Name: 분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 학습하세요 spheroid sprouting assay를 사용하여 hemangioblastoma의 신생혈관형성을 평가하는 방법을. 이 기법은 종양 혈관신생 메커니즘을 연구하고 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 상하이 과학 위원회 및 기술 (15411951800, 15410723200)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자 교수 YuMei 원 및 그들의 기술 지원에 대 한 병원 성 미생물과 복 단 대학 교수 차오 Zhao 감사 하 고 싶습니다.

이 메서드는 연구 윤리 위원회의 Huashan 병원, 복 단 대학교의 승인 된 지침에 따라 수행 되었다. 해당 표준 안전 조치는 각 단계에 따라 했다. 도식 프레 젠 테이 션, 그림 1을 참조 하십시오.
1. 세포 배양 및 플라스 미드 구조
<ol><li>정기적으로 유지 하는 Dulbecco에서 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC)이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린, 100 단위/mL와 100 µ g/mL 스 습도 5%에서의 보완 수정의 CO2 배양 기 37 ° c.에</li>
	<li>PLKO.1 플라스 ApaI와 EcoRI shRNA 조각의 합성에 대 한 다이제스트. VHL shRNA 벡터의 oligonucleotide 시퀀스 CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14인지 확인 합니다.</li>
	<li>다음, 20 µΜ 시스템 올리고, 역방향 올리고의 5 µ L, 코 버퍼 x 10의 5 µ L ddH2O 함께 (총 볼륨은 50 µ L)의 35 µ L의 앞으로 5 µ L 믹스. 몇 시간에서 4 분, 그리고 천천히 실내 온도 아래로 냉각을 위한 98 ° C에 혼합물을 열.</li>
	<li>하룻밤을 위해 단련된 oligos 및 4 ° C에서 T4 리가 함께 PLKO.1 플라스 미드를 선. 16 h는 나중에, 25 µ L 유능한 DH5α 세포에 결 찰 믹스의 5 µ L를 추가 합니다. 그리고 성공적으로 합자 플라스 미드를 화면 연속 삽입 된 부분을 확인 합니다.</li>
</ol>2. lentivirus 패키지 및 감염
<ol><li>총, PLKO.1-shVHL 또는 PLKO.1 shScramble 벡터의 10 µ g, 7.5 µ g의 플라스 미드 psPAX2, 포장 및 봉투 플라스 미드 pMD2.G 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 25 분 없이 DMEM 미디어의 500 µ L에서의 2.5 µ g을 혼합.</li>
	<li>위의 준비 솔루션 FBS 없이 7 mLDMEM를 추가 합니다.</li>
	<li>10 cm 직경 조직 문화 요리에서 FBS 없이 DMEM 293 피트 셀 문화. 293 피트 셀 수 1 x 107 셀 카운터를 사용 하 여 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>Transfection 293 피트 셀의 매체에 위의 준비 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 293 피트 셀 라인 293F 셀 라인에서 파생 되 고 안정적으로 SV40 큰 T 항 원을 표현 한다. 따라서, 그것은 lentiviral 생산을 위한 적합 한 호스트입니다.</li>
	<li>10% 포함 된 DMEM 문화 매체를 바꿉니다 6 h 후 FBS.</li>
	<li>Transfection 후 48 h에는 피 펫을 사용 하 여 미디어를 수집 합니다. 참고: 10% 포함 된 DMEM에 존재 하는 바이러스 FBS. 죽은 세포는 매체에 부동. 사용 하 여 0.45 μ m 살 균 막 죽은 세포 및 불순물 필터링. 일반적으로, 감염 (MOI)의 다양성을 확인할 필요가 있다. 이것은 안정 된 세포 선 확립 하입니다. 마지막 단계에서 성공적인 감염 없이 모든 살아있는 세포 puromycin에 의해 죽을 것 이다. ShScramble 그룹 및 HUVEC 세포는 제어 그룹. 모든 HUVEC 셀 72 h 사용된 puromycin 농도로 죽을 확인 합니다. 모든 잘 동일한 셀 수가 있다.</li>
	<li>HUVEC 셀 72 h lentiviral 미디어에 문화. 그런 다음 컨트롤 그룹으로 치료 없이 24 h. 사용 HUVEC 셀 2 µ g/mL의 농도에서 HUVEC 셀의 미디어를 puromycin를 추가 합니다. 모든이 시간 셀 다 제어를 확인 합니다. 참고: 살아있는 세포 VHL 최저의 세포와 shSramble 세포의 안정적인 셀 라인을 나타냅니다. 도금 밀도가입니다 96 잘 접시에 5000/잘.</li>
</ol>3입니다. 세대 내 피 세포 Spheroids의
<ol><li>HUVECs 셀 trypsinize 및 10 %DMEM 매체에 resuspend FBS. 10 cm 문화 접시에 있는 세포의 적당 한 수, typsin-EDTA의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>셀 셀 밀도 1 × 103 셀/3D 라운드 아래 96 잘 접시에 씨앗 회전 타원 체를 일시 중단 하려면 0.50 µ L의 회전 타원 체를 수용할 수 있는 우물을 사용 합니다. 제조업체의 지침에 따라 셀 카운터 시스템을 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>37 ℃에서 72 h에 대 한 지속적으로 5% CO2 셀을 품 어. 이러한 조건에서 일시 중단 된 세포 형성 자동으로 셀 spheroids 확인 합니다. 36 h 후 문화 매체의 절반을 교체 합니다.</li>
</ol>4. 체 외에서 신생 분석 결과
<ol><li>4 ° C에서 젤 솔루션을 해 동 하 고 희석 비율 1: 5의에 감소 된 혈 청 매체와 그것을 희석.</li>
	<li>Spheroids는 micropipette와 DMEM 배양에서 빨 아. 세척 후 감소 된 혈 청 매체의 5 mL와 함께 spheroids 일시 중지는 spheroids 부드럽게 그리고 조심 스럽게 희석된 젤에서. 없음 기포 확인 합니다.</li>
	<li>15-잘 접시에 혼합된 액체의 300 µ L를 포함 합니다. 37 ° C, 5% CO2 1 h에서 부 화, 후 각 우물에 400 µ L 감소 된 혈 청 매체를 추가 합니다. 메 마른 물 증발을 방해 하는 습도 환경 생성 우물 주위를 작성 합니다.</li>
	<li>그 후, 5% CO2 1 h 100% 습도에서 37 ° C에서 격판덮개 문화.</li>
	<li>신중 하 게 오래 된 매체를 발음 하 고 감소 된 혈 청 매체에 각 잘 1% 내 피 세포 성장 보충제와의 600 µ L로 합니다.</li>
	<li>12 시간 또는 24 시간 후 거꾸로 가벼운 현미경 이미지를 받아 (40 *).</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>새싹 길이 데이터 (테이블의 재료)를 얻기 위해 온라인 이미지 분석 플랫폼에는 이미지를 업로드.</li>
	<li>웹 페이지에 전자 메일 계정을 만듭니다.</li>
	<li>다음 업로드 버튼을 클릭 하 여 이미지를 업로드 합니다.</li>
	<li>다운로드 버튼을 클릭 하 여 결과 다운로드 합니다. 참고: 소프트웨어 처리 이미지와 데이터를 생성 합니다. 5 부분을 포함 하는 데이터: 누적 새싹 길이, 평균 새싹 길이 길이 새싹, 새싹 영역 및 회전 타원 체 지역의 표준 편차. 처리 된 이미지에서 각 매개 변수 처리 이미지에서 식별을 쉽게 하기 위해 다른 색상으로 설명 하는: 빨간 나타냅니다 해골 콩나물, 콩나물의 수 노란, 파란 새싹 구조, 백색 새싹 끝, 및 오렌지 회전 타원 체.</li>
</ol>

