Name: Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 학습하세요 저전자기공명(EPR) 기술을 활용하여 유방암 동물 모델의 종양 미세환경에서 산소화, 산화환원 상태, pH 및 인산염 농도를 비침습적으로 정량 평가하는 방법을. 이 기술은 종양 재생 및 표적 항암 치료제 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 NIH에 의해 부분적으로 지원 된다 CA194013, CA192064 및 U54GM104942를 부여. WVCTSI VVK, AB, TDE를 시작에 대 한 인정 이다. 저자는 설명 실험 지원에 대 한 박사 M. Gencheva, K. 작성을 감사합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 NIH의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

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</ol>

저자는 공개 없다.

제시 메서드는 중요 한 매개 변수 화학 TME의 즉 pO2, pH, 산화 환 원 상태 및 중간 Pi와 세포내 GSH의 농도의 비 침범 성 비보에 평가 대 한 수 있습니다. 낮은 분야 EPR, MRI와 자기 공명 기법, 비 침 투 적인 vivo에서 TME 매개 변수 프로 파일링에 대 한 선택의 방법이 있습니다. MRI는 해부학 적 구조를 시각화 하지만 기능 감도 부족. MRI, 달리 EPR 기술 기능 스핀 프로브와 함께 사용 하는 경우 microenvironment의 로컬 매개 변수 기능 감도 제공 합니다. 우리의 지식에 없는 다른 방법을 동시에 생체 내에서 생리 적으로 중요 한 화학 TME 매개 변수 pO2, pHe, Pi, redox, GSH 등 생활 주제에 평가를 사용할 수 있다.
설명된 프로토콜 사용 하 여 낮은 필드 L-밴드 EPR에 ...

