Name: 재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 배우세요 식물에서 애그로인필트레이션을 이용한 재조합 단백질의 고수준 과발현 방법을. 담배 잎에서 GFP 형광을 통해 단백질 발현을 평가하고, 이 기술이 약용 단백질 대량 생산에 확장 가능함을 확인하세요.

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우리는 R. 태양과 기여에 대한 첸의 연구실의 학생들은 물질 생성을 심어 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 기술과 혁신 (CTI)의 대학 학부 연구의 그의 지원을 위해 박사 D. 녹색 감사합니다. 이 연구는 Q. 첸에 NIH 보조금 U01 AI075549 및 1R21AI101329, 그리고 Q. 첸 애리조나 주립 대학의 CTI에서 SSE 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다. K. Leuzinger, M. 덴트, J. Hurtado, 그리고 J. Stahnke는 SSE 지원에 의하여 학부생입니다.

1. 식물 성장 <ol><li> 전파 트레이에 위치 60 토탄 펠릿. 수돗물 4 L을 추가하고 토탄 펠릿 2 시간 동안 물을 흡수 할 수 있습니다. </li><li> 2 N. 추가 파종기를 사용하여 각 토탄 펠릿에 benthamiana 씨앗, 투명한 플라스틱 돔 트레이를 커버하고, 그들이 8분의 16 시간 일 / 1 박 사이클 (그림 1A)와 25 ° C, 84 % 습도 환경에서 발아 할 수 있습니다. </li><li> 2 주 파종 후 돔을 제거하고 트레이에서 물을 배수하고, 1.48 g / L (그림 1B)의 농도 잭의 비료 2 L을 추가합니다. 8분의 16 시간 일 / 밤주기 25 ° C, 습도 50 %의 환경에서 식물을 성장하는 것을 계속한다. 잭의 비료 2 L 트레이 당 2 일마다를 제공합니다. </li><li> 그들은 나이가 6 주 (그림에 침투 할 준비가 될 때까지 4 주에서 추가 성장 (그림 1C)에 대한 충분한 공간을 제공하는 6 개 발전소를 호스팅하는 새로운 트레이에 이탄 알약과 식물을 전송1D). </li></ol> 2. A. 박테 리움 문화 준비 주사기 침투 2.1 준비 <ol><li> 줄무늬 A. geminiviral 벡터 P19, pREP110, pBYGFP 및 카나마이신을 (100 ㎍ / ㎖)이 포함 된 LB 한천 플레이트에 pBYDsRed을 포함 박테 리움 균주 GV3101. 연속 한 판 당 변형 및 48 시간 동안 30 ° C에서 성장. </li><li> 마찬가지로, 줄무늬와 LB 한천에 GV3101 5 MagnICON 벡터 숨겨 변종 &#39;모듈 (pICH15879)를, 3&#39;GFP 나는 DsRed (PICH-GFP 또는 PICH-는 DsRed)의 표적 유전자를 포함하는 모듈 및 Integrase (pCH14011)을 성장 carbenicillin을 (100 ㎍ / ㎖)이 포함 된 접시. </li><li> LB 한천 플레이트에 하나의 식민지에서 YENB 미디어 3 ㎖ (0.75 % Bacto 효모 추출물, 0.8 % 영양소 국물, NaOH를 7.5로 산도를 조정)에 geminiviral 벡터를 품고 GV3101 균주를 접종 + 카나마이신 (100 ㎍ / ㎖)의 15 mL 둥근 바닥 문화 관, ° C에서 30 액체 문화를 성장300 RPM의 회전 속도와 하룻밤 셰이커. </li><li> 마찬가지로, 접종 30시 흔드는 하룻밤에 YENB 미디어 + carbenicillin (100 ㎍ / ml)에 MagnICON 벡터를 품고 GV3101 긴장 ° C. 성장 </li><li> 분광 광도계 적절한 항생제로 YENB 미디어 10ml에 0.025의 시작 OD 600 새로운 문화에 대한 계대 배양 할 필요가 볼륨 (V 이하)를 계산하려면 아래 공식을 사용하여 각 액체 문화를 측정하고 기록한다 OD 600 값 . V 이하 (ML) = (10 ㎖) × (0.025) / OD 600 </li><li> 에 하룻밤 문화의 양도 V 이하 (ML) (10 - V 이하) 각 변형에 대한 적절한 항생제 YENB 미디어 ML. 새로운 문화 30 하룻밤 250 RPM의 회전 속도와 셰이커 ° C OD 600 값이 1.7-2.0의 범위가 될 때까지. 성장 </li><li> 측정하고 기록 OD 각각의 액체 배양 600 값을 계산기에 아래 수식을 사용각 변형에 대해 0.12의 최종 OD 600을 제공하기 위해 침투 버퍼의 50 ML에 희석 할 필요 체적 (V INF)을 ulate. V INF (ML) = (50 ML) × (0.12) / OD 600 </li><li> 전송 V microcentrifuge 관에 각 문화의 INF (ML)과 2 분 12,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 스핀 뜨는 제거하고 (10 MM MES, 산도 5.5 10 ML 침투 버퍼에 세포를 resuspend을, 10 mM의 황산 마그네슘 4) 잠시 텍싱 있습니다. </li><li> 혼합 pBYGFP + pREP110 + P19의 세포를 재 부유, 2 분 12,000 XG에서 세포를 스핀 다운, 그리고 침투 버퍼의 50 ML의 총에 resuspend을. 이 Agrobacteria 조합은 GFP의 geminiviral 표현입니다. </li><li> 마찬가지로, Agrobacteria 세포의 다음과 같은 조합을 혼합 스핀 다운 및 침투 버퍼의 50 ML에서 그들을 resuspend을. 