<ol><li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673603136434">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li>
<li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma%3A+the+pathologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells%2Fprogenitors+in+the+specific+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li>
<li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102(2014).</li>
<li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li>
<li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li>
<li>Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+a+cerebellar+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).</li>
<li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+hemangioblastoma%3A+histogenesis+of+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li>
<li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas%3A+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li>
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<li>Sharifpanah, F., Sauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Spheroid-Based+Sprout+Assay+in+Three-Dimensional+Fibrin+Scaffold%3A+A+Novel+In+Vitro+Model+for+the+Study+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).</li>
<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+taurine+upregulated+1+enhances+tumor-induced+angiogenesis+through+inhibiting+microRNA-299+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma.</a> Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Conveniently+Screening+pLKO.1-TRC+Vector+Tagged+with+TurboGFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).</li>
<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li>
<li>D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+Vasculogenesis+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease.</a> Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).</li>
<li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li>
<li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li>
<li>Blacher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+in+the+spheroid+sprouting+assay%3A+a+spatial+organisation+analysis+adaptable+to+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour.</a> PLoS One. 9 (5), 97019(2014).</li>
<li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li>
<li>Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+angiogenesis+in+human+tumor+dormancy%3A+animal+models+of+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch.</a> Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).</li>
<li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis%3A+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li>
<li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li>
<li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753(2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

