Name: 쥐 망막 신경 전달 물질 글루타민 산 염에 체 외에서 의 생체 모방 화학 Neuromodulation 위한 방법론 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: 배우세요 쥐 망막에서 글루타민산염을 이용한 생체 모방 화학적 신경조절 방법을. 광수용체 퇴행성 질환으로 인한 실명 치료를 위한 전기 자극 대안으로 시각 회복에 활용됩니다.

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종이에 표시 하는 작업 했다 국립 과학 재단, 신흥 국경 연구에 의해 지원 되 고 혁신 (NSF EFRI) 프로그램 번호 0938072를 부여. 이 논문의 내용은 전적으로 저자의 책임 하 고 반드시는 NSF의 공식 의견을 대표 하지는 않습니다. 저자는 또한 디자인 하 고 테스트 화학 자극에 대 한 초기 실험 설정 및 씨 Ashwin Raghunathan 설계, 제조, 및 평가에 사용 되는 멀티 포트 미세 장치 그의 작품에 대 한 그의 작품에 대 한 박사 Samsoon Inayat 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는.

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저자는 공개 없다.

여기에 제시 된 방법 어떤 점에서 망막 신경 화학적으로 망막 체 외의 표면으로 네이티브 신경 전달 물질 화학 물질을 주입 하 여 자극 하는 독특한 신경 자극 패러다임을 보여 줍니다. 이 화학 자극 기술은 기존의 전기 자극 기술, 선택도 및 대상 뉴런의 높은 초점 특이성을 포함 하 여 여러 가지 이점을 제공 합니다. 세부 정보 또는 사용자 지정 휘트스톤 멀티 미세 장치 유도 신경 전달 물질의 조미료의 볼륨 공기 주입 되는 대상 망막 신경 중 하나를 사용 하 여 근처 단일 포트 유리 제 micropipette 작은 위의 프로토콜 생리학적으로 상당한 RGC 응답입니다. 이 프로토콜은만 조미료로 입증 되었습니다, 하지만 프로토콜 남아 망막 신경 전달 물질의 다른 종류의 화학 자극을 공부 하는 데 유용. 또한,이 프로토콜을 다른 MEA 설계에 명시 된 대로 electrophysiological 녹음32 는 pMEA를 사용 하는 것이 좋습니다 동안 비 천공 종류를 포함 하 여 사용...

