순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

우리는 종양 세포의 특성에 대 한 새로운 접근을 제시. 우리 DNA 형광-제자리에서면역 형광 결합-셀 기능성된 의료 와이어에 vivo에 직접 환자의 혈액에서에서 CTCs를 풍부 하 게의 수에 의해 점령을 평가 하는 교 잡.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 3D 기능화된 와이어에서 면역형광 염색과 DNA 형광 현장 혼성화를 결합하고 기존의 광시야 형광 현미경을 사용하여 지지대에서 면역 표현형 및 FISH 신호를 식별하는 것입니다. 이 방법은 순환하는 비소세포 폐암 세포에 대한 치료 관련 표적 식별과 같은 종양 세포 특성화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 EpCAM 양성과 같은 표현형 매개변수와 ARC 유전자 상태와 같은 세포체 변형을 동시에 식별하여 추정 CTC를 검출할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 제자리 인슐린 암 CTC 기능을 제공하기 위해 독특하게 고안되었지만 유방암과 같은 다른 암 연구에도 적용할 수 있습니다. 당사는 직접 면역표현형분석 및 CTC 검출을 위해 와이어를 처리하면서 이 프로토콜을 개발했습니다. 더 많은 데이터를 얻기 위해 면역표현형 분석 프로토콜을 DNA 형광 in situ hybridization 프로토콜과 연관시켰습니다.

와이어를 다루는 것은 주로 기능화 된 팁이 깨지기 쉽기 때문에 쉽지 않습니다. 시각적 시연을 통해 독자는 단계를 재현할 수 있습니다. 실험을 시작하려면 4ml의 완전한 배지를 사용하여 5ml 바이알에 80% confluence에 있는 T75 플라스크의 전체 내용물을 재현탁합니다.

그런 다음 유리 포장에서 와이어를 제거합니다. 와이어의 기능화된 금 부분을 바이알에 담그고 와이어 스토퍼가 5ml 바이알에 방수가 되도록 합니다. 실험실 필름으로 와이어를 밀봉하십시오.

그런 다음 실온에서 30분 동안 튜브 로테이터에 와이어를 배양합니다. 회전 후 세 개의 다른 깨끗한 바이알을 사용하여 1중 PBS 용액에서 와이어를 세 번 헹구고 와이어가 마를 때까지 기다립니다. 후드에서 와이어를 10분 동안 공기 건조시킨 후 실온에서 10분 동안 5밀리리터 튜브에 100% 아세톤 용액에 와이어를 담궈 셀을 고정합니다.

기능화된 팁에 아세톤의 흔적이 없는지 확인하십시오. 실온에서 5분 동안 와이어를 자연 건조합니다. 다음으로, 5 밀리리터 튜브에서 와이어를 1 폴드 PBS로 두 번 세척합니다.

항체 희석 완충액에서 와이어를 배양합니다. 데이터시트에 명시된 형광 색소 및 항체 희석 완충액과 접합된 단클론 1차 항체의 희석액과 함께 150마이크로리터의 항체 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 P200 팁을 사용하여 와이어 스토퍼에서 와이어를 추출하고 팁의 더 큰 구멍을 통해 와이어를 부드럽게 삽입합니다.

작동하지 않는 끝을 먼저 삽입하고 금색 부분이 더 큰 구멍 바로 너머에 올 때까지 더 작은 구멍을 통해 와이어를 천천히 당깁니다. 150마이크로리터의 항체 혼합물을 팁에 부드럽게 첨가합니다. 기포 형성의 위험을 방지하려면 기능화된 끝이 완전히 떨어질 때까지 와이어를 부드럽게 돌리십시오.

팁의 구멍을 밀봉하고 구멍 주위에 실험실 필름을 감습니다. 섭씨 4도의 어둠 속에서 밤새 와이어를 수직으로 배양합니다. 둘째 날에는 1단 PBS로 와이어를 두 번 세척하여 항체 배양을 차단합니다.

전선 스토퍼에 전선을 다시 삽입합니다. DNA-FISH 프로토콜 3시간 전에 혼성화 오븐을 섭씨 75도로 설정하고 건열 오븐을 섭씨 37도로 설정합니다. 0.4배 SSC 용액을 섭씨 4도로 냉각합니다.