최근, 혈관 생물학 연구의 여러 분야는 신생 endothelium15의 연구에 의해 자극 되었다. 이 문서에서는, 우리는 내 피 회전 타원 체의 소설 후보 분자 식별 하 조작 내 피 세포에서 기능의 VHL 유전자의 손실에서 유래 혈관 형성을 연구 하는 실험 모델 기법을 돋 아 개발에 신생 캐스케이드입니다. 우리의 지식 최선을이 endogenic 수정 된 내 피 세포의 신생 효과 검사 하는 첫 번째 보고서 이다.
(를 포함 하 여 종양 조직) 조직을 neovascularization 통해 신생 및 vasculogenic 메커니즘 두 생리 및 병 적인 조건12,15 에서 뿐만 아니라 개발 하는 동안 발생 하는 복잡 한 과정은 , 16. 회전 타원 체 분석 결과...

Hemangioblastomas (HBs)는 독점적으로 인간 중앙 신경 시스템 (CNS) 내에서 발견 되는 양성 혈관 종양. 그들은 폰 Hippel Lindau (VHL) 질병 또는 산발적 병 변 환자에서 개발. VHL HBs 빈번한 재발으로 인해 수술 치료를 통해 치료 하기 어려운 고 발생이 유전자 여러 병 변 장애1. VHL 종양 억제기 유전자의 비활성화 VHL HBs tumorigenesis의 근본 원인을 고려 하고있다, 비록 HBs의 진화 과정과 cytological 근원 (를 포함 하 여 neovascularization) 크게 논란이2남아 있다. 따라서, HB-신생 생물 학적 메커니즘의 더 나은 이해 VHL HBs에 대 한 가장 유망한 항 혈관 전략에 유용한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
최근 연구는 건의 HB neovascularization가 vasculogenesis3,,45와 비슷합니다. 고전적인 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)-중재 신생 혈관 내 피에서 유래 하 고 그 기능의 VHL 손실에 의해 구동 됩니다 확산 귀착되 고 신생 형성 되었습니다 도전6. 1965 년, Cancilla와 짐머만, 전자 현미경 검사 법, HBs endothelium7에서 유래를 사용 하 여. 나중 stromal 세포 vasoformative 요소8에서 파생 됩니다 발견 했다. 1982 년에, Jurco 그 외 여러분 발견 stromal 세포 내 피 기원9. 따라서, 우리는 인간의 혈관 내 피 세포는 HB neovascularization10의 원래 세포 가설. HB 셀 VHL 환자 수술에서 파생 된에서 기본 문화권을 사용 하는 것이 낫다, 비록 우리의 이전 연구 표시는 HB에서 주 문화는, 셀 라인 설립된3수 없습니다. 또한, 3D 환경에서 주 문화는 HB 혈관 재료10,11의 창시자를 포함 하기 때문 HB neovascularization cytological 원산지를 식별 하지 수 없습니다. 따라서, 내 피 세포의 원시적이 고 고전적인 모델 인간의 혈관 내 피 세포 (HUVEC) 대체 세포 모델 HBs에 대 한 될 수 있습니다.
회전 타원 체 돋 아 분석 결과 조직 공학12,13에 새로운 모델입니다. 이 문서에는 3D 콜라겐 기반의 coculture 시스템에서 생체 외에서 분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 개발 되었다, 고전적인 종양 신생 HBs, HBs의 역할에 있는지 여부를 평가 하는 전반적인 목표.