포토 리셉터 퇴행 성 질환, 망막 화 등 나이 관련 황 반 변성 시력 상실의 상속 가능한 원인을 선도 하 고 현재 불 치1,2. 비록 이러한 질병은 특정 유전자 변이의 다양 한에서 발생, 포토 리셉터 퇴행 성 질환 결국 실명을 일으키는 망막에 포토 리셉터 세포의 진보적인 손실 그룹으로 특징입니다. 망막에 걸쳐 개장 하지만 살아남은 망막 신경 세포, 양극 세포와 RGCs를 포함 하 여 광범위 한 대뇌 트리거의 손실 남아 그대로 포토 리셉터 변성3 의 고급 단계에도 상대적으로 기능 ,45,,67.
기계 장치 그리고 이러한 질병의 병 리 잘 특징된3,,45,,67 하지만 효과적인 치료 하기 어려운 남아 있다. 지난 3 년간 전세계 연구자 포토 리셉터 퇴행 성 질병 유전자 치료8, 줄기 세포 치료9를 포함 하 여 영향을 받는 이들에 게 비전을 복원에 대 한 치료 치료의 다양 한 조사 망막 이식10, 그리고 살아남은 망막 신경 세포의 인공 자극11,12 . 이들의 가장 임상적으로 사용할 수는 전통적으로 전기의 목표와 특정 패턴에 양극 세포 또는 RGCs 자극 전극의 배열 활용 인공 신경 장치는 망막 어 두 음 첨가 환자11인공 시각 인식 만들기 아르고스 II13 알파 IMS14 장치, 등 현재 세대 전기 prostheses 임상 승인을 달성 하 고 그들은 향상 시킬 수 있는 삶의 질 환자에 대 한 복원 하 여 예비 연구 표명를 (망막) 다시 망막 (망막의 앞면) 프런트 및 subretinal를 사용 하 여 비전의 측정 장치15,16이식. 전 세계 연구 단체는 이러한 1 세대 장치17,,1819,20 의 성공 넘어 망막 prostheses 발전에 노력 하지만 직면 전기 족 환자에 게 법적 실명 수준 높은 시력 비전을 복원의 설계는 어려움 최근 연구는를 안전 하 게 자극 큰 전극의 사용을 필요로 달성 공간 해상도 보다 높은 해상도 현재 세대에 의해 활성화 기반 전기 prostheses 충전 주입 제한 때문에 도전 이다, 공간 해상도, 즉 시력11,21비용 하는 망막 신경 또한, 전기 자극은 더 크게 하기 때문에 그것은 본질적으로 부자연 스러운 자극 패러다임21때문에 일반적으로 모든 주변 세포를 자극 하 고 따라서 환자, 부자연 스러운 및 혼란 인식 elicits 제한. 그럼에도 불구 하 고, 전기 자극의 초기 성공 그 인공 신경 포토 리셉터 퇴행 성 질환에 대 한 효과적인 치료 될 수 있다 설명 했다. 이것은 훨씬 더 효과적인 치료는 신경 전달 물질 화학 물질, 화학 시 냅 스에서 통신의 자연 대리인과 망막을 자극 하 여 달성 될 것을 가설을 하나. 이 문서에 소개 된 방법의 목적은 biomimetic 대체 전기 자극으로 망막 신경 세포 간의 시 냅 스 통신의 자연 시스템을 모방 하고자 화학 자극의 치료 가능성을 탐구 하는 대 한 망막 족.
화학적으로 활성화 대상 망막 신경 세포는 미세를 통해 출시 하는 조미료 같은 네이티브 신경 전달 물질의 소량에 의존 하는 화학 망막 족을 치료 화학 자극의 개념의 번역 시각적 자극에 대 한 응답에서 microports의 큰 배열을 구성 하는 장치. 이 방법에서는, 화학 망막 족 본질적으로 생체 모방 인공 포토 리셉터 레이어 자연스럽 게 화학 신호를 망막에 도달 하는 광자를 변환 하는 것입니다. 이러한 화학 신호 정상 망막 신호에서 동일한 신경 전달 물질을 사용 하 여 고 정상 시각 경로, 결과 표시에 사용 되는 동일한 시 냅 스 경로 통해 퇴 화 된 망막의 살아남은 망막 신경 세포를 자극 화학 망막 족을 통해 달성 하는 인식 더 자연스럽 고 이해할 수 있는 전기 족을 통해 갖는 것 비교 될 수 있습니다. 또한, 매우 작고 높은 밀도, 전극, 달리 기준점과는 신경 전달 물질 풀어 microports를 만들 수 있습니다 이후 잠재적인 화학 보 수도 더 초점 자극을 얻을 수 및 높은 공간 해상도 전기 족 보다입니다. 따라서, 이러한 잠재적인 이점을 바탕으로, 화학 망막 족 전기 무생물에 대 한 매우 유망한 대안을 제공 합니다.
