Name: 순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 학습하세요 기능화된 의료 와이어를 이용한 순환 종양 세포 캡처 및 면역형광 DNA-FISH 기반 3차원 특성 분석 방법입니다. 이 기술은 비소세포폐암 세포의 면역표현형과 유전적 변화를 동시에 식별하여 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

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1. 면역-DNA 물고기 2D Coverslip에
<ol>
	<li>시드 Coverslip 준비 및 부착 세포 참고: 메 마른 조건에서 층 류 흐름 후드 아래 모든 다음 단계를 수행 합니다.<ol>
		<li>그들을 소독 100% 에탄올으로는 coverslip 담가. 참고: 우리는 12 m m × 12 m m 실리콘 지원 제곱된 coverslips (모든 시 약은 재료의 테이블에에서 나열 된)를 사용 합니다.</li>
		<li>페 트리 접시 (직경 100 m m)에 coverslips를 놓습니다. 5 분 동안 공기 흐름 강제 건조를 사용 하 여.</li>
		<li>워시와 15 mL 살 균 1 × Dulbecco의 성 페 트리 접시 버퍼링 식 염 수 (PBS).</li>
		<li>완전 한 매체의 10 mL를 페 트리 접시를 세척 ( 표 1참조).</li>
		<li>부착 세포 씨앗 (FACS 분석에 의해 매체의 10 mL에 약 1,650,000 셀 계산) 균일 한 셀 도금 (약 30, 000 셀/cm2)를 페 트리 접시에 세포 현 탁 액을 부드럽게 놓아. : 참고 ~ 70% 합류, 점착 세포 적어도 48 h에 대 한 coverslips에 경작 한다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>고정 및 permeabilization 주의: 아세톤은는 가연성 및 휘발성 물질을 자극. 만 아세톤-내성 플라스틱 또는 유리 용기 (PVC 또는 PVDF)를 사용 합니다. 참고: 화학 증기 두건에서 이러한 단계를 수행 합니다.<ol>
		<li>사용 하는 일회용 aspirating 피펫으로 문화 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>1 × PBS 페 트리 접시를 씻어.</li>
		<li>핀셋을 사용 하 여, 1 × PBS의 5 mL를 포함 하는 유리 비 커에 그들을 담거 서는 coverslips 세척.</li>
		<li>건조 압 지에 coverslips.</li>
		<li>실 온 (RT)에서 10 분 100% 아세톤 솔루션에 그것을 immersing 하 여는 coverslip에 셀을 수정.</li>
		<li>족집게는 coverslip을 제거 합니다. 5 분 동안 공기 흐름을 사용 하는 coverslip 드라이. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지이 시점에서. -20 ° c.에는 coverslip은 저장 한다</li>
	</ol>
	</li>
	<li>면역 형광 검사 일 1 참고:이 단계에서는 하룻밤 (O/N) 외피 (~ 16 h).<ol>
		<li>1 × PBS에에서는 coverslips를 두 번 세척.</li>
		<li>항 체 희석 버퍼의 100 µ L를 드롭 (자세한 내용은 표 1 을 참조)는 coverslip에 실시간에 30 분 동안 품 어 고 참고: 솔루션 볼륨 전체 coverslip 커버 하 고 오버플로 위험을 방지 하기 위해 coverslip 표면에 근거 하 여 조정 되어야 한다.</li>
		<li>1시 20분을 사용 하 여 항 체 혼합 (표 1) 준비 기본 단일 클로 널 항 체의 희석 제조업체에서 제공 하는 데이터 시트에 지정 된 대로 형광 색소 및 항 체 희석 버퍼 활용. 참고: 그것은 강력 하 게 내 형광 색소와 함께 활용 하는 단일 클론 항 체를 사용 하 여 좋습니다. 내 비 형광 색소를 사용 하는 프로토콜의 DNA-물고기 단계 활용 온도 형광 색소를 손상 하 고 형광 방출 소화 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 EpCAM FITC 항 체에 대 한 하기로 했다 (1시 20분 희석)는 사용된 온도와 어떤 중요 한 문제가 나타나지 않았다.</li>
		<li>린스는 coverslips 1 × PBS에 두 번.</li>
		<li>Coverslips 셀 쪽 위로 습 한 약 실 및 드롭 100 µ L는 coverslip에 항 체 혼합의 장소. 참고: 솔루션 볼륨 전체 coverslip 커버 하 여 과잉의 위험을 줄일 coverslip 표면에 근거 하 여 조정 되어야 한다.</li>
		<li>O/N을 품 어 (~ 16 h) 4 ° c.에 어둠 속에서</li>
	</ol>
	</li>
	<li>면역 형광 검사 주 2
	<ol>
		<li>1 × PBS에에서는 coverslips를 두 번 세척 하 여 항 체 외피를 차단 합니다. 참고: 저장소는 coverslips에에서 몰두 어둠 속에서 지속적인 습기 환경 챔버에 4 ° C에서 1 × PBS의 100 µ L 물고기 분석 결과 수행 될 때까지.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2D DNA-물고기 하루 2 주의: 특별 한 주의 악기와 습 한 챔버의 높은 온도에 지불 한다.<ol>
		<li>교 잡 오븐 및 건조 열 오븐을 설정 (~ DNA-물고기 프로토콜을 시작 하기 전에 3 h). 75 ° C에서 교 잡 오븐을 설정 37 ° C에서 열 건조 오븐을 설정 하 고 0.4 × SSC 솔루션을 냉각 (pH = 7.0 ± 0.1) (SSC 레시피 표 1참조) 4 ° c 참고: 물고기 버퍼의 pH 상태는 중요 한: pH 7.0 ± 0.1 =.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 0.4 × SSC 솔루션에는 coverslip 세 번을 씻어.</li>
		<li>어둠 속에서 10 분 동안 화학 연기 후드 coverslip 건조.</li>
		<li>10 소용돌이의 프로브 튜브의 벽에서 프로브 (최대 속도)에서 내려 빠른 스핀을 수행.</li>
		<li>슬라이드와 물개 고무 시멘트 coverslip의 모든 가장자리에 물고기 조사의 5 µ L의 방울에 coverslip 셀 쪽 아래로 놓습니다. 주의: 다음 두 단계는 높은 온도 포함 한다. 보호 장갑을 착용 하십시오.</li>
		<li>완전 한 DNA 변성에 대 한 75 ° C에서 8 분 교 잡 오븐에 어두운 습 챔버에 슬라이드를 넣어.</li>
		<li>37 건 열 오븐으로 습 한 챔버를 이동 ° C O/명.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2D DNA-생선 주 3
	<ol>
		<li>72 ° C에 물 목욕을 설정 하 고 장소 0.4 × SSC 버퍼 슬라이드 얼룩 항아리에 (표 1). 30 분 후 확인 해야 합니다 72 ± 0.4 × SSC 버퍼의 온도 1 ° c.</li>
		<li>두 유리 비 커를 준비: 2 × SSC + 0.05% 트윈 버퍼 하나 (pH = 7.0 ± 0.1) (표 1) 및 증류수와 함께 두 번째 한.</li>
		<li>오븐에서 제거 하는 습 한 챔버, 신중 하 게 슬라이드에서 고무 시멘트를 제거 하 고는 coverslip 핀셋으로 분리.</li>
		<li>72 ° c.에 2 분 동안 0.4 × SSC에에서 담거 서는 coverslip 세척</li>
		<li>2 × SSC + 30 0.05% 트윈 버퍼에 담거 서는 coverslip 씻어 s.</li>
		<li>증류수에 coverslip 린스.</li>
		<li>어둠 속에서 10 분 동안 화학 증기 두건에서 coverslips를 건조.</li>
		<li>4´, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) counterstain 총 DNA의 1.5 µ g/mL와 함께 액체 장착 매체에 coverslip을 탑재 합니다. Coverslip 셀 쪽 아래로 슬라이드 장착 매체의 5 µ L의 하락에, 공기 그리고 매니큐어와 인감에 coverslip에 핀셋을 누릅니다. 참고: 중간 볼륨을 마운트 coverslip 표면의 크기에 근거 하 여 조정 한다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2D 현미경 관찰 및 분석 참고: 이미지 다른 현미경 시스템으로 취득 될 수 있다.</li></ol>우리는 기존의 형광 현미경 이미지 수집 (자료 테이블)에 대 한 표준 상용 소프트웨어와 부여를 사용 합니다.<ol>
		<li>레드에 대 한 적절 한 필터와 12 비트 디지털 카메라와 20 × / 0.50 총 40 × / 0.65 나 목표를 사용 하 여 이미지 (여기: 599 nm, 방출: 588 nm), 녹색 (여기: 509, 방출: 524), 파랑 (여기: 367 nm, 방출: 452 nm) 조사.</li>
		<li>선택의 소프트웨어 도구를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. 참고: 면역 형광 염색 및가 프로브 지역화를 평가 하려면 우리 ImageJ 사용. 슬라이드 3 주 최대 어둠 속에서-20 ° C에 저장할 수 있습니다. 장기간된 보관에 대 한 특정 설치 매체를 사용 하 여 장기 저장을 위한 좋습니다 것 이다.</li>
	</ol>
	

