분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

이 실험의 전반적인 목표는 in vitro에서 스페로이드 발아 분석을 사용하여 추정되는 혈관모세포종 신생혈관형성의 성능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 종양 혈관 신생과 같은 혈관 신생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 고전적인 종양 혈관 형성이 혈관 모세포종에 존재하고 혈관 모세포종에서 자라는 체외를 평가하는 포괄적 인 절차의 산물이라는 것입니다.

이 기술의 함의는 혈관모세포와 혈관형성의 치료로 확장되는데, 그 이유는 그 결과가 혈관모세포증 신생혈관형성의 복잡성을 강조하기 때문이며, 이는 이러한 일반적인 형태의 혈관신생이 보완적인 메커니즘일 뿐임을 시사하기 때문입니다. 따라서 이 방법은 혈관모세포증 신생혈관형성 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 유리제 종양에 있는 종양 vasculogenic 모방과 같은 몇몇 단단한 종양에 있는 종양, angiogenesis, 및 vasculogenesis 관련 신청에 적용될 수 있습니다.

이 방법의 실제 시연은 이러한 조작된 내피 세포 스페로이드 단계의 생성을 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 적절한 조건이 중요하기 때문입니다. 먼저, 10%의 소 태아 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배양 배지에서 HUVEC 내피 세포를 배양합니다.

그런 다음 인큐베이터에서 이산화탄소 5%가 포함된 섭씨 37도의 배양을 유지합니다. 다음으로, shRNA 단편을 합성하기 위해 ApaI 및 EcoRI 제한 효소로 플라스미드를 분해합니다. 그런 다음 분해된 플라스미드에 정방향 및 역방향 올리고, 10x NEB 완충액 및 이중 증류수를 최종 부피 50마이크로리터에 추가합니다.

모든 시약을 첨가한 후 혼합물을 섭씨 98도에서 4분 동안 가열합니다. 그런 다음 몇 시간 안에 실온으로 서서히 식히십시오. T4 리가아제를 사용하여 어닐링된 올리고와 플라스미드를 접합합니다.

튜브를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 25마이크로리터의 DH5alpha 수용 세포에 5마이크로리터의 결찰 혼합물을 추가합니다. 500 microlit의 DMEM 배지에 lentiviral vector 또는 scrambled vector를 다른 패키징 플라스미드와 함께 첨가합니다.

그런 다음 렌티바이러스 혼합물을 섭씨 37도에서 25분 동안 배양합니다. 배양 후 7ml의 DMEM 배지를 스크램블 또는 렌티바이러스 혼합 용액에 첨가합니다. 10cm 배양 접시에서 소 태아 혈청이 없는 DMEM 배지에서 293FT 세포를 배양합니다.

1ml의 렌티바이러스 또는 스크램블 용액을 배양 접시의 293FT 세포에 추가합니다. 6 시간 후, 배양 접시에서 오래된 배지를 흡인합니다. 그런 다음 기존 배지를 10%의 소 태아 혈청을 함유한 새로운 DMEM 배지로 교체합니다.

48시간 후 배지를 수집합니다. 렌티바이러스 배지에서 HUVEC 내피 세포를 이식하고 72시간 동안 유지합니다. 다음으로, HUVEC 세포 배양 배지에 밀리리터당 2마이크로그램의 퓨로마이신을 첨가합니다.

마지막으로, 다시 24시간 동안 배양을 배양합니다. 다음 날, 1ml의 트립신 EDTA를 첨가하여 HUVEC 세포를 트립신화합니다. 그런 다음 트립신화된 세포 현탁액을 10% 소 태아 혈청으로 DMEM 배지에 재현탁시킵니다.

셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산합니다. 계수 후 3D 둥근 바닥 96웰 플레이트에 세포를 파종합니다. 파종 후 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%를 함유한 세포를 72시간 동안 지속적으로 배양합니다.

36시간 후 배양 배지의 절반을 새 배지로 교체합니다. 먼저 겔 용액을 섭씨 4도에서 해동한 다음 환원된 혈청 배지로 1:5의 비율로 희석합니다. 마이크로피펫을 사용하여 DMEM 배지에서 스페로이드를 빨아들입니다.

다음으로, 스페로이드를 5ml의 환원 혈청 배지로 세척합니다. 현탁된 스페로이드와 희석된 젤을 조심스럽게 옮깁니다. 15웰 플레이트에 스페로이드와 희석된 겔의 혼합 액체 300마이크로리터를 삽입합니다.

접시를 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%로 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 400마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 단일 웰에 추가합니다. 증발을 방지하려면 우물 주변을 멸균수로 채우십시오.

그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 100%에서 한 시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 기존 배지를 흡인하고 1% 내피 세포 성장 보충제가 포함된 600마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 웰에 첨가하고 하루 동안 배양합니다. 도립광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.

여기에서 세포의 스페로이드 발아를 도립 광 현미경을 사용하여 캡처하여 VHL 유전자 침묵이 내피 세포의 혈관 형성 전위에 미치는 영향을 연구합니다. 스페로이드는 대조군 및 VHL 침묵 내피 세포 모두에서 렌티바이러스 처리 후 12시간 후에 싹을 틔우는 것으로 보입니다. 다음으로, VHL 유전자 침묵 스페로이드에 의해 생성된 새싹의 길이를 정량화하기 위해 통계 분석을 수행합니다.

평균 새싹 길이는 VHL 침묵 그룹에서 약 125마이크로미터인 반면 대조군에서는 약 65마이크로미터에 불과합니다. VHL 침묵 그룹의 평균 누적 새싹 길이는 약 1250마이크로미터인 반면 대조군은 680마이크로미터입니다. 이러한 결과는 VHL 침묵 그룹에서 새싹 길이가 2배 증가했음을 나타냅니다.

이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 48시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차와 방법에 따라 모세관 형성과 같은 분석을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다. 혈관 내피 세포의 혈관 형성 능력을 탐구하는 것과 같습니다.

이 개발 이후, 이 기술은 혈관 신생 분야의 연구자들이 종양 내부 혈관화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 폭발 분석에 사용되는 조작된 내피 세포에서 어떤 유전자가 기능을 잃는지 잘 이해할 수 있을 것입니다.