암 진행 및 치료에서 TME의 주요 역할은 점점 더 감사1. 단단한 종양, 조직 hypoxia2, 증3,4, 높은 감소 용량5, 세포내 GSH6,7, 높은 농도에서 TME의 중요 한 생리 적인 매개 변수 중 그리고 중간 Pi8 잘 문서화 되어있다. 비 침 투 적인 vivo에서 pO2, pH, Pi, GSH, 및 산화 환 원 평가 TME에서 생물 학적 과정에 대 한 독특한 통찰력을 제공 하 고 도와 항 암 약물과 치료 전략 TME 대상의 전 임상 심사에 대 한 사전 도구. 자기 공명 영상 (MRI) 및 낮은 필드 EPR 기반 기술에 의해 조직에 합리적인 알코올 관통은 그들이 이러한 TME 매개 변수의 비 침범 성 평가 대 한 가장 적절 한 접근 합니다. MRI 이미징 물 양성자에 크게 의존 하 고 해부학 해상도 제공 하기 위해 임상 설정에서 널리 이용 된다 하지만 기능 해상도 부족. Extracellular Pi 농도 pH 생 인산에서 신호에 따라 인-31 핵 자기 공명 (31P NMR) 측정 TME 특성화에 대 한 잠재적으로 매력 있지만 일반적으로 여러 번으로가 면 높은 세포내 Pi 농도9,10. 이, 달리 EPR 측정 분광학에 의존 하 고 특별히의 이미징 설계 상자성 프로브 기능 해상도 제공 하. 참고 exogenous EPR 프로브 외 인 한 이점을 NMR 프로브 EPR의 훨씬 더 높은 본질적인 감도와 내 생 적인 배경 EPR 신호의 부재 합니다. 듀얼 기능 pH 및 redox nitroxyl의 최근 개발11 프로브 및 다기능 trityl 프로브12 비보에 대 한 탁월한 기회 여러 TME 매개 변수의 동시 측정을 제공 하 고 그들의 상관 관계 분석 조사 배포 및 측정의 시간에 독립. 우리의 지식에 없는 다른 방법을 동시에 생체 내에서 생리 적으로 중요 한 화학 TME 매개 변수 pO2, pHe, Pi, redox, GSH 등 생활 주제에 평가를 사용할 수 있다.
에 대 한 조사 Vivo에서 기능 측정:
그림 1 상자성 프로브 TME 매개 변수, 미 립 자 및 녹는 프로브를 포함 하는 액세스 하는 데 사용의 화학 구조를 보여 줍니다. 고감도 기능, 조직 생활, 그리고 최소한의 독성 안정성 미 립 자 프로브 EPR 프로브가 비보에 대 한 수용 성 조사를 통해 선호 하는 몇 가지 이점이 있습니다. 예를 들어 입자 프로브는 몇 주 동안 조직 pO2 의 경도 측정에 대 한 허용 하는 녹는 프로브에 비해 조직 이식의 사이트에서 보존 배 증가 했습니다. 다른 한편으로, 녹는 프로브 EPR 기반 이미징 기법으로 수 있도록 여러 기능에서 부수적인 분석을 사용 하 여 해결 공간 측정을 제공 하 여 미 립 자 프로브를 능가할 (pO2, pH, Pi, 산화 환 원, 그리고 GSH)입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> 그림 1. TME 평가 분석 결과 조립 상자성 프로브의 화학 구조. 이 미 립 자 pO2 프로브, 링컨-BuO 포함 (R =-O (CH2)3채널3), 그리고 수용 성 조사: 듀얼 기능 pH 및 redox 프로브, NR; GSH-민감한 프로브, RSSR; 다기능 pO2와 pH, 그리고 extracellular microenvironment, 희망 조사. 의 Pi 프로브 이러한 프로브 합성 제공된 참조 11,12에서 설명 하고있다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>L-band EPR 분광계</td><td>Magnettech, 독일</td><td></td><td>L-band (1.2 GHz) 전자 상자성 공명(EPR) 분광계는 상자성 분자의 체외 및 생체 내 스펙트럼 수집을 위한</td></tr> 것입니다<tr><td>&nbsp; 온도 & 가스 컨트롤러&nbsp;</td><td>Noxygen, 독일</td><td></td><td>온도 & 온도와 가스 조성을 제어하고 조정하도록 설계된 가스 컨트롤러&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutathione 감소)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp; 집</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1 쥐 유방암 세포</td><td>집</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 야생형 쥐&nbsp;</td><td>잭슨 연구소</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 배제 염료&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>오메다 플루오텍 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (IsoFlo)</td> <td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 이염기</td>성 <td>시그마 - 알드리치</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 일 염기성</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>글루코스</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글루코스 옥시다제</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라우다 순환기 E100</td><td>라우다-브리크만</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 미터 오리온</td><td>써모 사이언티픽;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiNc-BuO 프로브</td> 사<td>내</td><td></td><td>Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine 프로브는 ref 13 NR 프로브에 따라 합성되었습니다</td></tr><tr><td></td><td>사내</td><td></td><td>Nitroxide 프로브는 ref 11</td></tr><tr><td>RSSR 프로브</td>에 따라 합성되었습니다 <td>사내</td><td></td><td>디 니트록사이드 프로브는 ref 15</td></tr><tr><td>HOPE probe</td><td>In house</td><td></td><td>에 따라 합성되었습니다.monophoshonated Triarylmethyl 프로브는 ref 12에 따라 합성되었습니다</td></tr></tbody></table>.

vivo에서 ph, po2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 microenvironment에 티의 epr 평가

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

이 프로토콜 낮은 필드 전자 상자성 공명 (EPR)의 기능을 보여줍니다-화학 종양 microenvironment (TME)에 정량적 인 정보를 제공 하는 기능 상자성 프로브 조합에서 기법을 기반으로 포함 p O2, pH, 산화 환 원 상태, 간 질 성 무기 인산 (Pi), 그리고 세포내 티 (GSH)의 농도. 특히, 최근에 개발 된 수용 성 다기능 trityl 프로브 응용 프로그램 탁월한 기회를 제공 한다 vivo에서 pH, pO2 와 P의 동시 측정 e에서 나 xtracellular 공간 (희망 조사)입니다. 세 개의 매개 변수는 단일 프로브를 사용 하 여 측정 프로브 배포 및 시간 측정의 그들의 상관 분석에 대 한 수 있습니다.

