쥐 망막 신경 전달 물질 글루타민 산 염에 체 외에서 의 생체 모방 화학 Neuromodulation 위한 방법론

이 방법론의 전반적인 목표는 신경전달물질을 사용하여 망막 뉴런의 새로운 화학적 기반 신경조절을 가능하게 하는 것이며, 이는 신경퇴행성 실명 환자의 결함 있는 망막 세포의 기능을 잠재적으로 대체하여 시력을 회복할 수 있습니다. 이 방법은 인공 시력 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 주요 망막 신경전달물질인 글루타메이트를 사용하여 광수용체가 퇴화한 망막을 치료적으로 자극할 수 있습니까?

우리 기술의 가장 큰 장점은 생체 모방이며, 이러한 방식으로 망막을 자극하면 전기 자극으로 가능한 것보다 더 높은 시력과 더 자연스러운 시력을 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 퇴행성 망막의 조기 치료 개입이 망막 뉴런의 글루타메이트 민감성을 회복할 수 있기 때문에 광수용체 퇴행성 질환으로 인한 실명 치료로 확장됩니다. 이 절차를 시작하려면 적출된 양쪽 눈을 산소가 공급된 신선한 에임스 미디엄 용액과 함께 직경 60mm의 페트리 접시에 넣습니다.

해부 실체 현미경을 사용하여 메스나 날카로운 가위를 사용하여 각막 표면을 작게 절개합니다. 다음으로 이 작은 절개 부위에서 각막 가장자리까지 절개합니다. 그리고 각막의 전체 가장자리를 둘레로 둘레를 넓혀 뻗어 있습니다.

그런 다음 분리된 각막과 수정체, 반투명 수성 및 유리체액을 제거합니다. 한 쌍의 집게로 아이컵을 부드럽게 잡으면서 아이컵의 반대쪽에 두 개의 작은 절개를 조심스럽게 만듭니다. 다음으로, 두 쌍의 집게를 사용하여 각 절개 부위의 아이컵을 부드럽게 잡아당깁니다.

그리고 망막과 공막을 분리합니다. 공막과 아이컵에서 망막 전체를 천천히 들어 올리고 아직 붙어 있는 시신경을 잘라냅니다. 그 후, 망막을 세로로 절개하여 절반 또는 4분의 1 단면을 얻습니다.

그런 다음 신경절 세포가 메쉬에서 반대쪽을 향하도록 나일론 메쉬에 망막 단면 하나를 부드럽게 펴 바릅니다. 메시와 망막을 신경절 세포가 PMEA 표면과 접촉하도록 천공된 MultiElectrode Array에 놓습니다. 그런 다음 망막을 제자리에 유지하기 위해 메쉬 위에 무게를 놓습니다.

이 절차에서는 희미한 빨간색 조명 아래에서 PMEA를 MEA 증폭기에 배치하고 증폭기 래치를 닫습니다. PMEA 챔버 내부에 상단 관류 배출구를 배치하고 상단 관류 밸브를 켜서 분당 약 3밀리리터의 관류 속도를 달성합니다. 그런 다음 상단 흡입구를 원하는 퍼퓨즈 8 레벨로 배치합니다.

작동하는지 확인하십시오. 그런 다음 데이터 수집 소프트웨어를 열고 재생 버튼을 클릭하여 데이터 수신을 시작합니다. 모든 PMEA 채널에 잡음이 없고 신경 신호를 기록하고 있는지 확인합니다.

그렇지 않은 경우 증폭기 내에서 PMEA를 재배치하여 증폭기 핀과 PMEA 접점 사이의 더 나은 접촉을 얻습니다. 그런 다음 하단 관류 라인에 기포가 없는지 확인합니다. 하단 관류 밸브를 켜서 망막에 산소와 영양분이 공급되도록 합니다.

그런 다음 도립 광학 현미경에 부착된 고속 카메라를 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다. 바닥 관류가 흐르는 것으로 확인되면 도립 현미경을 통해 망막을 관찰하면서 진공 폐기물 키트의 진공 압력 손잡이를 수동으로 돌려 바닥 흡입을 천천히 증가시킵니다. 흡입력이 망막에 작용하는 것이 관찰되면 흡입 증가를 중단하십시오.

바닥 흡입으로 망막이 제자리에 고정되었는지 확인한 후 집게를 사용하여 망막의 무게를 덜어내고 망막의 한쪽 모서리를 조심스럽게 벗겨 나일론 메쉬를 부드럽게 제거합니다. 수술 외상으로부터 망막이 안정될 수 있도록 약 30분 동안 관류를 유지하십시오. 이 단계에서는 미리 당겨진 10마이크로미터 직경의 마이크로피펫을 50마이크로미터 직경의 은-은 염화선 전극이 들어 있는 표준 피펫 홀더에 조심스럽게 삽입합니다.

대신 멀티포트 미세유체 장치를 사용하는 경우, 장치에 연결된 스테인리스강 로드를 와이어 전극이 없는 표준 피펫 홀더에 삽입하십시오. 유리 마이크로피펫을 사용하는 경우 피펫 홀더를 패치 클램프 헤드스테이지와 인터페이스하고 피펫 홀더의 압력 포트 하단 연결을 압력 주입 시스템 중 하나의 채널에 연결합니다. 또는 멀티포트 장치를 사용하는 경우 8개 주입 포트 각각의 압력 포트 루어 연결부를 압력 주입 시스템의 채널 1에서 8까지 연결합니다.