그러나 화학 자극은 망막의,는 비교적 작은 탐험 되었습니다 최근까지. 망막의 전기 자극을 잘 작업 에 체 외22,23, vivo에서23,24, 그리고 임상 연구13 년간 특징 되었습니다 동안 ,14, 화학 자극에 대 한 연구는 몇 가지 생체 외에서 작품25,26,,2728에 독점적으로 제한 되었습니다. Iezzi 및 Finlayson26 및 Inayat 외. 27 는 망막에서 생체 외에서 를 사용 하 여 단일 전극과 multielectrode 배열 (MEA), 각각, 망막 신경의 조미료 갖는 응답의 화학 자극을 망막 프런트 시연. 더 최근에, Rountree 외. 28 subretinal 측면과 MEA에서 조미료를 사용 하 여 망막에 여러 사이트에서 신경 응답에 망막 통로의 차동 자극을 시연 했다.비록이 작품은 화학 자극의 타당성 설립 예비는, 더 연구는 많은 조사에 필수적인 측면 그 넘어이 접근의 해결 까지는25,,2627 , 28, 위에서 설명한 대로 화학 망막 족에이 개념을 번역 하기 전에 생체 외에서 그리고 vivo에서 동물 모델에서 치료 자극 매개 변수를 조정 하 고. 그러나, 현재 문학에서 망막의 화학 자극을 달성을 위한 아무 설립된 방법론 이며 이전 작품에 사용 되는 방법을 일차 연구는 필수적인 것으로 상세히에서 설명 하지 되었습니다. 따라서,이 방법 종이 대 한 근거 중 우리의 이전 연구27, 복제에 관심이 그 조사에 대 한 망막의 시험관에 화학 자극을 실시 하기 위한 잘 정의 된 프레임 워크를 제공 하는 것입니다. 28 또는 추가 화학 통제의이 초기 개념 발전.
여기 wholemount 망막 야생-타입 쥐와 밀접 하 게 포토 리셉터 퇴행의 진행을 모방 하는 포토 리셉터 퇴 화 한 쥐 모델에서에서 망막 신경 세포의 체 외에 화학 자극을 실시 하는 방법을 보여 줍니다. 인 간에 있는 질병. 다양 한 자극 매개 변수의 치료 범위를 평가 하 고 것이 불가능 하거나 에서 관찰 하기 어려운 신경 응답 특성을 연구 하는 생체 외에서 모델에이 자극 방법을 개발 뒤에 있는 근거 vivo 모델, 특히 초기 연구 중에 초점을 맞춘이 접근 방법의 타당성을 평가. 이 절차에서 우리는 상업적으로 사용할 수 있는 단일 포트 유리 micropipettes 및 사용자 지정을 통해 대상 망막 신경 근처 1mm 조미료의 소량을 제공 하 여 망막의 단일 사이트와 동시 다중 사이트 화학 stimulations를 보여줍니다. 휘트스톤 다중 포트 미세 장치, 각각. 단일 사이트, 다중 사이트 stimulations 화학 neuromodulation의 치료 타당성 조사의 기본 목적을 수행 하는 동안 각각 독특한 이점을 가진 뚜렷한 목적을 제공 합니다. 단일 사이트 자극, 상용 미리 가져온된 유리 micropipettes 함께 수행할 수 있습니다, 단일 사이트에서 망막의 표면에 직접 화학 물질을 주입 하 사용할 수 있으며 관찰 RGC 스파이크 속도 하는 경우를 조사 하는 역 유사한 시각적으로 갖는 빛 응답 응답 사출 사이트 focally elicited 수 있습니다. 다른 한편으로, 특수 가공된 멀티 미세 장치 필요, 다중 사이트 자극 망막의 표면에 여러 사이트에서 공간적으로 화학 물질을 주입 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 얼마나 잘 조미료 갖는 RCG 조사 하는 역 응답 패턴 패턴 자극 연구에 조미료 주입 패턴에 해당합니다.

