Vivo에서 PH, pO₂, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

이 생체 내 전자 상자성 공명 기술의 전반적인 목표는 암 동물 모델의 전임상 환경에서 국소 조직 미세환경의 생리학적으로 관련된 매개변수를 정량적 및 비침습적으로 평가하는 것입니다. 이 기술은 플루오필드 APR과 특수 설계 기능성 상자성 프로브의 조합을 기반으로 하여 도크 상태의 CDT로 조직 산소화에 대한 정량적 정보와 간질 유기 인산염 및 세포 간 농도에 대한 정량적 정보를 제공합니다. 이 비침습적 기술은 종양 미세환경 및 종양 재생의 세계에 대한 독특한 통찰력을 제공하며 종양 미세환경 표적 항암 치료제의 향후 합리적 설계에 기여할 수 있습니다.

이 기술의 적용은 다기능 APR 프로브의 적용 매개 변수 간의 뇌 상관 관계로 확장됩니다. 따라서 근본적인 생물학적 메커니즘에 대한 추가적인 통찰력을 제공합니다. 저와 Andrey 외에도 Marieta Gencheva와 Dr.Benoit Driesschaert, 그리고 IMMR 센터의 대학원생 Kayla Steinberger가 시연을 할 예정입니다.

미립자 산소 민감성 프로브를 준비하려면 먼저 60mg의 미세결정의 무게를 측정하십시오. 산소 감도 보정을 위해 3ml의 dolbeckas 변형 독수리 배지에 미세결정을 현탁시킵니다. 얼음 위에서 5 분 동안 초음파 처리하십시오.5 밀리리터 유리 둥근 바닥 튜브에서 7 와트의 전력을 사용하여 20 킬로 헤르츠의 프로브 초음파 발생기를 사용하십시오.

다음으로, 초음파 처리 된 미세 결정의 1 밀리리터를 L 밴드 EPR 분광계의 표면 코일 신호기에있는 유리관에 놓습니다. 섭씨 37도의 생리적 온도와 0, 1, 2, 4, 8, 20.9%의 산소 농도에서 연속파 EPR 스펙트럼을 획득합니다. 이중 기능 pH 및 산화 환원 프로브를 준비하려면 6.34mg의 프로브를 1ml의 식염수 용액에 용해시킵니다.

pH 측정기를 사용하여 염산 또는 수산화나트륨을 소량 할당하여 pH를 7.2로 조정합니다. 니트록사이드 프로브의 pH 보정을 수행하려면 먼저 0.1ml의 프로브 스톡 용액을 0.9ml의 2mgmolar sodium phosphate buffer, 150millimolar sodium chloride에 추가합니다. 그런 다음 얻어진 1 밀리 몰 프로브 용액을 pH 측정기를 사용하여 염산 또는 수산화 나트륨을 필요한 pH로 할당하여 적정합니다.

L-밴드 EPR 분광계를 사용하여 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 있는 샘플의 EPR 스펙트럼을 기록합니다. GSH 민감성 RSSR 프로브를 준비하려면 1ml의 DMSO 용액에 프로브 4.05mg을 용해시킵니다. 다음으로, RSSR과 GSH의 반응의 속도 상수 값을 결정하십시오.

이렇게 하려면 먼저 20마이크로리터의 RSSR 원액을 0.98밀리리터의 1밀리몰 인산염 완충액 pH 7.2, 150밀리몰 염화나트륨에 추가하여 0.2밀리몰 RSSR 프로브 용액을 얻습니다. 그런 다음 GSH 용액 중 하나에 동일한 부피의 0.2 밀리몰 RSSR 용액을 혼합하여 0.1 밀리 몰에서 프로브의 최종 농도와 0.5, 1 또는 2.5 밀리 몰에서 GSH의 최종 농도를 측정합니다. RSSR 및 GSH 용액 혼합 직후 샘플을 EPR 서명자에 넣고 10분 동안 12초마다 EPR 스펙트럼을 기록합니다.

그런 다음 산소, pH 및 Pi 평가를 위한 다기능 HOPE 프로브에 대한 모노라디칼 스펙트럼 진폭 증가의 역학을 계산합니다. 10.7mg의 프로브를 1ml의 식염수에 녹이고 pH를 7.4로 조정합니다. 그런 다음 준비된 원액 20마이크로리터를 식염수 0.98ml에 첨가하여 0.2밀리몰 프로브 용액을 얻습니다.

pH의 프로브 보정을 위해 소량의 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 프로브 용액의 0.2 밀리몰을 적정하여 샘플의 최종 희석이 1% 미만이 되도록 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 중간 pH에서 EPR 스펙트럼을 획득합니다. 산소 민감도 프로브 교정을 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다양한 산소 농도에서 프로브의 EPR 스펙트럼을 획득합니다. Pi의 프로브 보정을 위해 다양한 인산염 농도에서 프로브의 EPR 스펙트럼을 획득합니다.