조직 p O 2 평가 링컨-BuO를 사용 하 여 조사:
우리는 갓된 링컨 BuO microcrystals 서 스 펜 션의 교정 수행 단계 1.1 아래 설명 된 절차를 사용 하 여. 그림 2 는 일반적인 산소 의존 링컨 BuO 프로브 여성 C57Bl/6 마우스의 세포를 주입 하 여 종양 개시 후 성장에 유 방 종양 조직을 버퍼에 측정의 exemplified EPR 스펙트럼의 선 폭의 함께 내 면된 입자 (3.1 단계). 조직 pO2 값의 계산에 대 한 수 선 폭 보정을 사용 하 여 </...

낮은 분야 (L-밴드, 1.2 g h z) 전자 상자성 공명 녹는 nitroxyl 및 trityl 프로브를 사용 하 여 유방암의 마우스 모델에서 종양 microenvironment에 생리 적으로 중요 한 매개 변수 평가 대 한 시연입니다.

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

이 생체 내 전자 상자성 공명 기술의 전반적인 목표는 암 동물 모델의 전임상 환경에서 국소 조직 미세환경의 생리학적으로 관련된 매개변수를 정량적 및 비침습적으로 평가하는 것입니다. 이 기술은 플루오필드 APR과 특수 설계 기능성 상자성 프로브의 조합을 기반으로 하여 도크 상태의 CDT로 조직 산소화에 대한 정량적 정보와 간질 유기 인산염 및 세포 간 농도에 대한 정량적 정보를 제공합니다. 이 비침습적 기술은 종양 미세환경 및 종양 재생의 세계에 대한 독특한 통찰력을 제공하며 종양 미세환경 표적 항암 치료제의 향후 합리적 설계에 기여할 수 있습니다.이 기술의 적용은 다기능 APR 프로브의 적용 매개 변수 간의 뇌 상관 관계로 확장됩니다. 따라서 근본적인 생물학적 메커니즘에 대한 추가적인 통찰력을 제공합니다. 저와 Andrey 외에도 Marieta Gencheva와 Dr.Benoit Driesschaert, 그리고 IMMR 센터의 대학원생 Kayla Steinberger가 시연을 할 예정입니다.미립자 산소 민감성 프로브를 준비하려면 먼저 60mg의 미세결정의 무게를 측정하십시오. 산소 감도 보정을 위해 3ml의 dolbeckas 변형 독수리 배지에 미세결정을 현탁시킵니다. 얼음 위에서 5 분 동안 초음파 처리하십시오.5 밀리리터 유리 둥근 바닥 튜브에서 7 와트의 전력을 사용하여 20 킬로 헤르츠의 프로브 초음파 발생기를 사용하십시오.다음으로, 초음파 처리 된 미세 결정의 1 밀리리터를 L 밴드 EPR 분광계의 표면 코일 신호기에있는 유리관에 놓습니다. 섭씨 37도의 생리적 온도와 0, 1, 2, 4, 8, 20.9%의 산소 농도에서 연속파 EPR 스펙트럼을 획득합니다. 이중 기능 pH 및 산화 환원 프로브를 준비하려면 6.34mg의 프로브를 1ml의 식염수 용액에 용해시킵니다.pH 측정기를 사용하여 염산 또는 수산화나트륨을 소량 할당하여 pH를 7.2로 조정합니다. 니트록사이드 프로브의 pH 보정을 수행하려면 먼저 0.1ml의 프로브 스톡 용액을 0.9ml의 2mgmolar sodium phosphate buffer, 150millimolar sodium chloride에 추가합니다. 그런 다음 얻어진 1 밀리 몰 프로브 용액을 pH 측정기를 사용하여 염산 또는 수산화 나트륨을 필요한 pH로 할당하여 적정합니다.L-밴드 EPR 분광계를 사용하여 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 있는 샘플의 EPR 스펙트럼을 기록합니다. GSH 민감성 RSSR 프로브를 준비하려면 1ml의 DMSO 용액에 프로브 4.05mg을 용해시킵니다. 다음으로, RSSR과 GSH의 반응의 속도 상수 값을 결정하십시오.이렇게 하려면 먼저 20마이크로리터의 RSSR 원액을 0.98밀리리터의 1밀리몰 인산염 완충액 pH 7.2, 150밀리몰 염화나트륨에 추가하여 0.2밀리몰 RSSR 프로브 용액을 얻습니다. 그런 다음 GSH 용액 중 하나에 동일한 부피의 0.2 밀리몰 RSSR 용액을 혼합하여 0.1 밀리 몰에서 프로브의 최종 농도와 0.5, 1 또는 2.5 밀리 몰에서 GSH의 최종 농도를 측정합니다. RSSR 및 GSH 용액 혼합 직후 샘플을 EPR 서명자에 넣고 10분 동안 12초마다 EPR 스펙트럼을 기록합니다.그런 다음 산소, pH 및 Pi 평가를 위한 다기능 HOPE 프로브에 대한 모노라디칼 스펙트럼 진폭 증가의 역학을 계산합니다. 10.7mg의 프로브를 1ml의 식염수에 녹이고 pH를 7.4로 조정합니다. 