<table><tbody><tr><td>미세 전극 어레이, 천공 레이아웃</td><td>다중 채널 시스템, GmbH</td><td>60pMEA200/30iR-Ti-pr</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti</td></tr><tr><td>MEA 증폭기</td><td>다중 채널 시스템, GmbH</td><td>MEA1060-Inv</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv</td></tr><tr><td>pMEA 다중 채널 시스템용 하단 관류 접지판</td><td>, GmbH</td><td>MEA1060-Inv-(BC)-PGP</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp</td></tr><tr><td>3축 전동 미세 조작기</td><td>셔터 기기, Novato, CA</td><td>MP-285</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html</td></tr><tr><td>미세 조작기 제어 시스템</td><td>셔터 기기, Novato, CA</td><td>MPC-200</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html</td></tr><tr><td>갠트리 스타일 선형 슬라이드가 있는 micromanipulator 스탠드</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MT-75/LS</td><td>https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html</td></tr><tr><td>8채널 프로그래밍 가능한 다중 채널 압력 인젝터</td><td>OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ 공급업체: Harvard Apparatus UK</td><td>PM-8000 또는 PM-8</td><td>OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm 공급 업체: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail</td></tr><tr><td>Axopatch 200A 통합 패치 클램프 증폭기</td><td>분자 장치, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200A</td><td>Axopatch 200A가 최신 모델 Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier</td></tr><tr><td>패치 클램프로 교체되었습니다. headstage</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV 201A</td><td>http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage</td></tr><tr><td>진공 폐기물 키트</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VMK</td><td>http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/</td></tr> <tr><td>피펫 홀더</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>QSW-A10P</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915</td></tr><tr><td>미리 당겨진 10 &mu; m 팁 직경 유리 마이크로 피펫</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>TIP10TW1</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/</td></tr> <tr><td>Zoom 실체 현미경</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td>SMZ-745T</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745</td></tr><tr><td>현미경 붐 스탠드 듀얼 리니어 볼 포함 베어링 암</td><td>Old School Industries, Inc., Dacono, CO</td><td>OS1010H-16BB</td><td>http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm</td></tr><tr><td>줌 스테레오 현미경 (C-LEDS 하이브리드 LED 스탠드</td><td>포함) 니콘, 도쿄, 일본</td><td>SMZ-445</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445</td></tr><tr><td>도립 현미경 시스템</td><td>니콘, 도쿄, 일본</td><td>이클립스 Ti-E</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E</td></tr><tr><td>Ames 매체</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420</td></tr><tr><td>L-글루탐산(글루타메이트)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S8761</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761</td></tr><tr><td>60mm 페트리 접시 (높이 10mm)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>FB0875713A</td><td>60mm 투명 페트리 접시; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a</td></tr><tr><td>Jewelers #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>555227F</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/</td></tr> <tr><td>Standard Scalpel Blad #24</td><td>World Precision Instruments, 플로리다주 새러소타</td><td>500247 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/</td><td></td></tr> <tr><td>메스 핸들 #4</td><td>World Precision Instruments, 플로리다주 새러소타</td><td>500237</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/</td></tr> <tr><td>Vannas Tubingen 해부 가위</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>503378</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/</td></tr> <tr><td>나일론 메쉬 키트</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>NYL/MESH</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173</td></tr><tr><td>Harp 슬라이스 그리드</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>HSG-5AD</td><td>http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/</td></tr> <tr><td>Ag/AgCl 기준 전극 펠릿</td><td>다중 채널 시스템, GmbH</td><td>P1060</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/p1060</td></tr><tr><td>4채널 밸브 제어 중력 관류 시스템</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VC3-4xG</td><td>http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/</td></tr> <tr><td>Zyla 5.5 sCMOS 현미경 카메라</td><td>Andor Technology, 벨파스트, 영국</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td>http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos</td></tr><tr><td>Silver wire (50 &mu; m 직경)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>AA44461G5</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 Tygon 마이크로보어 튜빙(직경 1.6mm)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 스틸 캐뉼라</td><td>가 있는 틸팅 툴 홀더ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>TILTPORT</td><td>이들 각각이 최고 관류 및 흡입에 사용되었습니다. http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/</td></tr> <tr><td>Roscolux #26 Light Red Filter Sheet</td><td>Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT</td><td>R2611</td><td>제조사: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux 공급 업체: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html</td></tr><tr><td>Smith & 웨슨 갤럭시 레드 손전등</td><td>스미스 & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA</td><td>4588</td><td>제조사 : https://www.smith-wesson.com/ 공급 업체 : http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588</td></tr><tr><td>MC_Rack Software</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MC_Rack</td><td>http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack</td></tr><tr><td>Labview Software</td><td>National Instruments, 텍사스 주 오스틴</td><td>LabVIEW</td><td>http://www.ni.com/labview/</td></tr> <tr><td>NIS-Elements : 기초 연구 소프트웨어</td><td>니콘, 도쿄, 일본</td><td>NIS-Elements BR</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research</td></tr></tbody></table>