그들은 다음을 포함한다 (1) pBYDsRed + pREP110는 DsRed의 geminiviral 표현, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110에 대한 + P19GFP와는 DsRed, (3) pREp110 GFP의 MagnICON 식 (5)에 대한 geminiviral 식의 부정적인 컨트롤과 + P19, (4) PICH-GFP + pICH15879 + pCH14011 PICH -는 DsRed + pICH15879는 +의 공동 발현 geminiviral위한 + P19 MagnICON의는 DsRed의 표현, 그리고 MagnICON 식에 대한 대조군으로 (6) pICH15879 + pCH14011에 대한 pCH14011. </li></ol> 진공 침투 2.2 준비 <ol><li> 접종과 문화 각 GV3101 50 ML 멸균 플라스크에 적절한 항생제로 YENB 미디어의 15 ML에 geminiviral 벡터 또는 MagnICON 벡터를 포함하는 변형과 성장은 하룻밤 위의 주사기 침투에 대해 설명했다. </li><li> 분광 광도계 적절한 항생제로 YENB 미디어 250 ㎖에 0.025의 시작 OD 600 새로운 문화에 대한 계대 배양 할 필요가 볼륨 (V 이하)를 계산하려면 아래 공식을 사용하여 각 액체 문화를 측정하고 기록한다 OD 600 값 . V 이하 </sub&gt; (ML) = (250 ML) × (0.025) / OD 600 </li><li> 전송 V의 하룻밤 문화의 하위 (ML) (250 - V 이하) 각 변형에 대한 적절한 항생제로 1 L 멸균 플라스크에 YENB 미디어의 ML과 하룻밤 위의 주사기 침투에 대해 설명 된 새로운 문화를 성장. </li><li> 측정하고 기록 OD 각각의 액체 배양 600 값을 각 변형에 대해 0.12의 최종 OD 600을 제공하기 위해 침투 버퍼의 3 L에 희석 할 필요 체적 (V INF)를 계산하려면 아래 공식을 사용합니다. V INF (ML) = (3000 ML) × (0.12) / OD 600 </li><li> 펠렛 및 주사기 침투에 대한 설명과 주사기 침투에 대해 설명 된 조합에 따라 재 부유 문화를 혼합으로 침투 버퍼에있는 각 문화를 Resuspend V INF (ML). Repellet 혼합 Agrobacteria 세포 침투 버퍼의 3 L에서 그들을 resuspend을. </li></ol> 3.1 주사기 침투 <ol><li> 네 6 주 이전 N. 선택 5와 benthamiana 공장은 각각의 잎. 각 공장의 상단부터 시작하는 처음 세 개의 잎은 A.의 조합 중 하나에 완전히 침투 될 것입니다 침투 버퍼의 변종을 박테 리움. 네 번째 잎이 될 것입니다 스포트 침투 geminiviral 표현을위한 네 가지 변형 조합 또는 MagnICON 식에 대한 세 가지 조합. 각 공장의 마지막 잎 부정적인 컨트롤의 조합으로 침투 될 것입니다. </li><li> 잎의 뒷면 (그림 2A)의 표피에 바늘로 작은 흠을 만듭니다. 주의 : 침투 혼합물 Agrobacteria 세포가 잎의 다른 측면에 구멍을 통과하므로, 양쪽을 통해 잎 관통하는만큼 열심히 긁히지 않도록해야합니다. </li><li> 잎의 앞면의 확고한 보류를 가지고 부드러운 적용하는 동안한 손의 엄지 손가락 닉 반대 압력, 니들 (그림 2B)이없는 주사기 닉에 침투 버퍼에있는 아그로 박테 리움 혼합물을 주입. 참고 : 아그로 박테 리움 혼합물 잎의 세포 사이 공간을 입력으로 침투 영역 (그림 2C) 눈에 띄게 어두운 녹색으로 바뀔 것이다. </li><li> 어두운 녹색 원이 확장 멈출 때까지 별명으로 아그로 박테 리움 혼합물을 주입하는 것을 계속한다. 전체 잎이 침투하고 전체 잎의 처음 세 잎 마지막 잎에는 짙은 녹색으로 점등 될 때까지 또 다른 별명 단계를 반복 3.1.2-3.1.4을 만듭니다. </li><li> 각 공장의 네 번째 잎의 경우, 모든 4 개 (geminiviral 벡터) 또는 세 (MagnICON 벡터) 조합은 그것으로 침투 될 것입니다. 아그로 박테 리움 균주의 각 조합에 대해 하나의 별명을 만들고, 하나의 조합으로 각 닉에 침투. </li><li> 침투 한 후, 성장 방 모니 식물을 다시 이동2-15일 포스트 침투 수 (dpi) 간의 토르 단백질 발현. </li></ol> 3.2 진공 침투 <ol><li> 진공 건조기와 욕조에 아그로 박테 리움 균주를 포함하는 전송 3 L 침투 버퍼에 욕조를 배치합니다. Vacuubrand 다이아 프램 진공 펌프 (그림 3A)을 데시 케이 터에 연결합니다. </li><li> 데시 케이 터 플레이트 (그림 3B)에 거꾸로 공장을 배치하고 전체 잎과 줄기 시스템은 욕조의 꼭대기 휴식 플레이트 침투 버퍼에 빠져들 때까지 식물로 판을 낮 춥니 다. 가장자리를 따라 데시 케이 O 링을 배치하고 챔버 (그림 3C)에 데시 케이 터의 뚜껑을 넣어. </li><li> 진공 펌프를 켜고 진공 100 밀리바에 도달 할 때 타이밍을 시작합니다. 천천히 물속에 잠긴 식물 조직의 틈새 공간에 Agrobacteria의 입학을 허용하는 100 mbar에 1 분 후 데시 케이 터에서 방출 밸브를 엽니 다. 이 단계를 한 책상 외에도 반복좋은 침투을 보장하기 위해 각형 시간입니다. </li><li> 침투 한 후, 데시 케이 터의 공장을 가지고 그 직립 위치에 다시 넣어. 2-15 dpi로 간 성장 방 모니터 단백질 발현에 식물을 다시 이동합니다. </li></ol> 4. 형광 단백질의 검출 및 사진 <ol><li> 어두운 방에 dpi로, 이동 공장 2에서 시작하여 소형 UV 램프로 침투 잎의 뒷면에 UV 빛을. </li><li> GFP 나는 DsRed의 붉은 형광 녹색 형광을 관찰한다. 는 DsRed는 단파 UV 빛의 밑에 강한 반면 GFP는 장파 자외선에 강한 신호를 제공합니다. </li><li> 아니 플래시 일반 디지털 카메라로 형광 잎의 사진을 가져 가라. </li><li> 관찰 또는 촬영 후 성장 방에 식물을 다시 이동합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 아무런 재정적 이익을 경쟁 없다.