2. 면역-DNA 물고기 와이어에
<ol>
	<li>셀 라인 스파이크에서 와이어 (3D 지원) 참고: 사전 설정 포함 한 정확한 부착의 선택 라인 EpCAM 양성 기반 세포. 와이어는 기능성 안티 EpCAM 항 체와 함께 있도록 EpCAM 긍정적인 셀만 묻은 게 있다. 참고: 어떤 손상을 방지 하기 위해 철사의 기능성된 부분을 만지지 마십시오. 참고: 모든 단계 실행 되어야 한다 밖으로 메 마른 조건에서 층 류 후드.<ol>
		<li>완전 한 매체;의 4 mL를 사용 하 여 5 mL 유리병에서 T75 플라스 크 (80% 합류)의 전체 내용을 resuspend합니다 단일 스파이크에 대해, 약 2000000 세포 세포 접착에는 와이어를 극대화 하기 위해 권장 됩니다.</li>
		<li>유리 포장에서 와이어를 제거 합니다.</li>
		<li>유리병에 와이어의 기능성된 골드 부분을 찍어, 유리병에 맞는 와이어 스 토퍼는 방수 보장. 실험 영화와 함께 인감. 참고: 와이어 스 토퍼과 유리병의 정확한 일치 수 있도록 5 mL 튜브의 사용을 권장 합니다.</li>
		<li>튜브 회전에서 RT에서 30 분 동안 품 어 (0-120 각도).</li>
		<li>린스는 와이어 3 다른 깨끗 한 튜브를 사용 하 여 1 × PBS 솔루션에 세 번.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>고정 및 permeabilization 주의: 아세톤은 호흡기 염증을 일으킬 수 있는 가연성 물질 이다. 아세톤-내성 플라스틱 또는 유리 용기 (PVC 또는 PVDF) 사용 합니다. 참고: 화학 증기 두건에서 이러한 단계를 수행 합니다.<ol>
		<li>와이어 건조</li>
		<li>5 mL 튜브 아세톤 100% 솔루션 실시간 사용에 10 분에 와이어를 담거 서 셀을 수정. 참고: 와이어 스 토퍼는 정착 액의 접촉으로 오지 않을 해야 합니다.</li>
		<li>실시간에서 5 분 동안 와이어 건조 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. -20 ° c.에는 와이어를 저장 해야 합니다. 장기 저장을 위한 와이어 때, 기능성된 팁 옆 와이어 스 토퍼 놓고 신중 하 게 공업화 팁을 손상 하지 않도록 주의 복용 저장 유리 튜브에 와이어를 삽입 합니다. 스토리지 유리를 닫고-20 ° c.에 (수직 또는 수평으로)를 저장</li>
	</ol>
	</li>
	<li>면역 형광 검사 일 1 참고:이 단계에서는 O/N 인큐베이션 (~ 16 h).<ol>
		<li>5 mL 튜브를 사용 하 여 1 × PBS 솔루션에 두 번 세척.</li>
		<li>RT 5 mL 튜브를 사용 하 여 30 분에 대 한 항 체 희석 버퍼에 와이어를 품 어.</li>
		<li>희석 단일 클로 널 1 차적인 항 체와 항 체 희석 버퍼는 데이터 시트에 지정 된 대로 형광 색소 활용 된 항 체 혼합의 150 µ L를 준비 합니다. 예를 들어, EpCAM FITC 항 체 1시 20분와 함께 사용 된 희석.</li>
		<li>P200 팁을 사용 하 여 다음과 같이 부 화, 수행: 와이어 스 토퍼에서 와이어를 추출 하 고 부드럽게 팁의 큰 구멍을 통해 와이어를 삽입. Unfunctionalized 끝을 먼저 삽입 하 고 금 부분은 그냥 넘어 더 큰 구멍까지 작은 구멍을 통해 와이어를 천천히 당겨.</li>
		<li>부드럽게 항 체 혼합의 150 µ L를 드롭 (EpCAM_FITC 안티 예 항 체 희석 1시 20분) 끝에. 거품 형성의 위험을 방지 하려면 기능성된 부분 완전히 뛰어들 때까지 부드럽게 와이어를 돌리기.</li>
		<li>도장 끝의 구멍까지. 실험실 영화 구멍 주위에 배치 수 있습니다.</li>
		<li>품 어 수직으로 O/N (~ 16 h) 4 ° c.에 어둠 속에서</li>
	</ol>
	</li>
	<li>면역 형광 검사 주 2
	<ol>
		<li>와이어 1 × PBS에 두 번 세척 하 여 항 체 외피를 차단 합니다.</li>
		<li>재 그 와이어 스 토퍼에 와이어를 삽입 합니다. 참고: 1에서 X 5 mL에 4 ° C에서 PBS 유리병 물고기 분석 결과 수행 될 때까지.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 차원 DNA-물고기 하루 2 주의: 특별 한 주의 악기와 습 한 챔버의 높은 온도에 지불 되어야 합니다.<ol>
		<li>교 잡 오븐 및 건조 열 오븐을 설정 (~ DNA-물고기 프로토콜을 시작 하기 전에 3 h). 75 ° C에서 교 잡 오븐을 설정 37 ° C에서 열 건조 오븐을 설정 하 고 0.4 × SSC 솔루션을 냉각 (pH = 7.0 ± 0.1) 4 ° c 참고: 물고기 버퍼의 pH 상태 중요 이며 7.0 ± 0.1 되어야 합니다.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 0.4 × SSC 솔루션에서 와이어 3 번을 씻어. 참고: 다음 절차 동안 형광 색소 photobleaching을 피하기 위해 어둠 속에서 와이어를 계속.</li>
		<li>증기 찬 장 밑 어둠 속에서 10 분 동안 건조.</li>
		<li>소용돌이 스핀 5 조사 s.</li>
		<li>Theglass microtubes에 조사의 10 µ L를 드롭. 실험실 영화 커버.</li>
		<li>microtubes를 다음과 같이 회전: 50 mL 튜브에는 microtube 건조 흡수 성, 종이 넣어에 포장 하 고 짧게 스핀.</li>
		<li>조심 스럽게 말린된 와이어는 microtube에 놓고 와이어 스 토퍼를 삽입 합니다. 고무 시멘트와 함께 인감. 주의: 다음 두 단계는 높은 온도 포함 한다.</li></ol></li></ol>보호 장갑을 착용 하십시오.
		<li>완전 한 DNA 변성을 75 ° C에서 8 분 교 잡 오븐에 어두운 습 챔버에 와이어를 넣어.</li>
		<li>37 건 열 오븐으로 습 한 챔버를 이동 ° C O/명.</li>
	