쥐 망막 신경 전달 물질 글루타민 산 염에 체 외에서 의 생체 모방 화학 neuromodulation 위한 방법론

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

포토 리셉터 퇴행 성 질병 망막에 포토 리셉터 세포의 진보적인 손실 통해 돌이킬 실명을 일으킬. 망막 어 두 음 첨가 인위적으로 환자에 이해할 수 있는 시각적 인식을 도출의 희망에서 살아남은 망막 신경 세포를 자극 하 여 비전을 복원 하는 포토 리셉터 퇴행 성 질환에 대 한 신흥 치료. 현재 망막 prostheses 전기 망막을 자극 하지만 높은 시력, 환자에 게 자연의 비전을 복원에 상당한 물리적 장벽을 얼굴에 전극의 배열 사용 하 여 환자에 게 제한 된 비전을 복원에 성공 설명 했다. 기본 신경 전달 물질을 사용 하 여 화학 신경 biomimetic 전기 대체 자극 이며 전기 통제를 사용 하 여 망막 어 두 음 첨가와 관련 된 근본적인 한계를 우회할 수 있습니다. 특히, 화학 신경은 신경 전달 물질, 망막에서 사용 하는 통신의 같은 자연 대리인의 아주 소량을 주입 하 여 환자에 필적 하거나 더 나은 visual acuities와 더 많은 자연의 비전을 복원 가능성이 있다 화학 synapses 현재 전기 무생물 보다 훨씬 미세한 해상도에. 그러나, 상대적으로 미개척된 자극 패러다임으로 시험관에서망막의 화학 자극을 달성 하기 위한 아무 설립된 프로토콜이입니다. 이 작품의 목적은 망막의 화학 neuromodulation의 잠재적인 또는 이와 유사한 공부 하고자 수 사관에 대 한 망막의 화학 자극을 달성을 위한 구체적인된 프레임 워크를 제공 하는 신경 조직 체 외. 이 작품에서 우리 실험 설치 및 망막 신경 절 세포 (RGC) 스파이크 응답 비슷한 시각적 빛 응답 야생-타입에서 도출을 위한 방법론을 설명 하 고 주입 하 여 포토 리셉터 전락 wholemount 쥐 망막의 볼륨 제어 유리 micropipettes를 사용 하 여 사용자 지정 멀티 미세 장치 subretinal 공간으로 신경 전달 물질 조미료. 이 방법론 및 프로토콜 충분히 일반적인 neuromodulation 다른 신경 전달 물질 또는 다른 신경 조직을 사용 하 여 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜 화학적으로 자극 하는 정상, 야생-타입 망막 뿐만 아니라 포토 리셉터를 사용할 수 있는 실질적인 셀룰러 개장은 대뇌의 손실에 의해 발생에 불구 하 고 망막 퇴 화. 전락 중 포토 리셉터와 함께 실험을 시작 하거나 야생-타입 망막, 기록 및 자극 장비 (그림 1 및 그림 2) 필요가 준비 될 및 pMEA (그림 5)을 최소화 하기 위해 청소 해야 하기 전에 각 전극 채널 (그림 6)에 잡음. 포토 리셉터 전락 비록 망막은 얇고 따라서 야생-타입 망막 보다 더 섬세 한, 같은 해 부 절차 (그림 4) 모두에 사용 됩니다. 다음 해 부, 망막은 신중 하 게 배치 pMEA ganglion 셀 면 전극,...

이 프로토콜 wholemount 쥐 망막에서 생체 외에서 신경 전달 물질 글루타민 산 염의 화학 신경의 형태를 조사 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 화학 신경 망막의 포토 리셉터 퇴행 성 질환으로 인 한 돌이킬 수 없는 실명을 치료에 대 한 기존의 전기 통제에 유망한 대안 이다.