<table><tbody><tr><td>인간 제대 정맥 내피 세포</td><td>푸단 IBS 세포 센터</td><td>FDCC-HXN180</td><td></td></tr><tr><td>dulbecco' s 변형된 독수리' S 미디엄&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>26400044</tr><tr><td>PLKO.1-puro vector</td><td>Addgene</td><td>#8453</td><td></td></tr><tr><td>패킹 플라스미드 psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>envelope plasmid pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>3D round-bottom 96-well plates</td><td>S-Bio</td><td>MS-9096M</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>reduced serum medium&nbsp;</td></tr><tr><td>15-웰 플레이트</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td>젤 내의 기포는 &mu를 평형화함으로써 감소될 수 있습니다; &ndash; 사용 전 인큐베이터 내부에서 하룻밤 동안 혈관 형성 슬라이드 혈관 형성</td></tr><tr><td>보조제</td><td>Sciencell</td><td>#1052</td><td></td></tr><tr><td>10cm 배양 접시</td><td>Corning</td><td>Scipu000813</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>typsin-EDTA</td><td>Gibco 25200056</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 세포 계수 시스템 &nbsp;</td><td>생명공학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어&nbsp;</td><td>윈마시스</td><td></td><td>http://mywim.wimasis.com&nbsp;</td></tr></tbody></table>

분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 hemangioblastoma neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

폰 Hippel Lindau (VHL) 종양 억제기 유전자의 비활성화 인간 중앙 신경 시스템 (CNS) 내에서 hemangioblastomas (HBs)의 개발에 중요 한 역할을 하고있다. 그러나, cytological 근원 그리고 HBs (neovascularization 포함)의 진화 과정 남아 논란, 그리고 안티-신생 VHL-HBs, 고전적인 HB 신생에 기반에 대 한 임상 시험에서 실망 스러운 결과 생산 했습니다. 반대로 혈관 치료의 성공적인 임상 번역 한 주요 장애물이 neovascularization 혈관이 종양에의 한 철저 한 이해의 부족 이다. 이 문서에서는, 우리가 여부를 평가 체 외에 고전적인 종양 신생 HBs, HBs의 역할에 있는 포괄적인 절차 제시. 이 절차와 연구원 수 정확 하 게 HB neovascularization의 복잡성을 이해 하 고이 일반적인 형태의 HBs에 신생의 함수를 식별. 이러한 프로토콜 있는 잠재력이 높은 변환 종양 치료 또는 HBs에 대 한 안티-신생 치료의 최적화에 돕고 미래에 번역에 대 한 종양을 위한 가장 유망한 항 혈관 치료를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 결과 HB neovascularization의 복잡성을 강조 하 고는 것이 좋습니다이 일반적인 양식 신생 HB neovascularization만 보완 메커니즘.

거꾸로 가벼운 현미경에 의해 원래 이미지를 가져옵니다. VHL 그룹과 컨트롤 그룹의 전형적인 이미지는 그림 2에 표시 됩니다-A1 및 그림 2-A2. 컨트롤 그룹의 돋 아 길이 VHL 그룹 보다 짧습니다.
이미지를 업로드 후 온라인 플랫폼 직접 분석 결과 제공 합니다. 출력 두 부분으로 구성: 처리 된 이미지와 해당 분석 결과. 처리 된 이미지는 컨트롤 그룹과 VHL 유전자 침묵 그룹의 서로 다른 색상으로 표시 됩니다 (그림 2-A3 및 그림 2-A...

이 종이 여부를 평가 체 외에 고전적인 종양 신생 hemangioblastomas (HBs)와 HBs에서의 역할에 있는 포괄적인 절차를 제공 합니다. 결과 HB neovascularization의 복잡성을 강조 하 고는 것이 좋습니다이 일반적인 형태의 신생 HB neovascularization만 보완 메커니즘.