단백질 기반의 의약품에 대한 증가하는 요구는 전 세계적으로 강력하고, 확장 성, 저렴한 비용과 안전한 새로운 생산 플랫폼을 필요로합니다. 식물은 제약 단백질 생산을위한 가장 유망한 대체 생산 시스템 중 하나가 될 것으로 나타났습니다. 최근 몇 년 동안, 해체 바이러스 기반 벡터의 개발은 크게 속도와 식물 발현 시스템 2,10의 수율을 향상 식물에서 단백질의 일시적인 표현을 사용하고있다. 또한 과도 발현 시스템의 유틸리티를 최적화하기 위해, 우리는 식물 조직에 표적 유전자가 포함 아그로 박테 리움을 소개하는 간단하면서도 효율적이고 확장 가능한 방법을 보여줍니다. 우리의 결과는 방법은 식물의 잎과 두 개의 형광 단백질 GFP와는 DsRed의 강력한 생산에 아그로 박테 리움의 효율적인 도입에 결과가 주사기 나 진공 하나에 해당 agroinfiltration을 나타냅니다. efficie을 보장하기 위해NT를 agroinfiltrat...

1970 년대 이후, 식물 재조합 단백질 및 단백질 치료제 1의 상업 생산을위한, 포유 동물 곤충 및 세균 세포 배양에 대한 대안으로 모색되고있다. 바이오 의약품의 표현을위한 식물 기반 시스템은 임상 시험에서 성공을 보여, 고셔병의 질병 2, 조류 H5N1 독감 3과 같은 질병에 대한 몇 가지 새로운 치료법으로 최근 몇 년 동안 약속을 보여 주었다. 이러한 초기 실험 이후 수십 년 동안 공장에서 재조합 단백질 발현 능력 메커니즘의 개발은 세 가지 주요 이유로 단백질 생산의 현재 패러다임을 변경하는 식물 기반 시스템의 가능성을 만들었습니다. 첫째, 포유류 곤충, 및 세균 바이오 리액터 상당한 초기 비용, 비싼 성장 매체와 하류 정화 4 복잡한 과정을 필요로 비용 주목할만한 감소가있다. 안정적인 형질 전환 식물의 생성라인은 또한 단백질 발현 식물이 재배 농업 규모 5에 수확 할 수로 다른 표현 시스템의 확장 성을 능가 할 수 있습니다. 둘째, 식물 기반의 발현 시스템은 크게 공공 안전 6 우수성을 보여주는, 인간 단백질 발현 호스트에서 사람 또는 동물 병원체 전송의 위험을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 식물은 당화와 여러 소단위 단백질 7의 조립을 포함한 단백질의 적절한 번역 후 수정을 허용하는, 포유 동물 세포와 유사한 진핵 endomembrane 시스템을 사용합니다. 이 기능은 더 복잡한 구조를 가지고 광범위한 전사 후 수정 또는 어셈블리 8가 필요 단클론 항체 (드을) 등의 제약 재조합 단백질의 넓은 수 있기 때문에, 박테리아와 같은 원핵 생물 시스템에 따라 그 앞두고 식물 기반 시스템을 넣습니다. 두 가지 주요 APPRO이 있습니다식물에서 재조합 단백질을 발현에 아파. 첫 번째는 대상 단백질 코딩 DNA가 발현 카세트에 복제 및 핵 또는 엽록체 게놈 중 하나에 도입 안정적으로 형질 전환 라인의 개발이다. 이 과정에서 외국의 DNA가 다음 세대를 통해 유전되고 지금까지 다른 발현 시스템 1을 넘어, 엄청난 확장 성이 향상 할 수 있습니다. 핵 게놈에 외래 DNA의 도입은 일반적으로 조직 9 microprojectile 폭격에 의해, 덜 자주, 식물 조직의 아그로 박테 리움 감염에 의해 달성되거나. 식물 호르몬은 그 차별화와 뿌리와 잎 같은 형질 전환 식물 조직의 성장을 유도하는 데 사용됩니다. 엽록체 게놈의 변환은 A. 달성 할 수 없다 DNA로 코팅 박테 리움하지만, 금 또는 텅스텐 입자에 전적으로 의존 식물 세포로 탄도 발사. 재조합을 표현하는 두 번째 방법은식물 NT 단백질은 과도 표현을 통해 10입니다. 이 시나리오에서, 관심의 유전자를 품고 바이러스 유래 벡터는 A. 통해 전달됩니다 과정을 통해 완전히 개발 식물 박테 리움은 agroinfiltration을했다. 대신에 식물의 게놈에 통합으로, 전달 된 유전자 구조는 짧은 잠복기 후 수확하고 분리 할 수​​ 있습니다 원하는 단백질의 과도 생산을 지시하기 시작합니다. 식물 agroinfiltration 11 후 약 1-2 주를 수확 할 준비가 일시적인 유전자 발현은 큰 전체 단백질 축적뿐만 아니라 단백질의 생산 시간을 단축의 이점을 제공합니다. 이 1 년 몇 개월이 걸릴 수있는 안정적인 형질 전환 식물 라인의 생성, 선택 및 확인 프로세스보다 훨씬 빠릅니다. 이 유전자 안정적인 공장 리튬을 얻을하지 않으므로 그러나, 이것은 또한 일시적인 발현 시스템의 한계입니다대규모 상업 생산을위한 종자 은행을 생성 할 수 있습니다 NES. 그럼에도 불구하고, 접근 방식은 대규모의 일시적 발현을 개선하기 위해 개발되었습니다. 여기에서 우리는 A.에 의해 전달 해체 바이러스 벡터를 사용하여 과도 단백질 발현은 Nicotiana benthamiana 공장의 생성하는 한 가지 방법을 보여 박테 리움. 두 가지 주요 방법은 A.의 배달을 위해 개발되고있다 식물 조직에 박테 리움 : 진공 챔버를 통해 주사기와 대규모 침투를 통해 벤치 스케일 침투. 두 프로토콜은 N.를 사용하여 여기에 설명되어 있습니다 밀접 일반 담배 공장과 관련된 benthamiana, 두 형광 단백질의 과도 발현 기주 식물로 : 해파리 Aequorea 빅토리아 Discosoma 산호 (는 DsRed) 12,13에서 붉은 형광 단백질의 녹색 형광 단백질 (GFP). N. benthamiana에 대한 가장 일반적인 호스트 식물그것은 유전자 변형 의무가 있기 때문에 재조합 단백질은 빠르게 바이오 매스의 높은 금액을 산출하고, 스케일 업 생산 14 다작 종자 생산자 수 있습니다. N. 사용의 또 다른 이점 단백질 발현을위한 호스트로 benthamiana는 발현 벡터 2.5의 다양한 가용성이다. 본 연구에서는 두 해체 바이러스 성 벡터, 담배 모자이크 바이러스 (TMV) RNA의 replicon 시스템 (MagnICON 벡터)와 빈 노란색 난쟁이 바이러스 (BeYDV) DNA의 replicon 시스템 (geminiviral 벡터) 4,11에서 파생 된 다른 기준으로 한 15-18는 GFP와는 DsRed 유전자를 운반 N.에 그들을 제공하는 데 사용됩니다 A. 통해 benthamiana 세포 박테 리움. 세 DNA의 구조는 GFP 또는 MagnICON 벡터와는 DsRed 표현에 사용됩니다. 그들은 관심의 유전자를 포함하는 모듈 (PICH 5 &#39;대상 유전자 3의 발현 운전 발기인 및 기타 유전 적 요소를 포함하는 모듈 (pICH15879)&#39;을 포함- GFP 또는 PICH-는 DsRed) 및 integrase 모듈 (pICH14011)는 expression 8,15에 5 &#39;와 3&#39;모듈을 함께를 통합하는 효소를 코딩. 세 DNA의 구조는 geminiviral 벡터를 표현 필요합니다. 표적 유전자 (pBYGFP 또는 pBYDsRed)의의 replicon를 포함하는 벡터뿐만 아니라, 복제 단백질 (pREP110)에 대한 코딩 벡터는 대상의 replicon 11,14,16의 증폭이 필요합니다. 또한, 토마토 덤불 스턴트 바이러스에서 침묵 억압 P19 인코딩 벡터의 포함은 높은 수준의 목표 유전자의 발현 11,16 위해 원하는. 식물의 성장, A. 등 agroinfiltration에 의해 식물 세포에 재조합 단백질의 유전자의 도입을위한 세 가지 주요 단계는 일반적으로있다 박테 리움 문화 준비 및 침투. 각 단계마다이 절차의 궁극적 인 성공에 중요한이기 때문에, 따라서 자세한 설명이 제공됩니다주사기 침투 아래 진공 침투 모두.