	
	<li>3 차원 DNA-생선 주 3
	<ol>
		<li>0.4 × SSC 솔루션 항아리 물 목욕으로 얼룩 슬라이드를 넣고 72 ° c.에 설정</li>
		<li>때까지 72 ± 0.4 × SSC 솔루션 온도 확인 1 ° c.</li>
		<li>두 개의 유리 비 커, 2 × SSC + 0.05% 하나 준비 트윈 (pH = 7.0 ± 0.1) 솔루션 및 두 번째 한 증류수.</li>
		<li>습 한 챔버 건조 열 오븐에서 제거, 와이어 스 토퍼에서 고무 시멘트를 조심 스럽게 제거 핀셋를 사용 하 고 와이어를 꺼내. 참고: 신중 하 게에 스 토퍼, 기능성된 팁 손상 되지 않도록 주의 되 고를 통해 와이어 uncoated 끝을 당겨.</li>
		<li>72 ° c.에 2 분 동안 0.4 × SSC 솔루션으로 와이어를 찍어</li>
		<li>2 × SSC + 30 0.05% 트윈 솔루션에 와이어를 씻어 실시간에 s</li>
		<li>실시간에 증류수에 와이어를 세척</li>
		<li>어둠 속에서 10 분 연기 후드 와이어 건조.</li>
		<li>1 × PBS의 2 mL에 1.43 µ M의 DAPI 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>실시간에서 어둠 속에서 1 시간에 2 mL 유리병에 DAPI 솔루션 와이어의 기능성된 팁을 품 어</li>
		<li>1 × PBS에 두 번 와이어를 헹 구 고 건조.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 차원 현미경 관찰 및 분석
	<ol>
		<li>위치는 와이어 와이어 홀더입니다. 팁 커플링 포인트와 일치 될 때까지 신중 하 게 특별 한 홀더의 진입점을 통해 기능성된 팁을 삽입 합니다. 수 기능성된 팁 (그림 1a)을 손상 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
		<li>현미경 단계에 특별 한 홀더를 배치 합니다. 20 × 렌즈를 사용 하 여 현미경의 초점을 조정 합니다. 먼저 개의 특별 한 지원에 집중 하 고 밝은 DAPI 채널에 표시 되는 셀에 정밀 하 게 조정 합니다.</li>
		<li>만 넣어 초점으로 셀 렌즈에 중앙. 참고: 이미지 다른 현미경 시스템으로 취득 될 수 있다. 이 설정에서 우리는 기존의 형광 현미경 이미지 수집을 위한 표준 상용 소프트웨어와 부여를 사용 합니다.</li>
		<li>레드에 대 한 적절 한 필터와 12 비트 디지털 카메라와 20 × / 0.50 총 40 × / 0.65 나 목표를 사용 하 여 이미지 (여기: 599 nm, 방출: 588 nm), 녹색 (여기: 509, 방출: 524), 파랑 (여기: 367 nm, 방출: 452 nm) 조사. 참고: 이미지 수 구상 될 다른 도구와 소프트웨어를 사용 하 여. 우리는 면역 형광 염색 및가 프로브 지역화 ImageJ를 사용 합니다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. -20 ° c.에는 와이어를 저장 해야 합니다. 장기 저장을 위한 와이어 때, 기능성된 팁 옆 와이어 스 토퍼 놓고 신중 하 게 공업화 팁을 손상 하지 않도록 주의 복용 저장 유리 튜브에 와이어를 삽입 합니다. 스토리지 유리를 닫고-20 ° c.에 (수직 또는 수평으로)를 저장</li>
	</ol>
	</li>