그런 다음 수동으로 압력 주입 시스템을 켜고 채널 1을 켭니다. 시스템이 대기로 배출되는지 확인하고 사출 압력을 제곱인치당 0.1파운드로 설정합니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 켜고 매니퓰레이터 컨트롤러의 보정 버튼을 눌러 보정합니다.

마이크로피펫 팁이 MEA 증폭기보다 약 30mm 위에 있도록 마이크로매니퓰레이터를 배치합니다. 그런 다음 작은 페트리 접시에 글루타메이트 용액을 채우고 마이크로 매니퓰레이터 아래에 놓습니다. 마이크로피펫 팁을 용액에 내리고 유리 마이크로피펫 또는 멀티포트 장치 튜브에 약 20mm의 용액을 채웁니다.

그런 다음 마이크로피펫 팁 또는 장치를 용액에서 들어 올립니다. 페트리 접시를 제거하고 마이크로 매니퓰레이터를 PMEA 챔버 위에 놓습니다. 붐 스탠드 장착 실체 현미경을 사용하여 마이크로피펫 팁 또는 장치의 모서리를 PMEA 챔버 링에 새겨진 참조 표시에 맞춥니다.

그런 다음 참조 A 저장 및 참조 B 버튼을 사용하여 매니퓰레이터 위치를 제어 표면에 저장하여 PMEA 전극의 매니퓰레이터의 좌표계를 매핑합니다. 그런 다음 매니퓰레이터 제어 소프트웨어를 사용하십시오. 강력한 자발적 활성을 가진 타겟 PMEA 전극을 선택하고 채널로 이동 버튼을 클릭하여 유리 마이크로피펫을 타겟 전극에 정렬합니다.

멀티포트 장치를 사용하는 경우, 동일한 프로세스를 사용하여 강력한 자발적 활성을 가진 장치 마이크로포트를 대상 PMEA 전극에 맞춥니다. 임피던스 측정이 가능한 경우 패치 cl을 켭니다.amp 증폭기를 켜고 시작 버튼을 클릭하여 임피던스 시각화 소프트웨어를 시작하여 피펫 홀더 내부의 은-은 염화물 전극의 임피던스를 시각화합니다. 실시간 임피던스 신호를 관찰하는 동안 임피던스 신호의 급격한 증가로 표시된 대로 망막 표면에 닿을 때까지 마이크로피펫 또는 장치를 천천히 내립니다.

표면 아래 자극의 경우, S334 tera 3 retinas의 경우 피펫을 40 μm 더 낮추고, 야생형 retinas의 경우 70 microm 더 낮추십시오. 압력 주입 시스템을 사용하여 몇 가지 짧은 시간 주입을 수행합니다. 마이크로피펫 팁 또는 장치 마이크로포트 근처의 세포가 신경 신호를 관찰하여 글루타메이트 자극을 수용하는지 확인합니다.

이제 녹색 LED를 망막의 상단 표면을 향하게 합니다. 파일 이름을 입력하고 기록 버튼을 클릭하여 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 기록을 시작합니다. 녹음이 시작되면 자극 제어 프로그램을 열고 자극 파일 읽기 버튼을 클릭하여 기본 자극 파일을 로드합니다.

그런 다음 run stimulus file 버튼을 클릭하여 기본 stimulus 파일을 시작합니다. 자극 파일이 완료된 후 녹음을 중지하고 향후 스파이크 정렬 및 데이터 분석을 위해 파일을 저장합니다. 다음은 9개의 PMEA 전극의 대표적인 기록으로, 녹색 LED로 시각적 광 자극 중 고역 통과 필터링된 전극 데이터를 보여주며, 각 직사각형은 고유한 전극의 신경 데이터를 보여줍니다.

각 전극 기록은 녹색 LED를 켠 후 1초 동안 수집된 데이터를 보여줍니다. 스파이크는 음의 18마이크로볼트의 임계 전압을 사용하여 식별되었습니다. 시각적 자극은 빛에 대한 억제 반응을 가진 상단 중앙 전극을 제외한 모든 전극에서 스파이크의 폭발을 일으켰습니다.

동일한 전극에 대한 유사한 플롯으로, 시각적 또는 주입 자극 없이 자발적인 신경 활동을 보여줍니다. 비록 더 작은 폭발이 존재했지만, 스파이크의 패턴은 시각적 자극에 대한 반응으로 기록된 것과는 매우 달랐습니다. 다음은 중앙 전극에서 글루타메이트 주입 직후에 기록된 동일한 전극 하위 집합의 대표적인 기록입니다.

주입된 글루타메이트는 중앙 전극에서 시각적으로 유발된 스파이크 폭발과 매우 유사한 스파이크의 폭발을 유발했습니다. 다른 모든 전극은 글루타메이트 주입의 영향을 받지 않았으며, 이는 화학적 자극 기술의 미세한 공간 분해능을 보여줍니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 4-6시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 전체 실험 동안 망막에 산소와 영양분이 지속적으로 공급되도록 관류를 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 인공 시력 및 시각 보철물 개발 분야의 연구자들이 광수용체 퇴행성 질환으로 인한 실명을 치료하기 위한 화학 기반 신경 조절을 탐구할 수 있는 길을 열 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경 전달 물질을 사용하여 망막 뉴런의 신경 조절을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.