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>Reagents</td></tr><tr><td>GFP </td><td>Invitrogen</td><td>V353-20</td><td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> 참조 참조: Lico and Chen, et al 2008</td></tr><tr><td>DsRed</td><td>Clontech</td><td>632152</td><td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> 참조 참조: Baird and Zacharias, et al 2000</td></tr><tr><td>MagnICON Vector</td><td>Icon Genetics</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> 참조 참조: giritch and Marillonnet, et al 2006</td></tr><tr><td>Geminiviral Vector</td><td>Author' s Lab</td><td>n/a</td><td>참고 문헌 참조: Chen and He, et al 2011</td></tr><tr><td>N. benthamiana</td><td>Author' s Lab</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens 균주 gv3101</td><td>저자' s Lab</td><td>n/a</td><td>참조 참조: Lai and Chen 2012</td></tr><tr><td>LB 한천 Carbenicillin-100, 플레이트</td><td>Sigma</td><td>L0418</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>LB Agar Kanamycin-50, 플레이트</td><td>Sigma</td><td>L0543</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헤파 수화물</td><td>시그마</td><td>M2773-500 g</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Bacto-Tryptone</td><td>Fisher</td><td>73049-73-7</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 212750</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a</td></tr><tr><td>>Difco 영양 육수</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 234000</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>MES 수화물 버퍼</td><td>Sigma</td><td>M8250-1kg</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Sigma</td><td>C1613-1ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"> www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>시그마</td><td>70560-51-9</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마</td><td>221465</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Jack' s 비료</td><td>Hummert International</td><td>Jul-25</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vacuubrand MD4 진공 펌프</td><td>Fisher</td><td>13-878-113</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>진공 공기 레귤레이터 밸브</td><td>Fisher</td><td></td> <td>NC9386590<a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Desiccator 12 1/8" with O ring</td><td>Fisher</td><td>08-594-15C</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>3 L</td><td>Tub Rubber-Maid</td><td>n/a</td><td>Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10컵 작업</td></tr><tr><td>플레이트/선반 230ML</td><td>Fisher</td><td>NC9489269</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Peat Pellet</td><td>Hummert International</td><td>14-2370-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>Propagation Tray Dome</td><td>hydrofarm</td><td>132052</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Propagaiton 트레이</td><td>수력 발전 138758</td><td></td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Virbo 핸드 파종기</td><td>Gro-Mor INC</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank" >www.gro-morent.com</a></td></tr><tr><td>Flora 카트 4</td>단 <td>Hummert International</td><td>65-6924-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>15 ml 라운드 바닥 배양 튜브</td><td>Sigma</td><td>CLS430172-500EA</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>분광 광도계 큐벳</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9950</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0602EDU</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Incubator/Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>Excella E25</td><td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank"> www.eppendorf.com</a></td></tr><tr><td>자외선 모델#: UVGL-25</td><td>UVP</td><td>95-0021-12</td><td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td></tr></tbody></table>