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<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 논문에서는, 처음으로, 면역 형광 염색 및 DNA 물고기, 결합 하는 방법에 대 한 기능성된 와이어와 함께 사용 하기 위해 제시 되었다. 메서드를 사용 하면 면역 DNA 물고기를 불렀다. 이 기술은 EpCAM (이벤트 1), 수 양성 같은 phenotypical 매개 변수를 기준으로 하 여 3D 와이어에 상 상속 CTCs의 동시 식별을 허용 하 고 ALK 유전자 상태 (와 같은 분자 변경의 탐지를 촉진 하기 위하여 개발 되었다 이벤트 2)입니다. 두 이벤트의 동시 식별 그들의 공동 지역화의 검색 수 있습니다. 따라서,이 방법은 식별 하 고 암 환자의 혈액에서 검색 하는 CTCs 특성화를 맞출 수 있습니다. 착 색 하는 절차에 haemo-구성 요소 및 백혈구의 잠재적인 효과 절차와 일반적으로 방해 하지 않습니다. 특히, 문학에서 보고 된 데이터는 haemo 구성 요소와 백혈구 좌우 하지 않는다 와이어, 실제 CTCs1,15를 식별 하는 중요 한 단계에 연결 된 셀의 면역 형광 염색 법을 가리킨다.
면역-DNA 물고기의 형광 광도 전통적인 immunophototyping의 시험 그리고 물고기 분석에 필요한 고온의 결과 보다 약간 덜 표시. 그러나, 면역 형광 염색 법은 여전히 감지할입니다. 예를 들어 희미 한 신호는 여전히 낮은 EpCAM 표현 셀 라인, NCIH1975에서 감지. 물고기 분석에 필요한 높은 온도 항 체에 연결 된 오른쪽 형광 색소를 선택에 주요 제한 요소입니다. 이 프로토콜에서 항 체 DNA 변성 온도 용납 하기 위해 내 형광 색소에 연결 합니다. 예를 들어 phycoerythrin, 열에 민감한 형광 색소는 권장 하지 않습니다이 설정에서 높은 온도 의해 발생 하는 형광 색소 저하. Fluorescein isothiocyanate 좋은 선택 및 물고기 프로브에 종종 일반적인 형광 색소 이다. 면역-DNA 물고기 autofluorescence 신호는 표준 2D 지원에 매우 가난. 와이어 지원에 폴리머 레이어는 빨강 채널에 특히 약간의 autofluorescence 신호를 유도 수 있습니다. 2D 배경 달리 특정 배경 신호에 인지할 수 이지만 핵 식별 또는 셀 특성을 크게 영향을 주지 않습니다.
와이어의 현미경 평가 독서의 원통형 모양의 3 차원 구조 표면에 광학 현미경의 한계 때문에 2D 지원에 보다 훨씬 더 피곤한. 그러나,이 어려움은 와이어 홀더 회전 및 와이어의 중간 선 따라 지역화 주로 이미지를 획득 하 여 극복할 수 있습니다. 와이어 홀더는 와이어의 360 ° 회전을 허용합니다. 일단 핵에 초점을 맞춘, 형광 채널을 변경 유지 하지 않습니다 반드시 대상 지역에 초점. 이러한 이유로, 내부 셀 대상 영역에 초점을 유지 하기 위해 필수적 이다.
이 기술은 감지 하 여 3D 지원의 종류에는 셀 특성에 맞출 수 있습니다. 그것은 또한 다른 항 체를 사용할 수 있을 수 있습니다 그리고 물고기 프로브. 다른 항 체를 사용 하 여 선택할 때 형광 색소 내열성 및 세포 막에 대상 항 식 수준 고려해 야 할 중요 한 요소는. 내 cytoplasmatic 항 또한 스테인드 수 있습니다. 프로브 다른 물고기를 사용 하 여 때 그것은 물고기에 대 한 셀을 준비 하 고 변성 절차에 대 한 데이터 시트 사양 따라 분석 결과 확인 하는 것이 중요.