쥐 망막 신경 전달 물질 글루타민 산 염에 체 외에서 의 생체 모방 화학 Neuromodulation 위한 방법론

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

이 방법론의 전반적인 목표는 신경전달물질을 사용하여 망막 뉴런의 새로운 화학적 기반 신경조절을 가능하게 하는 것이며, 이는 신경퇴행성 실명 환자의 결함 있는 망막 세포의 기능을 잠재적으로 대체하여 시력을 회복할 수 있습니다. 이 방법은 인공 시력 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 주요 망막 신경전달물질인 글루타메이트를 사용하여 광수용체가 퇴화한 망막을 치료적으로 자극할 수 있습니까?우리 기술의 가장 큰 장점은 생체 모방이며, 이러한 방식으로 망막을 자극하면 전기 자극으로 가능한 것보다 더 높은 시력과 더 자연스러운 시력을 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 퇴행성 망막의 조기 치료 개입이 망막 뉴런의 글루타메이트 민감성을 회복할 수 있기 때문에 광수용체 퇴행성 질환으로 인한 실명 치료로 확장됩니다. 이 절차를 시작하려면 적출된 양쪽 눈을 산소가 공급된 신선한 에임스 미디엄 용액과 함께 직경 60mm의 페트리 접시에 넣습니다.해부 실체 현미경을 사용하여 메스나 날카로운 가위를 사용하여 각막 표면을 작게 절개합니다. 다음으로 이 작은 절개 부위에서 각막 가장자리까지 절개합니다. 그리고 각막의 전체 가장자리를 둘레로 둘레를 넓혀 뻗어 있습니다.그런 다음 분리된 각막과 수정체, 반투명 수성 및 유리체액을 제거합니다. 한 쌍의 집게로 아이컵을 부드럽게 잡으면서 아이컵의 반대쪽에 두 개의 작은 절개를 조심스럽게 만듭니다. 다음으로, 두 쌍의 집게를 사용하여 각 절개 부위의 아이컵을 부드럽게 잡아당깁니다.그리고 망막과 공막을 분리합니다. 공막과 아이컵에서 망막 전체를 천천히 들어 올리고 아직 붙어 있는 시신경을 잘라냅니다. 그 후, 망막을 세로로 절개하여 절반 또는 4분의 1 단면을 얻습니다.그런 다음 신경절 세포가 메쉬에서 반대쪽을 향하도록 나일론 메쉬에 망막 단면 하나를 부드럽게 펴 바릅니다. 메시와 망막을 신경절 세포가 PMEA 표면과 접촉하도록 천공된 MultiElectrode Array에 놓습니다. 그런 다음 망막을 제자리에 유지하기 위해 메쉬 위에 무게를 놓습니다.이 절차에서는 희미한 빨간색 조명 아래에서 PMEA를 MEA 증폭기에 배치하고 증폭기 래치를 닫습니다. PMEA 챔버 내부에 상단 관류 배출구를 배치하고 상단 관류 밸브를 켜서 분당 약 3밀리리터의 관류 속도를 달성합니다. 그런 다음 상단 흡입구를 원하는 퍼퓨즈 8 레벨로 배치합니다.작동하는지 확인하십시오. 그런 다음 데이터 수집 소프트웨어를 열고 재생 버튼을 클릭하여 데이터 수신을 시작합니다. 모든 PMEA 채널에 잡음이 없고 신경 신호를 기록하고 있는지 확인합니다.그렇지 않은 경우 증폭기 내에서 PMEA를 재배치하여 증폭기 핀과 PMEA 접점 사이의 더 나은 접촉을 얻습니다. 그런 다음 하단 관류 라인에 기포가 없는지 확인합니다. 하단 관류 밸브를 켜서 망막에 산소와 영양분이 공급되도록 합니다.그런 다음 도립 광학 현미경에 부착된 고속 카메라를 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다. 바닥 관류가 흐르는 것으로 확인되면 도립 현미경을 통해 망막을 관찰하면서 진공 폐기물 키트의 진공 압력 손잡이를 수동으로 돌려 바닥 흡입을 천천히 증가시킵니다. 흡입력이 망막에 작용하는 것이 관찰되면 흡입 증가를 중단하십시오.바닥 흡입으로 망막이 제자리에 고정되었는지 확인한 후 집게를 사용하여 망막의 무게를 덜어내고 망막의 한쪽 모서리를 조심스럽게 벗겨 나일론 메쉬를 부드럽게 제거합니다. 수술 외상으로부터 망막이 안정될 수 있도록 약 30분 동안 관류를 유지하십시오. 이 단계에서는 미리 당겨진 10마이크로미터 직경의 마이크로피펫을 50마이크로미터 직경의 은-은 염화선 전극이 들어 있는 표준 피펫 홀더에 조심스럽게 삽입합니다.대신 멀티포트 미세유체 장치를 사용하는 경우, 장치에 연결된 스테인리스강 로드를 와이어 전극이 없는 표준 피펫 홀더에 삽입하십시오. 유리 마이크로피펫을 사용하는 경우 피펫 홀더를 패치 클램프 헤드스테이지와 인터페이스하고 피펫 홀더의 압력 포트 하단 연결을 압력 주입 시스템 중 하나의 채널에 연결합니다. 또는 멀티포트 장치를 사용하는 경우 8개 주입 포트 각각의 압력 포트 루어 연결부를 압력 주입 시스템의 채널 1에서 8까지 연결합니다.그런 다음 수동으로 압력 주입 시스템을 켜고 채널 1을 켭니다. 