측 두 엽 간 질 및 뇌 파 마우스에 Radiotelemetry 시스템을 사용 하 여 모니터링 Pilocarpine 모델

이 원고 조직의 pilocarpine 주입 상태 epilepticus를 유도 및 무선 원격 비디오 및 뇌 파 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에 자발적인 재발 성 발작을 모니터링 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 만성 간 질, epileptogenesis, 그리고 급성 발작의 pathophysiologic 메커니즘을 공부에 대 한 이용하실 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 필로카르핀을 사용하여 간질 상태를 유도하고 마우스에서 방사선 원격 측정 시스템을 사용하여 자연 재발성 발작을 모니터링하는 것입니다. 이 프로토콜은 급성 발작, 간질 형성 및 만성 간질의 병태 생리학 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 급성 발작 후 높은 생존율과 함께 자발적 재발성 발작을 보여주는 만성 간질의 마우스 모델을 제공하는 것입니다.

저희 연구실의 박사후 연구원인 김지은 박사님께서 시연하실 예정입니다. 8주 된 수컷 쥐 각각의 무게를 잰 것으로 시작합니다. 스코폴라민과 테르부탈린 1kg당 2mg, 필로카르핀 용액 1kg당 280mg을 만듭니다.

그런 다음 용액을 각 마우스에 복강내 주입하고 마우스를 케이지로 되돌립니다.스코폴라민과 테르부탈린 투여 30분 후 각 마우스에 필로카르핀 용액을 주입합니다. 필로카르핀 주사 직후, 관찰을 위해 마우스를 섭씨 28-30도의 인큐베이터에 넣습니다.

다음으로, 간질 상태(status epilepticus, SE)가 유발될 때까지 마우스의 행동을 모니터링합니다. 라신의 척도에 따라 3단계 이상에 해당하는 변연계 운동 발작이 감지되면 시간을 기록하고 마우스를 모니터링합니다. 지속적인 운동 발작이 2분 이상 지속되면 마우스를 실온의 새 케이지에 넣고 3시간 동안 계속 모니터링하여 경련 발작이 계속되고 SE가 유발되는지 확인합니다.

그런 다음 SE 발병 후 3시간 후에 디아제팜 용액 1kg당 10mg을 주사하여 행동성 급성 발작을 종결시킵니다. 디아제팜 주사 후, 회복을 돕기 위해 개별 마우스 1마리당 5%포도당 1ml를 투여합니다. SE 유도 후 1일차에 마우스의 무게를 측정하고 하루 더 인큐베이터에 보관합니다.

SE 유도 후 2일차에 생쥐의 무게를 측정하고 집 케이지로 되돌립니다. 회복을 돕기 위해 촉촉한 음식을 제공하십시오. 마지막으로, 필로카르핀 투여 후 7일까지 동물의 일일 체중을 측정합니다.

그리고 체중이 증가하지 않으면 마우스에 5%포도당을 주입합니다. SE 유도 후 4주 후에 12주 된 생쥐를 준비하여 EEG 모니터링을 위한 원격 측정 이식을 수행합니다. 이어바와 바이트 플레이트가 있는 입체 프레임에 마우스를 놓고 실명을 방지하기 위해 양쪽 눈에 수의사 연고를 바르십시오.

그런 다음 수술 중 무균 상태를 유지하기 위해 면도날을 사용하여 수술 부위를 면도하고 수술 부위의 털이 오염되지 않도록 주의하십시오. 면도 후 70% 에탄올과 요오드 용액으로 피부를 소독합니다. 다음으로 PBS에 적신 면봉으로 피부를 닦은 다음 70% 에탄올과 요오드 용액을 닦습니다.

가위로 머리 중앙을 세로로 절개하여 람다, 브레그마, 목표 위치를 드러냅니다. 그런 다음 드릴 비트를 브레그마에 배치하고 이 점의 X, Y 좌표를 기록하여 나사의 좌표를 계산합니다. 그런 다음 드릴 비트를 천천히 내려 버 구멍을 만들고 두개골이 얇아지는 지점에 드릴 비트를 너무 많이 삽입하지 않도록 주의하십시오.