CTCs 암 셀 보급1의 중요 한 단계를 나타냅니다. 환자의 말 초 혈액에 그들의 존재 (전이성) 재발 및 질병 진행2,3와 연결 됩니다. CTC 격리 및 암 환자의 혈액에서 특성화 비-침략 적 액체 생의 유형입니다. 최근 몇 년 동안, 그것은 점점 더 분명 그 중요 한 임상 정보4,5제공 모니터링 진행 및 종양의 분석의이 종류를 사용 하 여 다른 치료에 응답 되었다. 액체 생 인지 더욱 유용한 수술 가능 하지 않습니다 기본 종양 조직 되지 않은 경우 사용할 수 있는, 즉, 비-biopsiable 병 변. 따라서,이 방법은 어디 CTCs의 존재는 부정적인 전조 역할6에 보였다 전이성 NSCLC 같은 특정 암 설정에 유망 하다. NSCLC 타겟된 치료 접근7,8,9 진행, 성장에 관련 된 것으로 알려진 특정 분자 (분자 표적)에 설계에서 특히 이익이 되는 종양 이다 하 고 질병의 확산입니다. 따라서, 질병의 진행 하는 동안 특정 대상의 검출이 필요 합니다. CTC 조사는 감지 하 고 기본 또는 전이성 조직에 대 한 필요 없이 약물 대상 모니터링 매우 재미 있는 진단 방법입니다. 예를 들어 NSCLC 셀에서 ALK 유전자 translocations의 검출 감도 crizotinib, 특정 타겟된 치료10에 연결 됩니다. 그러나, 현재가 translocations의 검색 미세 바늘 aspirates 또는 작은 biopsies;에 실행 됩니다. 그 결과, 종양 없이 조직이 분석 불가능합니다. CTCs는 종양에 대 한 잠재적인 대안 조직 기반 조사 하 고 매우 유망한 동행자 진단 접근을 대표 한다.
그들의 잠재적인 중요성에도 불구 하 고 CTCs 지금도 연구 중 좋은 토론의 주제 (1-10 셀/mL 주변 혈액11) 그들의 진귀 때문에 주로. 현재 액체 생 검 방법 혈액 (즉, 1-30 mL)12,13의 제한 금액을 사용 하지만이 CTCs 그러므로의 검출을 위한 차선 감도의 상황을 만들고, 연구 발견을 보증 접근 하며 말 초 혈액의 더 큰 볼륨에 CTC 대상 액체 biopsies을 수행 하기 위해 개발 장치
대체 장치, 기능성된 의료 와이어 ( 재료의 표참조), 혈액 샘플링 한계를 극복 하 고를 가져오는 CTCs의 더 대표적인 분석 개발 되었습니다. 이 기능성된 와이어를 암 환자1의 혈 류에서 직접 CTCs CE 승인 의료 기기입니다. 그것은 황금의 0.2 µ m 두께 레이어와 코팅 2 cm 긴 기능성 팁 16 cm 긴 스테인리스 와이어 (그림 1a) 구성 됩니다. 레이어 covalently EpCAM CTCs14의 표면에 가장 널리 표현된 항 중 하나에 대하여 지시 하는 항 체와 결합 하 여 1 ~ 5 µ m 두께 polycarboxylate 히드로 지층에 차례로 적용 됩니다. 철사의 기능성된 팁 환자의 팔의 정 맥에 고 적어도 30 분 동안 위치에 남아 있습니다. 이 방법은 주변 혈액, 그리고 화면 혈액 (약 300-fold 이상 대체 방법을 사용 하는 볼륨)1. 의 약 1.5-3.0 L 직접 CTCs vivo에서 의 격리를 허용
Pantel 외. 폐 암 환자15팔 혈관에 직접 CTCs을 분리에이 접근의 효능을 설명 했다. 그들은 얼룩 CTCs 백혈구 검색 EpCAM와 팬-cytokeratin, CD45에 대하여 지시 하는 기존의 항 체를 사용 하 여 식별 하는 와이어 면역 형광 검사 수행. 와이어 광 형광 현미경15시험 되었다. 저자 시연 장치 CTCs, 격리 수 있었습니다 하지만 그들은 translocations 등 치료 관련 어떤 표적을 조사 하지 않았다.
제시 방법은 putative CTCs phenotypical 매개 변수, 예를 들어, EpCAM 양성 및 분자 마커의 존재가 상태 (그림 1b) 예를 들어 기초 NSCLC 셀 라인에서 식별 하는 것을 목표로. 이 3-하루-긴 절차 결합 기능성된 와이어 및 면역 형광 DNA 형광-제자리에얼룩-교 잡 (DNA 물고기) 라는 면역-DNA-물고기. CTCs는 희소 한, 그에 주어진이 프로토콜의 장점은 CTCs immunophenotypic 기능 및 DNA 재배열 동일한 철사에 특성화 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>에탄올</td><td>Carlo Erba</td><td># 414605</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>BIO RAD</td><td># 1706531</td><td></td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충 식염수)&nbsp;</td><td>Medicago</td><td># 09-9400-100</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 534064-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td># A7906</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Detergent</td><td>BIO RAD</td><td># 1610407</td><td></td></tr><tr><td>RUBBERCEMENT</td><td>Royal Talens</td><td># 95306500</td><td></td></tr><tr><td>Vysis 20X SSC (66g)</td><td>Abbott Molecular Inc.&nbsp;</td><td># 30-804850</td><td>분말은 ><><권장 RPMI</td></tr><tr><td>1640</td><td>Gibco</td><td># 31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Gibco</td><td># 10270-098</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200mM)</td><td>Gibco</td><td># 25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td># 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>H20</td><td>MilliPore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XT ALK BA</td><td>MetaSystems 프로브</td><td># D-6001-100-OG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, FluoroPure 등급</td><td>Invitrogen</td><td># D21490</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td># S36973</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM-FITC (클론: HEA-125)</td><td>Mitenyi</td><td># 130-080-301</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubes M-Tube18</td><td>Gilupi Nanomedizin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detektor CANCER01 EpCAM</td><td>Gilupi Nanomedizin</td><td></td><td>기능성 와이어</td></tr><tr><td>STAR FROST 현미경 슬라이드</td><td>Knittel GL&Auml; SER</td><td>VS1117# 076FKB</td><td></td></tr><tr><td>SecureSlip 실리콘 지원 커버글라스</td><td>GRACE BIO-LABS</td><td># 104112</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS 형광 현미경 Axioskop&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64비트 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>BR 4.11.00</td><td></td></tr><tr><td>Nikon DS-QiMc 12비트 디지털 카메라</td><td>Nikon</td><td>DS-QiMc</td><td></td></tr></tbody></table>

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 dna 물고기 기반으로 3 차원 접근

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

순환 종양 세포 (CTCs) 전이성 암에 가난한 생존에 연관 됩니다. 그들의 식별, 형질, 및 유전형 종양이 더 나은 이해로 이어질 수 있고 따라서 맞춤된 치료에 대 한 환자의 선택을 촉진. 그러나, 이것은 CTCs의 희귀 한 때문에 방해 된다. 우리는 환자 혈액의 높은 볼륨 샘플링 및 CTCs의 전 존재, 표현 형, 그리고 유전자 좌에 대 한 정보를 얻기 위한 혁신적인 접근 방식을 제시. 방법은 결합 면역 형광 염색 및 DNA 형광-제자리-교 잡 (물고기 DNA) 기능성된 의료 와이어 기반. 이 와이어 주변 혈액의 큰 볼륨에서 CTCs vivo에서 절연을 허용 하는 혁신적인 장치입니다. 혈액 볼륨 와이어의 30 분 관리에 의해 상영은 대략 1.5-3 나 이 방법의 타당성을 입증, 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 표현과 ALK 유전자의 염색체 전 좌 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 셀 라인 기능성된 와이어에 의해 점령에 결정 했다 고 면역-DNA 물고기 방식으로 얼룩진. 우리의 주요 과제 3 차원 구조, 기능성된 와이어에 분석 결과 수행 하 고 면역 표현 형을 결정 하 고이 물고기 신호를 기존의 형광 현미경을 사용 하 여 지원. 결과 표시는 CTCs을 잡는 그들의 표현 형 및 염색체 재배열 분석 수 잠재적으로 새로운 동행자 진단 접근 및 제공 하는 혁신적인 향상을 위한 전략 맞춤 암 치료.