분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

이 실험의 전반적인 목표는 in vitro에서 스페로이드 발아 분석을 사용하여 추정되는 혈관모세포종 신생혈관형성의 성능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 종양 혈관 신생과 같은 혈관 신생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 고전적인 종양 혈관 형성이 혈관 모세포종에 존재하고 혈관 모세포종에서 자라는 체외를 평가하는 포괄적 인 절차의 산물이라는 것입니다.이 기술의 함의는 혈관모세포와 혈관형성의 치료로 확장되는데, 그 이유는 그 결과가 혈관모세포증 신생혈관형성의 복잡성을 강조하기 때문이며, 이는 이러한 일반적인 형태의 혈관신생이 보완적인 메커니즘일 뿐임을 시사하기 때문입니다. 따라서 이 방법은 혈관모세포증 신생혈관형성 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 유리제 종양에 있는 종양 vasculogenic 모방과 같은 몇몇 단단한 종양에 있는 종양, angiogenesis, 및 vasculogenesis 관련 신청에 적용될 수 있습니다.이 방법의 실제 시연은 이러한 조작된 내피 세포 스페로이드 단계의 생성을 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 적절한 조건이 중요하기 때문입니다. 먼저, 10%의 소 태아 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배양 배지에서 HUVEC 내피 세포를 배양합니다.그런 다음 인큐베이터에서 이산화탄소 5%가 포함된 섭씨 37도의 배양을 유지합니다. 다음으로, shRNA 단편을 합성하기 위해 ApaI 및 EcoRI 제한 효소로 플라스미드를 분해합니다. 그런 다음 분해된 플라스미드에 정방향 및 역방향 올리고, 10x NEB 완충액 및 이중 증류수를 최종 부피 50마이크로리터에 추가합니다.모든 시약을 첨가한 후 혼합물을 섭씨 98도에서 4분 동안 가열합니다. 그런 다음 몇 시간 안에 실온으로 서서히 식히십시오. T4 리가아제를 사용하여 어닐링된 올리고와 플라스미드를 접합합니다.튜브를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 25마이크로리터의 DH5alpha 수용 세포에 5마이크로리터의 결찰 혼합물을 추가합니다. 500 microlit의 DMEM 배지에 lentiviral vector 또는 scrambled vector를 다른 패키징 플라스미드와 함께 첨가합니다.그런 다음 렌티바이러스 혼합물을 섭씨 37도에서 25분 동안 배양합니다. 배양 후 7ml의 DMEM 배지를 스크램블 또는 렌티바이러스 혼합 용액에 첨가합니다. 10cm 배양 접시에서 소 태아 혈청이 없는 DMEM 배지에서 293FT 세포를 배양합니다.1ml의 렌티바이러스 또는 스크램블 용액을 배양 접시의 293FT 세포에 추가합니다. 6 시간 후, 배양 접시에서 오래된 배지를 흡인합니다. 그런 다음 기존 배지를 10%의 소 태아 혈청을 함유한 새로운 DMEM 배지로 교체합니다.48시간 후 배지를 수집합니다. 렌티바이러스 배지에서 HUVEC 내피 세포를 이식하고 72시간 동안 유지합니다. 다음으로, HUVEC 세포 배양 배지에 밀리리터당 2마이크로그램의 퓨로마이신을 첨가합니다.마지막으로, 다시 24시간 동안 배양을 배양합니다. 다음 날, 1ml의 트립신 EDTA를 첨가하여 HUVEC 세포를 트립신화합니다. 그런 다음 트립신화된 세포 현탁액을 10% 소 태아 혈청으로 DMEM 배지에 재현탁시킵니다.셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산합니다. 계수 후 3D 둥근 바닥 96웰 플레이트에 세포를 파종합니다. 파종 후 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%를 함유한 세포를 72시간 동안 지속적으로 배양합니다.36시간 후 배양 배지의 절반을 새 배지로 교체합니다. 먼저 겔 용액을 섭씨 4도에서 해동한 다음 환원된 혈청 배지로 1:5의 비율로 희석합니다. 마이크로피펫을 사용하여 DMEM 배지에서 스페로이드를 빨아들입니다.다음으로, 스페로이드를 5ml의 환원 혈청 배지로 세척합니다. 현탁된 스페로이드와 희석된 젤을 조심스럽게 옮깁니다. 15웰 플레이트에 스페로이드와 희석된 겔의 혼합 액체 300마이크로리터를 삽입합니다.접시를 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%로 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 400마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 단일 웰에 추가합니다. 증발을 방지하려면 우물 주변을 멸균수로 채우십시오.그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 100%에서 한 시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 기존 배지를 흡인하고 1% 내피 세포 성장 보충제가 포함된 600마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 웰에 첨가하고 하루 동안 배양합니다. 도립광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.여기에서 세포의 스페로이드 발아를 도립 광 현미경을 사용하여 캡처하여 VHL 유전자 침묵이 내피 세포의 혈관 형성 전위에 미치는 영향을 연구합니다. 스페로이드는 대조군 및 VHL 침묵 내피 세포 모두에서 렌티바이러스 처리 후 12시간 후에 싹을 틔우는 것으로 보입니다. 다음으로, VHL 유전자 침묵 스페로이드에 의해 생성된 새싹의 길이를 정량화하기 위해 통계 분석을 수행합니다.평균 새싹 길이는 VHL 침묵 그룹에서 약 125마이크로미터인 반면 대조군에서는 약 65마이크로미터에 불과합니다. VHL 침묵 그룹의 평균 누적 새싹 길이는 약 1250마이크로미터인 반면 대조군은 680마이크로미터입니다. 이러한 결과는 VHL 침묵 그룹에서 새싹 길이가 2배 증가했음을 나타냅니다.이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 48시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차와 방법에 따라 모세관 형성과 같은 분석을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다. 혈관 내피 세포의 혈관 형성 능력을 탐구하는 것과 같습니다.이 개발 이후, 이 기술은 혈관 신생 분야의 연구자들이 종양 내부 혈관화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 폭발 분석에 사용되는 조작된 내피 세포에서 어떤 유전자가 기능을 잃는지 잘 이해할 수 있을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