시스템이 대기로 배출되는지 확인하고 사출 압력을 제곱인치당 0.1파운드로 설정합니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 켜고 매니퓰레이터 컨트롤러의 보정 버튼을 눌러 보정합니다.마이크로피펫 팁이 MEA 증폭기보다 약 30mm 위에 있도록 마이크로매니퓰레이터를 배치합니다. 그런 다음 작은 페트리 접시에 글루타메이트 용액을 채우고 마이크로 매니퓰레이터 아래에 놓습니다. 마이크로피펫 팁을 용액에 내리고 유리 마이크로피펫 또는 멀티포트 장치 튜브에 약 20mm의 용액을 채웁니다.그런 다음 마이크로피펫 팁 또는 장치를 용액에서 들어 올립니다. 페트리 접시를 제거하고 마이크로 매니퓰레이터를 PMEA 챔버 위에 놓습니다. 붐 스탠드 장착 실체 현미경을 사용하여 마이크로피펫 팁 또는 장치의 모서리를 PMEA 챔버 링에 새겨진 참조 표시에 맞춥니다.그런 다음 참조 A 저장 및 참조 B 버튼을 사용하여 매니퓰레이터 위치를 제어 표면에 저장하여 PMEA 전극의 매니퓰레이터의 좌표계를 매핑합니다. 그런 다음 매니퓰레이터 제어 소프트웨어를 사용하십시오. 강력한 자발적 활성을 가진 타겟 PMEA 전극을 선택하고 채널로 이동 버튼을 클릭하여 유리 마이크로피펫을 타겟 전극에 정렬합니다.멀티포트 장치를 사용하는 경우, 동일한 프로세스를 사용하여 강력한 자발적 활성을 가진 장치 마이크로포트를 대상 PMEA 전극에 맞춥니다. 임피던스 측정이 가능한 경우 패치 cl을 켭니다.amp 증폭기를 켜고 시작 버튼을 클릭하여 임피던스 시각화 소프트웨어를 시작하여 피펫 홀더 내부의 은-은 염화물 전극의 임피던스를 시각화합니다. 실시간 임피던스 신호를 관찰하는 동안 임피던스 신호의 급격한 증가로 표시된 대로 망막 표면에 닿을 때까지 마이크로피펫 또는 장치를 천천히 내립니다.표면 아래 자극의 경우, S334 tera 3 retinas의 경우 피펫을 40 μm 더 낮추고, 야생형 retinas의 경우 70 microm 더 낮추십시오. 압력 주입 시스템을 사용하여 몇 가지 짧은 시간 주입을 수행합니다. 마이크로피펫 팁 또는 장치 마이크로포트 근처의 세포가 신경 신호를 관찰하여 글루타메이트 자극을 수용하는지 확인합니다.이제 녹색 LED를 망막의 상단 표면을 향하게 합니다. 파일 이름을 입력하고 기록 버튼을 클릭하여 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 기록을 시작합니다. 녹음이 시작되면 자극 제어 프로그램을 열고 자극 파일 읽기 버튼을 클릭하여 기본 자극 파일을 로드합니다.그런 다음 run stimulus file 버튼을 클릭하여 기본 stimulus 파일을 시작합니다. 자극 파일이 완료된 후 녹음을 중지하고 향후 스파이크 정렬 및 데이터 분석을 위해 파일을 저장합니다. 다음은 9개의 PMEA 전극의 대표적인 기록으로, 녹색 LED로 시각적 광 자극 중 고역 통과 필터링된 전극 데이터를 보여주며, 각 직사각형은 고유한 전극의 신경 데이터를 보여줍니다.각 전극 기록은 녹색 LED를 켠 후 1초 동안 수집된 데이터를 보여줍니다. 스파이크는 음의 18마이크로볼트의 임계 전압을 사용하여 식별되었습니다. 시각적 자극은 빛에 대한 억제 반응을 가진 상단 중앙 전극을 제외한 모든 전극에서 스파이크의 폭발을 일으켰습니다.동일한 전극에 대한 유사한 플롯으로, 시각적 또는 주입 자극 없이 자발적인 신경 활동을 보여줍니다. 비록 더 작은 폭발이 존재했지만, 스파이크의 패턴은 시각적 자극에 대한 반응으로 기록된 것과는 매우 달랐습니다. 다음은 중앙 전극에서 글루타메이트 주입 직후에 기록된 동일한 전극 하위 집합의 대표적인 기록입니다.주입된 글루타메이트는 중앙 전극에서 시각적으로 유발된 스파이크 폭발과 매우 유사한 스파이크의 폭발을 유발했습니다. 다른 모든 전극은 글루타메이트 주입의 영향을 받지 않았으며, 이는 화학적 자극 기술의 미세한 공간 분해능을 보여줍니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 4-6시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 전체 실험 동안 망막에 산소와 영양분이 지속적으로 공급되도록 관류를 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 인공 시력 및 시각 보철물 개발 분야의 연구자들이 광수용체 퇴행성 질환으로 인한 실명을 치료하기 위한 화학 기반 신경 조절을 탐구할 수 있는 길을 열 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경 전달 물질을 사용하여 망막 뉴런의 신경 조절을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