위에 설명 된 절차를 사용 하 여 기능성된 와이어에 의해 농축 CTCs (또는 다른 동등한 세포)에 면역 DNA 물고기 분석 결과 수행 가능 하다. 이 프로토콜을 설정 하기 전에 두 가지 방법의 호환성 결정된 (면역-형광 물고기) 표준 2D 지원에 했다. 두 개의 다른 NSCLC 셀 라인 표현 EpCAM (EpCAM에 대 한 항 체와 결합 하는 와이어를 준수 하는 데 필요한) 선정 되었다. 그들은 다른가 상태를 다른 시작 조건을 테스트 하는 데 유용 했습니다. 두 번째, NCI-H3122가 translocations에 의해 특징입니다 하는 동안 첫 번째, NCI-H1975, 야생 타입 (WT)가 유전자, 있다.
물고기 분석 결과 대 한 ALK 유전자 휴식-떨어져 탐지 시스템 사용 되었다. 하나 (오렌지) 2 p 23와 하나 (녹색)가 원심 교배 시키기에 내에 있는 인접 영역을 교배 시키기 두 프로브 시스템에 의하여 이루어져 있다. 2D 지원에 면역-DNA 물고기 항 체와 프로브 (그림 2)에 대 한 명확한 신호를 제공합니다. 특히, 둘 다 세포 라인 잘 정의 된 EpCAM 막 지역화를 보여주었다. 또한, 프로브 신호 밝고 날카로운 등장: NCI H1975 셀 겹치는 오렌지와 녹색 프로브, ALK 유전자 (그림 2a, b)의 wildtype 상태를 확인 했다. 반대로, NCI H3122 셀 겹치는 신호와 단일 녹색 점, ALK 유전자 (그림 2 c, d)의 삭제를 반영 했다. 면역-DNA 물고기 분석 결과 수행한 기능성된 와이어를 지 원하는 3D에, 항 체 및 프로브 신호 했다 일반적으로 보다 적게 정의 보다 2D 지원에. EpCAM 얼룩이 표시 했다. ALK 프로브 신호 덜 정의 하지만 여전히 예상된가 상태 (그림 3)를 반영 했다. 결과 면역 형광 염색 DNA 물고기 신호와 방해 하지 않았다 보여주었다. 그들의 목표와 특히 프로브 때 교배. NCI H3122 셀 라인 야생 타입 ALK 유전자 (그림 3a)와 NCI-H1975, 달리 탈 ALK 유전자 상태 (그림 3b)를 보여주었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig1.jpg"> 
그림 1 : 와이어, ALK 휴식-떨어져 프로브 구조 배열, ALK 재배치, 및 특별 한 홀더 예상된 패턴의 구조 기능성. (한) 빨간 상자는 와이어의 세 가지 주요 부분 강조: 팁, 와이어 스 토퍼, 그리고 유엔 기능성된 팁 기능성. 기능성된 팁 와이어의 가장 민감한 부분 이다 고 셀 분리 또는 손상을 방지 하려면 처리 하는 동안 감동 하지 않을 해야 합니다. (b) 녹색 및 빨간색 프로브는 각 각각 시퀀스에 바인딩할 업스트림과 다운스트림 (왼쪽)에 ALK 유전자의 loci의. 오른쪽에가 준비의 exemplificative 패턴 표시 됩니다. 빨간색과 녹색 공동 지역화 신호에 정상적인 세포; 분리 된 녹색 및 빨간색 신호는 ALK 유전자 염색체 휴식 (ALK 유전자의 전 좌) 한 녹색 오렌지 colocalization 신호 (탈 선 세포-1)을 나타냅니다. 1 빨간 신호 및 2 개의 녹색 신호 한 빨간 신호, 제안 하는 염색체 전 좌 및 삭제 (탈 셀-2)의 손실을 나타냅니다. (c) 와이어 홀더; 빨간 상자 강조 영역 어디 케어는 현미경 분석 중 통신을 처리할 때 필요 하다. 철사는 선회는 선회 하 여 360 ° 분석을 받을 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig2.jpg"> 
그림 2 : 2D 지원 (coverslip) 분석 결과 면역 DNA 물고기. (a, b) NCI H1975 EpCAM에 대 한 약하게 긍정적인 세포. EpCAM FITC 신호를 감지할 수 있었다. ALK 휴식-떨어져의 오렌지와 녹색 프로브 겹쳐, NCIH1975 셀 라인에서 ALK 유전자의 WT 상태 확인. 두 개 이상의 쌍을 이루는 신호를 표시 하는 셀의 이수성 인해 참석 했다. (c, d) 높은 EpCAM 표현 NCIH3122 셀 라인에서 면역 형광 신호 했다 밝은,이 셀 접속점에 지기도 했다. 물고기 분석 확인된 삭제 관련이 셀 라인의 전형적인 ALK 유전자의 빨간색 화살표는 단일 녹색 프로브 (없이 해당 오렌지 프로브), ALK 유전자 삭제 반영을 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig3.jpg"> 
그림 3: 면역 DNA 물고기 3D 지원으로 기능성된 와이어를 사용 하 여 시험. (한) 대표 이미지에 NCI H1975 셀의. 에 셀의 3 차원 모양을 완벽 하 게 초점 이미지 어려운 있지만, EpCAM 신호 모든 세포에서 잘 표시 됩니다. 전선에 NCI H3122 셀의 (b) 대표 이미지. ALK 프로브 유전자 삭제 (빨간색 화살표), 이전 2D 지원에 본을 보였다. 보이는 배경 신호 폴리머 층의 존재로 인해 가장 가능성이 있었다. 그러나, 그것은 크게 미치지 않았다 셀 식별 또는 형광 분석. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>버퍼</td>
			<td>구성</td>
			<td>참고</td>
			<td>주식</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>셀 완전 한 문화 매체</td>
			<td>RPMI 1640 + 2mm 글루타민 + 5-10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS).</td>
			<td></td>
			<td>RPMI: 4 ° C; 글루타민, FBS:-20 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>항 체 Diluition 버퍼</td>
			<td>1 %BSA, 1 x PBS에 0.3% 트라이 톤 X-100</td>
			<td></td>
			<td>실험 영화와 실시간 인감입니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC 솔루션 x 20</td>
			<td>3 M 300 m m trisodium 시트르산 ddH20에에서 녹아 있는 염화 나트륨</td>
			<td>솔루션 및 pH = 7.0 HCl 0.1 +</td>
			<td>실험 영화와 실시간 인감입니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC 솔루션 x 0.4</td>
			<td>주식 20 희석 x SSC에 증류수 H2O</td>
			<td>솔루션 및 pH = 7.0 HCl 0.1 +</td>
			<td>실시간</td></tr></tbody></table>실험 영화와 함께 인감.
		
