오염이 제거된 객담 샘플에 대한 표적 차세대 염기서열분석을 위한 매트릭스 기반 DNA 추출

우리의 연구는 맞춤형 환자 치료를 위해 NGS를 통합하여 결핵 진단 및 후속 시작의 처리 시간을 줄이는 것입니다. 당사의 프로토콜은 진단 지연을 줄이고 적시에 치료 시작을 개선하는 것을 목표로 워크플로 통합, 비용 및 처리 시간을 해결하여 일상적인 사용을 위해 TNGS를 최적화합니다.

이 프로토콜은 최대 3일이 소요되는 기존 CTAB 방법에 비해 몇 시간 내에 임상 샘플에서 비용 효율적이고 신속하며 충분한 품질의 DNA 추출을 가능하게 합니다.

우리의 결과는 TNGS를 일상적인 진단에 통합하고 도말 음성 및 부족한 샘플에 대한 추출 방법을 최적화하여 민감도와 임상적 유용성을 향상시키는 데 대한 주요 질문을 제기합니다. 우리는 결핵 게놈 감시를 간소화하고 확장하기 위해 가래의 직접 전체 게놈 시퀀싱을 포함하여 일상적인 진단의 잔여 샘플을 다운스트림 시퀀싱에 사용할 수 있는지 여부를 조사할 것입니다.

[해설자] 시작하려면 열에 비활성화된 가래 침전물을 얻으십시오. 샘플을 16,800G 또는 최대 속도로 15분 동안 원심분리합니다. 20-200마이크로리터 피펫을 사용하여 상청액을 부드럽게 흡인하고 버려 펠릿이 방해받지 않도록 합니다. 매트릭스 현탁액을 부드럽게 흔들어 혼합한 다음 잘 혼합된 매트릭스 200마이크로리터를 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다. 전체 부피를 직경 2mm의 사전 멸균된 유리 구슬 3개가 들어 있는 1.5밀리리터 스크류 캡 튜브로 옮깁니다. 이제 샘플을 섭씨 56도의 가열 블록에 15분 동안 넣습니다. 배양 후 10초 동안 소용돌이로 샘플을 균질화하여 세포를 분산시킨 다음 샘플을 섭씨 100도의 가열 블록에서 10분 동안 배양합니다. 초당 4.0미터에서 60초의 한 사이클로 고속 균질화기를 사용하여 샘플을 균질화합니다. 그런 다음 현탁액을 12,000G에서 5분 동안 원심분리합니다. 130마이크로리터의 DNA 함유 상청액을 펠릿을 방해하지 않고 신선한 1.5밀리리터 저결합 튜브로 옮깁니다. 매트릭스와 세포 파편이 들어 있는 첫 번째 튜브를 폐기하십시오. 마그네틱 비드를 사용하여 DNA를 정제하려면 먼저 마그네틱 비드 스톡 병 또는 준비된 분취량을 완전히 소용돌이치게 하여 사용하기 전에 비드를 재현탁시킨 다음 추출된 DNA에 마그네틱 비드 부피의 1.2배를 첨가하고 현탁액을 10회 피펫팅하여 샘플을 혼합한 후 실온에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 1.5밀리리터 튜브 마그네틱 랙에 3분 동안 또는 액체가 투명해질 때까지 놓은 다음 비드를 방해하지 않고 조심스럽게 상청액을 흡인하고 버립니다. 자석에 튜브를 대고 200마이크로리터의 80% 에탄올을 추가하여 비드가 방해받지 않도록 합니다. 30초 동안 배양한 후, 구슬을 방해하지 않고 에탄올을 조심스럽게 흡인하고 버립니다. 두 번째 세척 후 1-10마이크로리터 피펫을 사용하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 튜브를 열어 두어 10분 동안 또는 무광택 모양이 될 때까지 비드를 자연 건조시킵니다. 비드가 무광택 모양이 되면 자석에서 튜브를 제거하고 각 샘플의 비드에 50마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 직접 추가합니다. 그런 다음 피펫팅하여 각 개별 샘플을 10회 혼합합니다. 튜브 내부에 구슬이 끼어 있는지 검사하십시오. 실온에서 5분 동안 배양한 후 튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓거나 액체가 투명해질 때까지 3분 동안 놓습니다. 마그네틱 랙에 튜브를 사용하여 DNA 함유 상청액을 명확하게 표시된 멸균 저결합 튜브로 옮깁니다. DNA 농도는 모든 도말 등급에서 500마이크로리터에 비해 2밀리리터 침전물 샘플에서 더 높았습니다. DNA 수율의 더 큰 변동성은 500마이크로리터 침전물 샘플에서 관찰되었습니다. 시퀀싱 판독의 적용 깊이는 모든 도말 등급에서 500마이크로리터에 비해 2밀리리터 침전물 샘플에서 더 높았습니다. 변동성은 500마이크로리터 퇴적물에서 추출한 3개 이상의 도말 등급 샘플에서 더 컸습니다. 시퀀싱 수용 가능성 점수는 일반적으로 500마이크로리터에 비해 2밀리리터 샘플에서 더 높았으며 매우 수용 가능한 결과의 비율이 더 높았습니다. 도말 등급 3 이상 샘플은 도말 등급 1 플러스 및 2 플러스에 비해 허용 가능한 결과의 비율이 가장 높았습니다. 500마이크로리터 샘플에는 허용되지 않거나 결정되지 않은 것으로 분류된 사례가 더 많았습니다.