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 agroinfiltration

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

포유류 세포 배양 인간 백신과 치료 단백질의 상업 생산을위한 주요 플랫폼입니다. 그러나, 제한된 확장 성 및 높은 비용으로 인해 의약품에 대한 증가하는 세계적 수요를 충족 할 수 없습니다. 식물은 강력하고, 확장 성, 저렴한 비용과 안전한 가장 유망한 대체 의약품 생산 플랫폼 중 하나가 될 것으로 나타났습니다. 바이러스 기반 벡터의 최근 발전은 식물에서 재조합 단백질의 신속하고 높은 수준의 일시적인 표현을 허용했다. 또한 과도 발현 시스템의 유틸리티를 최적화하기 위해, 우리는이 연구에서 식물 조직에 표적 유전자가 포함 아그로 박테 리움을 소개하는 간단하고 효율적이며 확장 가능한 방법을 보여줍니다. GFP와는 DsRed, 우리의 결과는 방법은 잎 두 형광 단백질의 강력한 생산에 아그로 박테 리움의 효율적인 도입에 성공 주사기, 진공 모두에 해당 agroinfiltration을 나타냅니다. 또한,우리는 두 가지 방법으로 제공하는 독특한 장점을 보여줍니다. 주사기 침투가 간단하고 고가의 장비를 필요로하지 않습니다. 또한 유연성 하나 표적 유전자의 전체 휴가를 침투하거나 하나의 잎에 여러 대상의 유전자를 도입 할 수 있습니다. 따라서,이 재조합 단백질의 실험실 규모의 발현뿐만 아니라 수확량 또는 식 속도론에 대해 서로 다른 단백질이나 벡터를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 주사기 침투의 단순함은 생명 공학의 주제에 대한 고등학교와 대학 교육의 실용성을 제안한다. 반면, 진공 침투는 더 강력하고 제약 단백질의 상업적 제조를위한 스케일 업 할 수 있습니다. 그것은 또한 양상추와 애기 장대와 같은 주사기 침투에 대한 의무가없는 식물 종을 agroinfiltrate 할 수 있다는 장점을 제공합니다. 전반적으로, 주사기 및 진공 agroinfiltration의 조합은 연구자와 교육자를 제공하는, 간단하고 효율적이며 강력한과도 단백질 발현을위한 방법론. 그것은 크게 제약 단백질의 개발을 촉진하고 과학 교육을 추진합니다.

1. 주사기 침투에 의한 형광 단백질의 발현 geminiviral 및 MagnICON - - N.의 두 가지 해체 식물 바이러스 벡터에 의해 - GFP와는 DsRed - 식물 조직에 아그로 박테 리움의 주사기 침투의 효과를 입증하기 위해, 우리는 두 개의 형광 단백질의 발현을 테스트 benthamiana. N.위한 전체 Agrobacteria 포함 geminiviral 벡터로 침투했다 benthamiana 잎, GFP 발현은 빠르면 2와 dpi로부터 UV 빛의 밑에 전체 리프 지역에 관찰 4 dpi로 (그림 4C) 피크 축적에 도달하였습니다. geminiviral 벡터하여이 초기 GFP 발현이 다른 재조합 단백질 14,16,18,19 이전 결과와 일치한다. 반면, MagnICON 벡터 포함 아그로 박테 리움 조합으로 만 5 dpi로 후 ...

식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근 방법을보고<em&gt; 아그로 박테 리움</em&gt; 단백질의 과도 발현 식물에.