		<tr>
			<td>SSC + 0.05% 트윈 20 솔루션 x 2</td>
			<td>주식 20 x SSC 증류수 H2O + 0.05%를 희석 트윈 20</td>
			<td>솔루션 및 pH = 7.0 HCl 0.1 +</td>
			<td>실험 영화와 실시간 인감입니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 솔루션 30 nM</td>
			<td>1 x PBS µ M 증권 1.43 희석</td>
			<td></td>
			<td>Aliquote를 사용 하 여 준비가 어두운 상태에서-20 ° C</td>
		</tr>
	

표 1: 솔루션 조리법입니다.

우리는 종양 세포의 특성에 대 한 새로운 접근을 제시. 우리 DNA 형광-제자리에서면역 형광 결합-셀 기능성된 의료 와이어에 vivo에 직접 환자의 혈액에서에서 CTCs를 풍부 하 게의 수에 의해 점령을 평가 하는 교 잡.

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 3D 기능화된 와이어에서 면역형광 염색과 DNA 형광 현장 혼성화를 결합하고 기존의 광시야 형광 현미경을 사용하여 지지대에서 면역 표현형 및 FISH 신호를 식별하는 것입니다. 이 방법은 순환하는 비소세포 폐암 세포에 대한 치료 관련 표적 식별과 같은 종양 세포 특성화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 EpCAM 양성과 같은 표현형 매개변수와 ARC 유전자 상태와 같은 세포체 변형을 동시에 식별하여 추정 CTC를 검출할 수 있다는 것입니다.이 방법은 제자리 인슐린 암 CTC 기능을 제공하기 위해 독특하게 고안되었지만 유방암과 같은 다른 암 연구에도 적용할 수 있습니다. 당사는 직접 면역표현형분석 및 CTC 검출을 위해 와이어를 처리하면서 이 프로토콜을 개발했습니다. 더 많은 데이터를 얻기 위해 면역표현형 분석 프로토콜을 DNA 형광 in situ hybridization 프로토콜과 연관시켰습니다.와이어를 다루는 것은 주로 기능화 된 팁이 깨지기 쉽기 때문에 쉽지 않습니다. 시각적 시연을 통해 독자는 단계를 재현할 수 있습니다. 실험을 시작하려면 4ml의 완전한 배지를 사용하여 5ml 바이알에 80% confluence에 있는 T75 플라스크의 전체 내용물을 재현탁합니다.그런 다음 유리 포장에서 와이어를 제거합니다. 와이어의 기능화된 금 부분을 바이알에 담그고 와이어 스토퍼가 5ml 바이알에 방수가 되도록 합니다. 실험실 필름으로 와이어를 밀봉하십시오.그런 다음 실온에서 30분 동안 튜브 로테이터에 와이어를 배양합니다. 회전 후 세 개의 다른 깨끗한 바이알을 사용하여 1중 PBS 용액에서 와이어를 세 번 헹구고 와이어가 마를 때까지 기다립니다. 후드에서 와이어를 10분 동안 공기 건조시킨 후 실온에서 10분 동안 5밀리리터 튜브에 100% 아세톤 용액에 와이어를 담궈 셀을 고정합니다.기능화된 팁에 아세톤의 흔적이 없는지 확인하십시오. 실온에서 5분 동안 와이어를 자연 건조합니다. 다음으로, 5 밀리리터 튜브에서 와이어를 1 폴드 PBS로 두 번 세척합니다.항체 희석 완충액에서 와이어를 배양합니다. 데이터시트에 명시된 형광 색소 및 항체 희석 완충액과 접합된 단클론 1차 항체의 희석액과 함께 150마이크로리터의 항체 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 P200 팁을 사용하여 와이어 스토퍼에서 와이어를 추출하고 팁의 더 큰 구멍을 통해 와이어를 부드럽게 삽입합니다.작동하지 않는 끝을 먼저 삽입하고 금색 부분이 더 큰 구멍 바로 너머에 올 때까지 더 작은 구멍을 통해 와이어를 천천히 당깁니다. 150마이크로리터의 항체 혼합물을 팁에 부드럽게 첨가합니다. 기포 형성의 위험을 방지하려면 기능화된 끝이 완전히 떨어질 때까지 와이어를 부드럽게 돌리십시오.팁의 구멍을 밀봉하고 구멍 주위에 실험실 필름을 감습니다. 섭씨 4도의 어둠 속에서 밤새 와이어를 수직으로 배양합니다. 둘째 날에는 1단 PBS로 와이어를 두 번 세척하여 항체 배양을 차단합니다.전선 스토퍼에 전선을 다시 삽입합니다. DNA-FISH 프로토콜 3시간 전에 혼성화 오븐을 섭씨 75도로 설정하고 건열 오븐을 섭씨 37도로 설정합니다. 0.4배 SSC 용액을 섭씨 4도로 냉각합니다.얼음처럼 차가운 0.4배 SSC 용액으로 와이어를 세 번 세척합니다. 흄 후드 찬장 아래의 어두운 곳에서 10분 동안 와이어를 말리십시오. 10분 후 5초 동안 프로브를 소용돌이치고 회전시킵니다.프로브 10마이크로리터를 유리 마이크로튜브에 떨어뜨린 다음 실험실 필름으로 덮습니다. 마이크로튜브를 흡수성 마른 종이로 감쌉니다. 50ml 튜브에 넣고 짧게 돌립니다.건조된 와이어를 마이크로튜브에 조심스럽게 넣고 와이어 스토퍼를 삽입합니다. 그런 다음 고무 시멘트로 와이어 스토퍼를 밀봉합니다. 완전한 DNA 변성을 얻기 위해 섭씨 75도에서 8분 동안 혼성화 오븐의 어둡고 습한 챔버에 와이어를 놓습니다.8분 후, 습한 챔버를 섭씨 37도의 건조 가열 오븐으로 밤새 옮깁니다. 0.4배 SSC 용액이 든 슬라이드 염색 용기를 섭씨 72도로 설정된 수조에 넣습니다. 섭씨 72도 또는 영하 1도에 도달할 때까지 0.4배 SSC 용액 온도를 확인합니다.다음으로 두 개의 유리 비커를 준비합니다. 하나는 2중 SSC와 0.05% 트윈 용액이고 다른 하나는 증류수가 있는 것입니다. 건열 오븐의 습한 챔버를 제거하십시오.핀셋을 사용하여 와이어 스토퍼에서 고무 시멘트를 조심스럽게 제거하고 기능화된 팁이 손상되지 않도록 주의하면서 코팅되지 않은 와이어 끝을 엔드 스토퍼를 통해 당깁니다. 와이어를 섭씨 72도에서 2분 동안 0.4중 SSC 용액에 담그십시오. 실온에서 30초 동안 2중 SSC와 0.05% 트윈 용액으로 와이어를 세척합니다.그런 다음 실온의 증류수로 와이어를 세척하십시오. 어둠 속에서 10분 동안 흄 후드 아래의 와이어를 말리십시오. 2ml 바이알에서 이전에 준비된 DAPI 용액으로 기능화된 와이어 팁을 배양합니다.1단 PBS로 와이어를 두 번 헹구고 와이어를 자연 건조합니다. 와이어 홀더에 와이어를 배치하고 팁이 커플링 포인트와 일치할 때까지 특수 홀더의 진입점을 통해 기능화된 팁을 조심스럽게 삽입합니다. 현미경 스테이지에 특수 홀더를 놓습니다.20배 렌즈를 사용하여 현미경의 초점을 조정합니다. 먼저 특수 지지대에 거칠게 초점을 맞춘 다음 DAPI 채널에서 밝게 보이는 셀을 미세하게 조정합니다. 렌즈 중앙의 세포에만 초점을 맞추고 적색, 녹색 및 청색 프로브에 적합한 필터가 있는 20x 및 40x 대물렌즈에서 12비트 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 획득합니다.마지막으로, 기능화된 팁 옆에 와이어를 포장하여 장기간 보관을 위해 와이어를 준비하고 와이어를 유리관에 조심스럽게 삽입합니다. 와이어를 섭씨 영하 20도에서 수직 또는 수평으로 보관하십시오. 면역형광 염색은 DNA-FISH 신호를 방해하지 않았습니다.3D 지지 기능성 와이어에서 immuno-DNA-FISH 분석을 수행했을 때 EpCam 염색이 명확하게 보였습니다. ALK 프로브는 유전자 결실을 밝혔습니다. NCI-H3122 세포주는 야생형 ALKG를 가진 NCI-H1975와 대조적으로 비정상적인 LAK 유전자 상태를 보였습니다.이 프로토콜은 일단 숙달되면 3일 동안 총 9시간의 작업 시간으로 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 손상을 방지하기 위해 전선의 기능화된 부분을 만지지 않는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라 다양한 항체 및 FISH 프로브를 사용하여 다른 표현형 마커 및 NAT 또는 HAR2 유전자 증폭과 같은 기타 세포유전학적 변형으로 세포를 식별하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 EpCAM 양성과 같은 표현형 매개변수를 통해 추정되는 CTC를 동시에 식별하고 ARC 유전자 상태와 같은 세포유전학적 변화를 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 아세톤과 오븐으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 후드의 아세톤을 다루고 보호 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 동영상은 비소세포폐암 환자 샘플에서 순환 종양 세포의 바이오마커를 특성화하는 기술인 순환 종양 세포(CTC) 면역형광 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 종양의 동적 변화와 면역 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있으며, 이는 화학 요법, 방사선 요법 및 가능한 면역 요법 치료에 대한 반응을 반영할 수 있습니다.