단채널 무선 EEG 송신기의 본체를 목덜미 뒤에 피하로 삽입하고 두개골 근처에 유연한 리드를 놓습니다. 그런 다음 핀셋으로 각 버 구멍에 스테인리스 스틸 나사를 넣고 드라이버를 사용하여 시계 방향으로 돌려 조입니다. 경막이나 뇌 조직의 손상을 방지하기 위해 나사가 너무 깊숙이 삽입되지 않도록 하십시오.

리드 끝에서 절연 코팅을 2mm 벗겨내고 와이어와 나사 사이의 양호한 연결을 위해 나사 샤프트를 둥글게 만들 만큼 충분히 길게 와이어를 늘립니다. 참조 리드를 전면 나사에 연결하고 녹음 리드를 두정엽 피질의 나사에 연결합니다. 그런 다음 치과 시멘트를 바르고 금속 부품이 노출되지 않도록 전체 어셈블리를 제자리에 고정합니다.

마지막으로 치과용 시멘트가 건조된 후 피부를 봉합하고 국소 무피로신 연고를 바릅니다. 수술에서 회복될 때까지 마우스를 섭씨 30도의 인큐베이터에 혼자 넣습니다. 그런 다음 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.

먼저 개별 케이지에 마우스를 배치하고 패러데이 케이지가 설치된 무선 수신기 플레이트 위에 케이지를 배치하여 컴퓨터, AC 라인 및 인접 수신기를 포함한 모든 소스의 전기 신호 중단을 방지합니다. 그런 다음 무선 비디오-EEG 원격 측정 시스템을 사용하여 전기 활동을 기록합니다. 2주 동안 감지된 총 SRS 사례 수를 각 개별 동물의 총 기록 일수로 나누어 발작 빈도를 결정합니다.

그런 다음 발작 지속 시간을 분석하기 위해 간질 스파이크 활동의 시작부터 끝까지의 시간을 측정합니다. 비디오 EEG 기록이 완료되고 뇌가 고정되면 세척 후 재사용하기 위해 마우스에서 송신기를 회수합니다. 이렇게하려면 집게를 사용하여 리드 주위의 치과 시멘트를 제거하십시오.

그런 다음 치과 시멘트가 용해될 때까지 리드의 끝을 100% 아세톤에 치과 시멘트로 담그십시오. 다음으로, 트랜스미터를 증류수로 헹궈 트랜스미터 주변의 조직 오염 물질을 제거합니다. 마지막으로 트랜스미터를 70% 에탄올로 3시간 동안 헹구고 자연 건조하여 보관합니다.

SE 후 7일째 되는 날에, 치상회(dentate gyrus)의 문턱(hilar) 영역과 해마의 CA3 하위장(subfield)의 피라미드 세포층(pyramidal cell layer)에서 pyknotic cell이 검출되었습니다. SE 후 6주가 지나서, 문턱 세포의 수가 현저히 감소하는 것이 관찰되었습니다. 또한, CA1 및 CA3 영역에서 신경 세포 손실이 관찰되었습니다.

또한, 생리적 전기적 활성을 보이는 가짜 그룹과 비교했을 때, SE 그룹은 때때로 경련 행동을 동반한 간질 방전을 보였다. 이식 수술 중 경막외 나사를 과도하게 깊게 삽입하면 피질 손상이 유발될 수 있으며, 이는 가짜 조작 동물에서도 자연 발작을 유발할 수 있습니다. 일단 숙달되면, 간질 유도 및 나사 이식은 적절하게 수행되면 한 시간 안에 완료 할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 필로카르핀 주사 후 행동 징후를 기억하고 이식 수술 중 뇌 조직을 손상시키지 않는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 만성 간질의 기억 및 운동 문제에 대한 행동 테스트와 같은 다른 방법을 수행하여 간질 관련 회로 문제와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생쥐의 간질 상태를 유도하고 만성 발작을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.