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

이 실험 시스템은 아그로 인필트레이션(agro infiltration)을 사용하여 유전자 구성물을 잎에 효과적으로 전달함으로써 고수준의 재조합 단백질을 생산합니다. 먼저, 인필트레이션 3일 전까지 제어된 환경에서 end hamana 식물을 6주 동안 배양합니다. 인필트레이션 당일에 식물에서 발현될 표적 유전자가 포함된 아그로박테리움 배양액을 준비합니다.주사기 또는 진공 침투법을 이용하여 아그로박테리움 배양액을 식물 조직에 도입합니다. UV 광원 아래 담배 잎에서 나타나는 GFP의 녹색 형광 강도와 같은 결과는, 현재의 포유류, 박테리아 및 곤충 기반 발현 시스템에 버금가는 식물 내 재조합 단백질의 강력한 발현을 보여줍니다. 아그로 침투법은 외래 유전자를 식물 세포로 도입하는 효율적인 방법이며, 이는 재조합 단백질의 고발현으로 이어집니다.이 방법은 광범위한 식물 종에 적용할 수 있습니다. 무엇보다 중요한 점은 의약용 단백질의 상업적 생산을 위해 규모를 확장할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 방법은 GFP의 역학 및 발현에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 서브유닛 백신, 재조합 단클론 항체와 같은 다른 단백질에도 적용 가능하며 암 및 감염성 질환 치료에 활용될 수 있습니다.성공적인 실험을 위해서는 박테리아 배양과 식물 재료 모두에 최적의 조건이 필요합니다. 이 침투 과정은 시각적 시연 후에 더 쉽게 재현할 수 있습니다. 먼저 육묘 트레이에 피트 펠릿을 최대 60개까지 배치하는 것으로 시작하십시오.수돗물 4L를 넣고 피트 펠렛이 물을 흡수하도록 2시간 동안 둡니다. 이제 각 피트 펠렛에 하마나 씨앗 2립씩을 넣고, 발아를 위해 트레이를 투명 플라스틱 돔으로 덮습니다. 씨앗을 25 °C, 습도 84% 환경에 둡니다.파종 2주 후, 돔을 제거하고 식물을 새 트레이로 옮깁니다. 그다음 1.48 g/L 농도의 Jack's 비료 2L를 첨가합니다. 식물을 25 °C에서 계속 배양합니다.이틀마다 50% 습도 환경을 유지합니다. 트레이당 2L의 Jack's fertilizer를 공급합니다. 4주 차에, 6주령까지 추가 성장시키기 위해 피트 펠렛이 담긴 식물을 6개의 식물을 수용하는 새 트레이로 옮깁니다.관심 유전자를 보유한 아그로박테리아 균주로 완전 침투(complete infiltration)시키기 위해, 잎이 5~6장인 6주 된 니코티아나벤타바쿰(Nicotiana benthamiana) 식물 4개를 선택합니다. 각 식물당 3장의 잎은 완전 침투용으로, 1장의 잎은 음성 대조군용으로, 나머지 1장의 잎은 부분 침투(spot infiltration)용으로 사용합니다. 잎 뒷면의 표피에 바늘로 작은 흠집을 내되, 잎의 양면이 모두 뚫리지 않도록 주의하십시오.한 손의 엄지손가락으로 잎 목 부분에 가벼운 반대 압력을 가하면서 첫 번째 잎의 앞면을 단단히 잡습니다. 주사기와 바늘을 사용하여 침투 버퍼에 희석된 아그로박테리움 혼합액을 목 부분에 주입합니다.진한 녹색 원의 확장이 멈출 때까지 닉(nick) 부위에 아그로박테리움 혼합물을 계속 주입하십시오. 그런 다음 다른 닉을 만들고, 잎 전체에 침투하여 전체적으로 진한 녹색으로 변할 때까지 주입 과정을 반복하십시오. 각 식물의 처음 세 장의 잎에 대해 침투를 완료하고, 네 번째 잎에는 4종의 제미니(Gemini) 바이러스 벡터 모두 또는 3종의 magcon 벡터 조합을 사용하여 침투시키십시오.또한, 아그로박테리움 균주(agrobacterium strains)의 각 조합당 하나의 닉(nick)을 만들고, 각 닉에 한 가지 조합을 침투시킵니다. 침투시킨 후, 식물을 다시 생장실로 옮겨 2일에서 15일 사이에 단백질 발현을 모니터링합니다. 