CTC Immunofluorescence Assay : 순환 종양 세포를 특성화하는 기술

이 비디오는 기능화된 의료 와이어에서 캡처한 순환 종양 세포의 면역형광 염색 기술에 대해 설명합니다. 기능화된 와이어를 통해 환자의 혈류에서 직접 생체 내에서 CTC를 분리할 수 있습니다.

면역형광 분석법: 의료용 와이어에 포획된 종양 세포를 식별하는 방법

암 환자의 혈액에서 순환 종양 세포(CTC) 분리 및 특성화는 비침습적 액체 생검의 한 유형이며 재발 및 질병 진행과 관련이 있습니다. 이 비디오는 특정 관심 유전자를 연구하기 위해 의료용 와이어에 캡처된 CTC의 DNA FISH(Fluorescence-in-situ-hybridization) 기술을 설명합니다.

3D DNA 물고기: 염색체에서 특정 유전자를 찾는 기술

이 비디오에서는 말초 혈액 샘플에서 EpCAM 발현 상피암 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 기술에는 표적 세포를 포착하기 위해 EpCAM 항체로 기능화된 의료용 와이어를 사용하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 포획된 세포는 이후에 버퍼 용액으로 추출됩니다.

기능성 와이어 기반 표적 세포 분리: 스파이크된 말초 혈액에서 암세포를 분리하는 생체 외 기술

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

여기서, 우리는 순환 종양 세포 (CTCs)를 특성화 하는 표현 형 및 분자 특징을 식별 하는 통합 워크플로우를 제시 합니다. 당사는 단일 및 클러스터형 CTCs의 살아있는 면역 염색 및 로봇 미세 조작을 단일 세포 기반 기술로 결합 하 여 전이 시드 능력의 다운스트림 분석과 평가를 제공 합니다.

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

순환 종양 세포의 특성 (CTC)는 번역 연구에서 인기있는 주제입니다. 이 프로토콜은 비소세포 폐암(NSCLC) 환자 샘플에서 CTC의 PD-L1 특성화 및 열거에 대한 반자동 면역형광(IF) 분석방법을 기술한다.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

임상 미세유체 칩은 임상 환자 혈액 샘플 전처리를 단순화하고 순환 종양 세포(CTC)를 칩에 면역 형광으로 염색하여 단일 CTC를 신속하게 검출하고 식별할 수 있는 중요한 생물 의학 분석 기술입니다.

다용도 순환 종양 세포의 분리를 위한 임상 미세유체 칩 플랫폼

이 논문에서는 복막 전이의 3차원 구조를 특성화하기 위해 최적화된 다중 면역형광 프로토콜에 대해 설명합니다.

Iterative Bleaching Extends Multiplexity 접근법을 사용한 종양 함유 조직의 3차원 이미징

순환 종양 세포(CTC)는 암 진행 및 전이 연구에 매우 중요합니다. 이 기사에서는 CTC 농축 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 고처리량 통합 프로토콜을 제시하여 포획 효율성과 CTC 순도를 개선하는 동시에 오염 및 시퀀싱 비용을 줄여 정밀 종양학 연구 및 임상 응용을 발전시킵니다.

미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

학습하세요 기능화된 의료 와이어를 이용한 순환 종양 세포 캡처 및 면역형광 DNA-FISH 기반 3차원 특성 분석 방법입니다. 이 기술은 비소세포폐암 세포의 면역표현형과 유전적 변화를 동시에 식별하여 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

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