔형 바닥 플라스틱 튜브에 상층액을 수집합니다. 2mL 플라스틱 튜브에 상등액을 할당하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.상등액 샘플은 가래의 3상 성분으로 유용합니다. 셀 팰릿 부피가 5mL 미만인 경우 DPBS를 추가하여 5mL 부피의 세포 현탁액에 도달합니다. 세포 현탁액을 6.5 millimolar에서 1 부피의 DTT로 희석합니다.벤치 작업자와 함께 실온에서 20분 동안 세포 현탁액을 흔듭니다. DPBS로 세포 현탁액을 최소 3회 희석합니다. 희석된 세포 현탁액을 550g에서 섭씨 4도에서 10분간 원심분리합니다.상등액을 버리십시오. 약 1ml DPBS에서 셀 팔레트를 일시 중단합니다. 세포 현탁액의 정확한 부피를 평가하고 기록합니다.50 μl의 세포 현탁액을 50 μlit의 희석된 trypan blue 용액에 첨가하고 균질화합니다. 샘플을 hemocil cytometer의 커버 슬립 아래에 놓고 광학 현미경 아래에 놓습니다. 세포 현탁액의 세포 농도, 편평 세포의 비율 및 비편평 세포의 생존율 비율을 평가합니다.DPBS로 현탁액 할당을 희석하여 mL당 500, 000 세포에서 최소 350마이크로리터의 세포 현탁액을 얻습니다. 제조업체 지침에 따라 cell concentrator를 조립합니다. cell concentrator의 3개 compartment 각각에 100μl의 cell suspension을 추가합니다.세포 원심분리기에서 실온에서 150g으로 2분간 돌립니다. 상등액을 버리십시오. 슬라이드를 자연 건조시키십시오.제조업체 지침에 따라 div quick 또는 니켈 원자가 염색 키트로 슬라이드를 염색하십시오. 장착 매체와 커버 슬립으로 장착합니다. 오일 침지와 함께 광학 현미경 아래에 슬라이드를 놓습니다.최소 500개의 비편평 세포, 호중구, 호산구, 대식세포, 림프구 및 상피 세포를 세고 절대값과 백분율 및 세포 유형을 기록합니다. 결과와 관련하여, 혈구계를 사용하여 착색되지 않은 살아있는 비편평 세포를 세어야 합니다. 또한 파란색으로 표시된 죽은 비편평 세포.그리고 편평 세포. 이 세포는 입에서 나오는 상피 세포입니다. 그들은 크기 때문에 작은 인간 세포에 비해 쉽게 알아볼 수 있습니다.따라서 박테리아, 효모 또는 스크랩을 세는 것도 피해야 합니다. 세포 현탁액에 편평 세포가 80% 이상 포함되어 있는 경우 이 샘플은 품질이 좋지 않고 사이토스핀 슬라이드에 적합하지 않은 것으로 간주됩니다. 따라서 이 샘플은 실패한 것으로 간주됩니다.염색된 사이토스핀(cytospin)에 대한 계수는 세포의 색상과 형태에 따라 수행됩니다. 호중구의 주요 특징은 세포를 쉽게 식별할 수 있도록 하는 다엽 핵입니다. 이 세포는 둥글고 작으며 중성 분홍색으로 착색되어 있습니다.호산구, 이 세포는 붉은 과립으로 구성되어 있어 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 세포의 크기는 호중구에 가깝습니다. 대식세포는 호중구보다 2배에서 5배 더 크며 파란색으로 착색되어 있습니다.세포질에는 파편과 액포가 포함될 수 있습니다. 림프구인 이 세포는 둥글고 작으며 파란색을 띠고 크고 조밀한 핵을 가지고 있습니다. 상피 세포는 원주 모양을 가지고 있으며 분홍색으로 착색되어 있으며 종종 상단에 섬모가 있습니다.다음은 편평 세포가 80% 이상인 판독할 수 없는 사이토스핀 샘플의 몇 가지 예입니다. 매우 유용한 기술이라고 생각하지만 객담 유도는 의사의 감독 하에 이루어져야 하기 때문에 매우 조심해야 하지만 객담 유도 기술은 기도에 있는 환자의 염증 상태에 대한 많은 정보를 제공합니다. 이를 통해 상층액에서 다양한 생화학적 마커를 측정할 수 있으며 세포 부분에서도 다양한 것을 측정할 수 있으므로 유도 객담을 통해 유세포 분석, 단백질체학, 전사체학 및 유전체학을 수행할 수 있습니다.

methodology-for-sputum-induction-and-laboratory-processing

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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