침투 후, 진공 데시케이터에 통을 넣고 아그로박테리움 균주가 포함된 3L의 침투 완충액을 옮겨 담습니다.그 다음 데시케이터를 진공 브랜드 다이아프램 진공 펌프에 연결합니다. 이제 식물을 데시케이터 플레이트 위에 거꾸로 놓은 뒤, 잎과 줄기 전체가 침투 완충액에 잠길 때까지 식물이 놓인 플레이트를 내리고 플레이트를 조(tub) 상단에 거치합니다. 다음으로 데시케이터 O-링을 가장자리를 따라 배치합니다.데시케이터 뚜껑을 챔버에 닫은 후, 진공 펌프를 켜고 진공도가 100 millibar에 도달했을 때부터 시간을 측정하기 시작합니다. 진공 펌프를 끈 후, 100 millibar 상태로 1분 뒤에 데시케이터의 릴리스 밸브를 천천히 열어 아그로박테리아가 침수된 식물 조직의 간질 공간으로 들어갈 수 있게 합니다. 이 침투 과정을 반복합니다.충분한 침투를 위해 1단계 과정을 수행합니다. 그 다음 건조제에서 식물을 꺼내 다시 똑바로 세웁니다. 식물을 생장실로 옮기고 침투 후 2일에서 15일 사이에 단백질 발현을 모니터링합니다.주사기를 이용한 아그로박테리움(agrobacterium)의 식물 조직 침투 효과를 입증하기 위해, 두 가지 서로 다른 해체된 식물 바이러스 벡터인 Gemini viral 및 magcon for end를 사용하여 두 가지 형광 단백질 GFP와 Ds red의 발현을 테스트하였습니다. Gemini viral 벡터가 포함된 아그로박테리움으로 완전히 침투시킨 함나나(Hamana) 잎의 경우, UV 광선 아래에서 2 DPI부터 빠르게 전체 잎 영역에서 GFP 발현이 관찰되었으며 4 DPI에 최대 축적량에 도달하였습니다.반면에 agrobacterium 조합이 포함된 magcon 벡터를 침투시킨 잎에서는 5 DPI 이후에만 GFP 형광이 나타났으며, 7 DPI에 최대 축적량에 도달했습니다. 음성 대조군인 EP 10 plus P 19 agrobacterium 혼합물을 침투시킨 잎에서는 녹색 형광이 관찰되지 않았으며, 이는 해당 형광이 GFP 유전자에 특이적이며 잎의 배경 형광 결과가 아님을 나타냅니다. 최대 축적 시점에서 GFP를 발현한 magcon 벡터의 형광은 Gemini 바이러스 벡터의 형광보다 더 강했습니다.GFP 구조체가 침투된 잎에서는 주요한 괴사가 관찰되지 않았으며, 두 형광 단백질이 제미니 바이러스 벡터를 통한 주사기 점적 침투법으로 동일한 잎에 발현되었을 때, 침투된 지점에서 각각 예상되는 형광 색상으로 검출되었습니다. 흥미롭게도, GFP와 DS RED를 함께 침투시켰을 때 황색 형광이 나타났습니다. 또한, 식물 일시 발현 시스템을 이용한 재조합 단백질의 대량 생산에 사용할 수 있는 확장 가능한 아그로 침투법을 개발하기 위해 진공 침투법 또한 검토되었습니다.기대했던 대로 주사기 침투법과 비교하여 침투시킨 식물의 모든 잎에서 GFP 형광이 관찰되었습니다. 이 방법은 더 강력하며 훨씬 짧은 시간 내에 각 식물에 침투시킬 수 있습니다. 숙련되면 이 기술을 48시간 이내에 수행할 수 있습니다.실제 침투 시간은 단 몇 분에 불과하므로, 대부분의 시간은 아그로박테리움 배양을 위해 소요됩니다. 최적의 아그로 침투 효율과 표적 단백질 발현을 위해 프로토콜을 준수하십시오. 식물 생물공학 분야에서 식물 성장 조건, 아그로박테리움 농도, 진공 압력 및 지속 시간을 포함한 핵심 파라미터를 제어하는 것이 중요함을 기억하시기 바랍니다.이 실험적 접근 방식은 광범위한 식물 종에서 새로운 의약용 단백질의 개발 및 바이오 생산을 탐구하는 데 활용될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 아그로 인필트레이션(agro infiltration)을 사용하여 표적 유전자 구축물을 식물에 전달하고, 식물 일시 발현 시스템을 통해 포유류, 박테리아 및 곤충 세포 배양에 필적하는 재조합 단백질을 생산하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