얼음처럼 차가운 0.4배 SSC 용액으로 와이어를 세 번 세척합니다. 흄 후드 찬장 아래의 어두운 곳에서 10분 동안 와이어를 말리십시오. 10분 후 5초 동안 프로브를 소용돌이치고 회전시킵니다.

프로브 10마이크로리터를 유리 마이크로튜브에 떨어뜨린 다음 실험실 필름으로 덮습니다. 마이크로튜브를 흡수성 마른 종이로 감쌉니다. 50ml 튜브에 넣고 짧게 돌립니다.

건조된 와이어를 마이크로튜브에 조심스럽게 넣고 와이어 스토퍼를 삽입합니다. 그런 다음 고무 시멘트로 와이어 스토퍼를 밀봉합니다. 완전한 DNA 변성을 얻기 위해 섭씨 75도에서 8분 동안 혼성화 오븐의 어둡고 습한 챔버에 와이어를 놓습니다.

8분 후, 습한 챔버를 섭씨 37도의 건조 가열 오븐으로 밤새 옮깁니다. 0.4배 SSC 용액이 든 슬라이드 염색 용기를 섭씨 72도로 설정된 수조에 넣습니다. 섭씨 72도 또는 영하 1도에 도달할 때까지 0.4배 SSC 용액 온도를 확인합니다.

다음으로 두 개의 유리 비커를 준비합니다. 하나는 2중 SSC와 0.05% 트윈 용액이고 다른 하나는 증류수가 있는 것입니다. 건열 오븐의 습한 챔버를 제거하십시오.

핀셋을 사용하여 와이어 스토퍼에서 고무 시멘트를 조심스럽게 제거하고 기능화된 팁이 손상되지 않도록 주의하면서 코팅되지 않은 와이어 끝을 엔드 스토퍼를 통해 당깁니다. 와이어를 섭씨 72도에서 2분 동안 0.4중 SSC 용액에 담그십시오. 실온에서 30초 동안 2중 SSC와 0.05% 트윈 용액으로 와이어를 세척합니다.

그런 다음 실온의 증류수로 와이어를 세척하십시오. 어둠 속에서 10분 동안 흄 후드 아래의 와이어를 말리십시오. 2ml 바이알에서 이전에 준비된 DAPI 용액으로 기능화된 와이어 팁을 배양합니다.

1단 PBS로 와이어를 두 번 헹구고 와이어를 자연 건조합니다. 와이어 홀더에 와이어를 배치하고 팁이 커플링 포인트와 일치할 때까지 특수 홀더의 진입점을 통해 기능화된 팁을 조심스럽게 삽입합니다. 현미경 스테이지에 특수 홀더를 놓습니다.

20배 렌즈를 사용하여 현미경의 초점을 조정합니다. 먼저 특수 지지대에 거칠게 초점을 맞춘 다음 DAPI 채널에서 밝게 보이는 셀을 미세하게 조정합니다. 렌즈 중앙의 세포에만 초점을 맞추고 적색, 녹색 및 청색 프로브에 적합한 필터가 있는 20x 및 40x 대물렌즈에서 12비트 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 획득합니다.

마지막으로, 기능화된 팁 옆에 와이어를 포장하여 장기간 보관을 위해 와이어를 준비하고 와이어를 유리관에 조심스럽게 삽입합니다. 와이어를 섭씨 영하 20도에서 수직 또는 수평으로 보관하십시오. 면역형광 염색은 DNA-FISH 신호를 방해하지 않았습니다.

3D 지지 기능성 와이어에서 immuno-DNA-FISH 분석을 수행했을 때 EpCam 염색이 명확하게 보였습니다. ALK 프로브는 유전자 결실을 밝혔습니다. NCI-H3122 세포주는 야생형 ALKG를 가진 NCI-H1975와 대조적으로 비정상적인 LAK 유전자 상태를 보였습니다.

이 프로토콜은 일단 숙달되면 3일 동안 총 9시간의 작업 시간으로 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 손상을 방지하기 위해 전선의 기능화된 부분을 만지지 않는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라 다양한 항체 및 FISH 프로브를 사용하여 다른 표현형 마커 및 NAT 또는 HAR2 유전자 증폭과 같은 기타 세포유전학적 변형으로 세포를 식별하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 EpCAM 양성과 같은 표현형 매개변수를 통해 추정되는 CTC를 동시에 식별하고 ARC 유전자 상태와 같은 세포유전학적 변화를 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 아세톤과 오븐으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 후드의 아세톤을 다루고 보호 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.