프로토콜에는 회전 타원 체에 perfusable 혈관 네트워크를 설계 하는 방법을 설명 합니다. 회전 타원 체의 주변 microenvironment 신생 유도 microchannels 미세 장치에는 회전 타원 체 연결을 고안 이다. 메서드를 사용 하면 3 차원 문화에 오랫동안 기다려온 기술 회전 타원 체의 관류를 수 있습니다.

미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크

이 프로토콜 선물 소설 체 외에서 구슬 시험을 더 적절 하 게 vivo에서 pericytes를 통합 하 여 신생을 돋 아의 프로세스 모델. 이 수정 구슬 분석 결과를 내 피 세포와 신생에 대 한 중요 한 벽화 셀 간의 heterotypic 세포 상호 작용을 더 충실 하 게 정리를 수 있습니다.

분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 Pericytes 통합

이 방법은 표준화된 미세 유체 플랫폼에서 40개의 교류 3D 마이크로혈관으로서 iPSC 유래 내피 세포의 배양을 기술한다. 이 플랫폼은 확장 가능하고 처리량이 높은 방식으로 혈관 신생 콩나물의 해부학 및 안정화를 포함하여 3D로 그라데이션 구동 혈관 신생 발아를 연구 할 수 있습니다.

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

3차원 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석 시스템은 생리적 혈관신생을 모방하도록 설계된다. 공배양 스페로이드는 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, ECFC 및 MSC에 의해 형성되고, 콜라겐 겔에 내장된다. 새로운 시스템은 혈관 신생 변조기를 평가하는 데 효과적이며 생체 내 연구에 보다 관련성이 있는 정보를 제공합니다.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

이 프로토콜은 마이크로 혈관 증식의 전 생체 모델인 초로이드 발아 분석체를 제시합니다. 이 분석체는 코로이드 마이크로 혈관의 증식에 관여하는 경로를 평가하고 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 약물 치료를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

안구 미세 혈관 신생의 전 비보 코로이드 발아 분석

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

유방 상피 세포와 내피 세포 사이 교차 토크는 중요한 유방암 진행에 기여, 종양 성장, 및 전이. 이 연구에서는, 스페로이드는 혈관 및/또는 림프 성 내피 세포와 함께 유방암 세포에서 만들어졌으며 유방암 연구를위한 체외 시스템으로서 자신의 적용성을 입증했습니다.

유방암 연구를 위한 잠재적인 기능적인 시험관 내 모형으로 유방 상피 및 내피 세포 스페로이드

여기에서는 종양 스페로이드를 빠르고 강력하며 저렴하게 제조한 후 하이드로겔 캡슐화를 수행할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 특수 장비가 필요하지 않기 때문에 널리 적용 가능합니다. 스페로이드 매트릭스 상호 작용을 탐색하고 체외 조직 생리학 또는 병리학 모델을 구축하는 데 특히 유용할 것입니다.

스페로이드-매트릭스 상호 작용 연구를 위한 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔의 종양 스페로이드 제조 및 캡슐화

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

학습하세요 spheroid sprouting assay를 사용하여 hemangioblastoma의 신생혈관형성을 평가하는 방법을. 이 기법은 종양 혈관신생 메커니즘을 연구하고 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

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