efficient-agroinfiltration-plants-for-high-level-transient-expression

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

농약침과 PVX 농병은 식물에 있는 유전자의 일시적인 자궁 발현을 위한 일상적인 기능적인 분석입니다. 이 방법은 효과적인 전략 (급속한 저항 및 비열유전자 발견)에 있는 능률적인 연구및 분자 식물 병리학에 있는 현대 연구에 결정적입니다. 그들은 공장에서 강력한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족합니다.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

담배 식물은 일시적 발현 시스템을 통해, 진균 셀룰라아제, TrCel5A을 제조 하였다. 발현은 형광 융합 단백질을 사용하여 모니터링 할 수 있고, 단백질 활성은 사후 발현 분석되었다.

재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서<em&gt; 트리코더마 reesei</em&gt; 담배 식물에서

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.

Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

Nicotiana benthamiana 잎에서 생 합성 효소의 일시적인 분리 식 생 공급 2, 3-oxidosqualene 새로운 고부가가치 보관 제품의 생산으로의 착륙 장이 있습니다. 여기는 triterpenes 그리고이 강력한 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 아날로그의 빠른 (5 일) 대리점 규모 생산을 위한 상세한 프로토콜을 설명.

Nicotiana Benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

우리는 니코티아나 벤타미안에서GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 여기에서 설명한다. 이 프로토콜은 열 크로마토그래피를 활용하는 수많은 단백질의 정제 및 시각화로 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 직접 및 가상 대학 교육 실험실에 적용되어 프로젝트 기반 탐사를 제공합니다.

니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산

여기에서는 AT4G18020(APRR2)-AirID 단백질을 모델로 사용하여 오이(Cucumis sativus L.)에서 근접 라벨링(PL) 실험을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변형, 비오틴 침투, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 정제를 설명합니다.

식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링

여기에서는 대형 식물의 유전적 형질전환에 대한 생체 내 연구를 위한 국소 진공 침투를 위한 첫 번째 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론을 사용하여 우리는 처음으로 카카오의 식물의 일시적인 변형에서 Agrobacterium을 매개 하는 것을 달성했습니다.

난치성 식물의 식물 변형 을 위한 진공 강제 농업 여과: 사례 연구로서의 카카오

배우세요 식물에서 애그로인필트레이션을 이용한 재조합 단백질의 고수준 과발현 방법을. 담배 잎에서 GFP 형광을 통해 단백질 발현을 평가하고, 이 기술이 약용 단백질 대량 생산에 확장 가능함을 확인하세요.

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

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