PKA 근처의 pH 값을 가진 라디칼 용액을 사용하고 다양한 인산염 농도로 적정합니다. 온도와 가스 조성을 이전과 같이 유지하십시오. 미립자 프로브를 MET1 세포로 내재화하기 위한 MET1 종양 모델의 경우, MET1 세포를 포함하는 10ml의 배양 배지가 있는 T75 플라스크에 100마이크로리터의 초음파 처리된 현탁액을 추가합니다.

모든 절차는 생물 안전 캐비닛에서 이루어지며 매체에는 잠재적인 감염을 최소화하기 위해 페니실린과 스트렙토마이신이 포함되어 있습니다. 섭씨 37도에서 72시간 동안 또는 약 80% 포화도에 도달할 때까지 세포를 배양합니다. 배지를 흡인하고 10ml의 PBS로 세포를 5회 세척합니다.

5ml의 트립손 EDTA로 세포를 분리합니다. 세포를 채취하고 이전과 같이 원심분리한 후 배제 염료의 세포 샘플을 염색하여 세포 생존율과 수량을 측정합니다. 최소 DMEM에서 100마이크로리터당 100만 개의 세포 농도로 세포를 현탁시킵니다.

인슐린 주사기를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 내재화된 미세결정을 포함하는 세포 현탁액 100마이크로리터를 8주 된 암컷 야생형 마우스의 4번 유방 지방 패드에 천천히 주입합니다. 종양의 시작과 성장을 모니터링합니다. EPR 분광 측정의 경우, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마취기를 사용하여 공기 이소플로란 혼합물을 흡입하여 마우스를 마취합니다.

표면 코일 재신호기를 정상 유선이나 유방 종양에 배치하여 L-대역 EPR 분광계를 사용하여 기능 측정을 수행합니다. 분광계 조정을 진행합니다. 용해성 프로브의 경우 프로브 주입 직후 5-10분 동안 EPR 스펙트럼을 획득합니다.

이식 후 몇 주에 걸쳐 5-10분 동안 이식된 미립자 프로브에서 EPR 스펙트럼을 획득합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 EPR 스펙트럼과 프로브를 분석합니다. 산소에 대한 미립자 LiNc-BuO 프로브의 EPR 스펙트럼 감도가 여기에 나와 있습니다.

EPR 스펙트럼은 pO2의 0%와 섭씨 37도에서 측정되었습니다. 산소 분압에 대한 프로브 현탁액의 EPR 스펙트럼의 선 너비의 대표적인 종속 항목이 표시됩니다. 선 너비는 pO2에 따라 선형적으로 증가합니다.

마취된 암컷 마우스의 유방 종양 조직에서 측정된 스펙트럼은 7.5mm의 수은 조직 부분 산소에 해당합니다. NR 프로브 용액의 L-밴드 EPR 스펙트럼은 다양한 pH 수준에서 섭씨 37도에서 획득되었습니다. pH에서 관찰된 초미세 분할 상수의 종속 항목이 표시되고 표준 적정 곡선에 적합합니다.

여기에 표시된 것은 산화 환원 NR 프로브의 이중 기능 pH에 산소에 민감한 LiNc-BuO 프로브를 결합한 다기능 종양 미세환경 평가입니다. NR의 관찰된 삼중항 스펙트럼은 종양 내에 내장된 LiNc-BuO 프로브의 단일 EPR 라인과 중첩됩니다. 세포 내 조직 글루타티온 농도의 생체 내 EPR 평가가 여기에 나와 있습니다.

RSSR 프로브의 경골 내 주입 직후 FVBN 마우스의 정상 유선에서 유방 종양에서 L-밴드 EPR로 측정한 모노라디칼 스펙트럼 엿보기 강도 변화의 동역학이 표시됩니다. 더 빠른 동역학은 종양 조직에서 더 높은 GSH 농도를 반영합니다. 이 기술은 암 연구 분야의 연구자가 종양 미세환경의 세포 생리학적으로 중요한 매개변수와 번역을 위한 전위를 생체 내에서 수행할 수 있는 탁월한 기회를 제공합니다.

이전 절차에 따른 프로브의 민감도는 합성 화학에 대한 전문 지식이 필요하며 프리젠테이션에 매우 중요합니다. 우리 센터는 이 기술의 어려움을 보고하고 협력을 통해 현장에 보고했습니다.