그런 다음 준비된 원액 20마이크로리터를 식염수 0.98ml에 첨가하여 0.2밀리몰 프로브 용액을 얻습니다.pH의 프로브 보정을 위해 소량의 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 프로브 용액의 0.2 밀리몰을 적정하여 샘플의 최종 희석이 1% 미만이 되도록 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 중간 pH에서 EPR 스펙트럼을 획득합니다. 산소 민감도 프로브 교정을 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다양한 산소 농도에서 프로브의 EPR 스펙트럼을 획득합니다. Pi의 프로브 보정을 위해 다양한 인산염 농도에서 프로브의 EPR 스펙트럼을 획득합니다.PKA 근처의 pH 값을 가진 라디칼 용액을 사용하고 다양한 인산염 농도로 적정합니다. 온도와 가스 조성을 이전과 같이 유지하십시오. 미립자 프로브를 MET1 세포로 내재화하기 위한 MET1 종양 모델의 경우, MET1 세포를 포함하는 10ml의 배양 배지가 있는 T75 플라스크에 100마이크로리터의 초음파 처리된 현탁액을 추가합니다.모든 절차는 생물 안전 캐비닛에서 이루어지며 매체에는 잠재적인 감염을 최소화하기 위해 페니실린과 스트렙토마이신이 포함되어 있습니다. 섭씨 37도에서 72시간 동안 또는 약 80% 포화도에 도달할 때까지 세포를 배양합니다. 배지를 흡인하고 10ml의 PBS로 세포를 5회 세척합니다.5ml의 트립손 EDTA로 세포를 분리합니다. 세포를 채취하고 이전과 같이 원심분리한 후 배제 염료의 세포 샘플을 염색하여 세포 생존율과 수량을 측정합니다. 최소 DMEM에서 100마이크로리터당 100만 개의 세포 농도로 세포를 현탁시킵니다.인슐린 주사기를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 내재화된 미세결정을 포함하는 세포 현탁액 100마이크로리터를 8주 된 암컷 야생형 마우스의 4번 유방 지방 패드에 천천히 주입합니다. 종양의 시작과 성장을 모니터링합니다. EPR 분광 측정의 경우, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마취기를 사용하여 공기 이소플로란 혼합물을 흡입하여 마우스를 마취합니다.표면 코일 재신호기를 정상 유선이나 유방 종양에 배치하여 L-대역 EPR 분광계를 사용하여 기능 측정을 수행합니다. 분광계 조정을 진행합니다. 용해성 프로브의 경우 프로브 주입 직후 5-10분 동안 EPR 스펙트럼을 획득합니다.이식 후 몇 주에 걸쳐 5-10분 동안 이식된 미립자 프로브에서 EPR 스펙트럼을 획득합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 EPR 스펙트럼과 프로브를 분석합니다. 산소에 대한 미립자 LiNc-BuO 프로브의 EPR 스펙트럼 감도가 여기에 나와 있습니다.EPR 스펙트럼은 pO2의 0%와 섭씨 37도에서 측정되었습니다. 산소 분압에 대한 프로브 현탁액의 EPR 스펙트럼의 선 너비의 대표적인 종속 항목이 표시됩니다. 선 너비는 pO2에 따라 선형적으로 증가합니다.마취된 암컷 마우스의 유방 종양 조직에서 측정된 스펙트럼은 7.5mm의 수은 조직 부분 산소에 해당합니다. NR 프로브 용액의 L-밴드 EPR 스펙트럼은 다양한 pH 수준에서 섭씨 37도에서 획득되었습니다. pH에서 관찰된 초미세 분할 상수의 종속 항목이 표시되고 표준 적정 곡선에 적합합니다.여기에 표시된 것은 산화 환원 NR 프로브의 이중 기능 pH에 산소에 민감한 LiNc-BuO 프로브를 결합한 다기능 종양 미세환경 평가입니다. NR의 관찰된 삼중항 스펙트럼은 종양 내에 내장된 LiNc-BuO 프로브의 단일 EPR 라인과 중첩됩니다. 세포 내 조직 글루타티온 농도의 생체 내 EPR 평가가 여기에 나와 있습니다.RSSR 프로브의 경골 내 주입 직후 FVBN 마우스의 정상 유선에서 유방 종양에서 L-밴드 EPR로 측정한 모노라디칼 스펙트럼 엿보기 강도 변화의 동역학이 표시됩니다. 더 빠른 동역학은 종양 조직에서 더 높은 GSH 농도를 반영합니다. 이 기술은 암 연구 분야의 연구자가 종양 미세환경의 세포 생리학적으로 중요한 매개변수와 번역을 위한 전위를 생체 내에서 수행할 수 있는 탁월한 기회를 제공합니다.이전 절차에 따른 프로브의 민감도는 합성 화학에 대한 전문 지식이 필요하며 프리젠테이션에 매우 중요합니다. 우리 센터는 이 기술의 어려움을 보고하고 협력을 통해 현장에 보고했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