이 연구로, 우리는 미래의 임상 치료 테스트를위한 격리 superfused 소 망막을위한 표준화 된 스트레스 모델을 소개합니다. A- 및 B- 파의 진폭에 의해 표현 망막 함수에 어느 저산소증 (순수한 N 2) 응력 또는 글루타메이트 (250 μM 글루타메이트)의 효과를 평가 하였다.

고립 된 관류 척추 동물의 망막에 대한 스트레스 모델로 글루타민산과 저산소증

postembedding immunogold 방법은 특정 분자의 세포 내 국소화에 대한 고해상도 분석을 제공하는 가장 효과적인 방법 중 하나입니다. 여기에서는 망막 리본 시냅스에서 글루타메이트 수용체를 정량적으로 분석하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

이 논문은 신경전달물질 수용체의 발현을 정량화하는 방법과 광유전학 도구의 바이러스 전달과 동결-파괴 복제 면역 표지 기술의 조합을 사용하여 식별된 시냅스 전후 요소로 시냅스에서 분석된 패턴을 설명합니다.

Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

여기서는 토닉과 효소 결합 된 미세 배열 (MEA)를 사용하여 생체 내 세포 외 글루타메이트 phasic 변화를 측정하는 공간적 및 시간적 정확한 방법에 대한 설치 소프트웨어 탐색 및 데이터 분석을 기술한다.

효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

여기에서 우리는 시험관 외 Ca에서 측정 하는 프로토콜을 제시2+ 중간 뇌 뉴런에서 플럭스와 1 차 마우스 중간 두뇌 문화를 사용 하 여 caspase-3에 그들의 다운 스트림 효과. 이 모델은 중뇌 뉴런에서 비정상적인 Ca2+ 활동과 관련된 병리학적 변화를 연구하고, 세포세포 항세포 특성에 대한 새로운 치료법을 선별하기 위해 사용될 수 있다.

기본 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적인 Ca2+ 플럭스와 다운스트림 효과를 정량화

우리는 신경 손상 후 후각 내성 glia (OEG) 신경 재생 능력을 평가하는 체외 모델을 제시한다. 그것은 RGN 축상 및 somatodritic 마커를 분석해서, OEG 단층 및 축 변성의 후속 연구 결과에 축축한 성인 망막 신경절 신경절 뉴런 (RGN)의 공동 문화를 기반으로합니다.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

기존 다중 전극 어레이 또는 패치 클램프 장비를 수정하면 생체 외 망막전전도에 더 널리 접근할 수 있습니다. 생체 외 광 반응을 기록하고 유지하는 개선된 방법은 건강한 망막, 안과 질환의 동물 모델 및 인간 기증자 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능의 연구를 용이하게 합니다.

작고 큰 눈의 망막 기능을 연구하기 위해 생체 외 망막 전도의 설정 및 조건 최적화

이 프로토콜은 Xenopus laevis 난모세포로 시냅스 막의 미세 이식을 수행함으로써 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산 및 γ-아미노부티르산 수용체의 일관되고 신뢰할 수 있는 반응을 기록할 수 있음을 입증한다.

기능적 연구를 위한 인간 시냅틱 수용체를 재활성화하기 위한 시냅틱 멤브레인의 미세이식

망막 보철물은 시각적 지각을 생성하는 능력이 있습니다. 새로운 보철물의 개발을 앞당기기 위해서는 이식 전에 장치를 테스트하기 위한 생체 외 방법이 필요합니다. 이 논문은 전기 자극을 받았을 때 망막 신경절 세포층의 칼슘 활성을 연구하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

전기적으로 자극된 평판 장착 망막의 칼슘 이미징

배우세요 쥐 망막에서 글루타민산염을 이용한 생체 모방 화학적 신경조절 방법을. 광수용체 퇴행성 질환으로 인한 실명 치료를 위한 전기 자극 대안으로 시각 회복에 활용됩니다.

쥐 망막 신경 전달 물질 글루타민 산 염에 체 외에서 의 생체 모방 화학 Neuromodulation 위한 방법론

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