hypoxia inducible 인자 - 1α 활동 Bioluminescence 이미징은 유방암 뇌 전이의 마우스 모델에서 종양 intracranial hypoxia 개발을 모니터에 적용됩니다.

유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

여기에서는 전이의 in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane(CAM) 모델과 결합된 종양 세포 대사의 실시간 모니터링을 사용하여 종양 세포를 DNA를 손상시키는 화학 요법에 감작하는 능력에 대해 새로운 항암 표적/제제를 평가하는 데 사용됩니다.

암 약물 과민 반응의 효과를 평가<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

새로운 전자 상자성 공명 (EPR) 방법, 빠른 스캔 EPR (RS-EPR)는, 기존의 연속파 (CW) 기술보다 우수하고 생체 내 이미징을위한 새로운 장소를 엽니 다 2D 스펙트럼 공간 영상에 대한 설명된다. 결과 250 MHz에서 입증되지만, 기술은 주파수에서 적용 가능하다.

빠른 스캔 전자 스핀 공명 이미징 생리 학적으로 중요 매개 변수에 대한 새로운 길을 엽니 다<em&gt; 생체</em

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종양의 전이에 저산소증의 테스트 효과에 대한 생체 내 모델에서

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절제된 인간 종양 표본에서 생체 외 유기형 가성 점액종 복막 종양 절편의 배양 및 이미징

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종양 저산소증 평가: 전자 상자성 공명을 통한 생체 내 3D 산소 이미징 

학습하세요 저전자기공명(EPR) 기술을 활용하여 유방암 동물 모델의 종양 미세환경에서 산소화, 산화환원 상태, pH 및 인산염 농도를 비침습적으로 정량 평가하는 방법을. 이 기술은 종양 재생 및 표적 항암 치료제 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

Vivo에서 PH, pO₂, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

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