재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

이 실험 시스템은 아그로 인필트레이션(agro infiltration)을 사용하여 유전자 구성물을 잎에 효과적으로 전달함으로써 고수준의 재조합 단백질을 생산합니다. 먼저, 인필트레이션 3일 전까지 제어된 환경에서 end hamana 식물을 6주 동안 배양합니다. 인필트레이션 당일에 식물에서 발현될 표적 유전자가 포함된 아그로박테리움 배양액을 준비합니다.

주사기 또는 진공 침투법을 이용하여 아그로박테리움 배양액을 식물 조직에 도입합니다. UV 광원 아래 담배 잎에서 나타나는 GFP의 녹색 형광 강도와 같은 결과는, 현재의 포유류, 박테리아 및 곤충 기반 발현 시스템에 버금가는 식물 내 재조합 단백질의 강력한 발현을 보여줍니다. 아그로 침투법은 외래 유전자를 식물 세포로 도입하는 효율적인 방법이며, 이는 재조합 단백질의 고발현으로 이어집니다.

이 방법은 광범위한 식물 종에 적용할 수 있습니다. 무엇보다 중요한 점은 의약용 단백질의 상업적 생산을 위해 규모를 확장할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 방법은 GFP의 역학 및 발현에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 서브유닛 백신, 재조합 단클론 항체와 같은 다른 단백질에도 적용 가능하며 암 및 감염성 질환 치료에 활용될 수 있습니다.

성공적인 실험을 위해서는 박테리아 배양과 식물 재료 모두에 최적의 조건이 필요합니다. 이 침투 과정은 시각적 시연 후에 더 쉽게 재현할 수 있습니다. 먼저 육묘 트레이에 피트 펠릿을 최대 60개까지 배치하는 것으로 시작하십시오.

수돗물 4L를 넣고 피트 펠렛이 물을 흡수하도록 2시간 동안 둡니다. 이제 각 피트 펠렛에 하마나 씨앗 2립씩을 넣고, 발아를 위해 트레이를 투명 플라스틱 돔으로 덮습니다. 씨앗을 25 °C, 습도 84% 환경에 둡니다.

파종 2주 후, 돔을 제거하고 식물을 새 트레이로 옮깁니다. 그다음 1.48 g/L 농도의 Jack's 비료 2L를 첨가합니다. 식물을 25 °C에서 계속 배양합니다.

이틀마다 50% 습도 환경을 유지합니다. 트레이당 2L의 Jack's fertilizer를 공급합니다. 4주 차에, 6주령까지 추가 성장시키기 위해 피트 펠렛이 담긴 식물을 6개의 식물을 수용하는 새 트레이로 옮깁니다.

관심 유전자를 보유한 아그로박테리아 균주로 완전 침투(complete infiltration)시키기 위해, 잎이 5~6장인 6주 된 니코티아나벤타바쿰(Nicotiana benthamiana) 식물 4개를 선택합니다. 각 식물당 3장의 잎은 완전 침투용으로, 1장의 잎은 음성 대조군용으로, 나머지 1장의 잎은 부분 침투(spot infiltration)용으로 사용합니다. 잎 뒷면의 표피에 바늘로 작은 흠집을 내되, 잎의 양면이 모두 뚫리지 않도록 주의하십시오.

한 손의 엄지손가락으로 잎 목 부분에 가벼운 반대 압력을 가하면서 첫 번째 잎의 앞면을 단단히 잡습니다. 주사기와 바늘을 사용하여 침투 버퍼에 희석된 아그로박테리움 혼합액을 목 부분에 주입합니다.

진한 녹색 원의 확장이 멈출 때까지 닉(nick) 부위에 아그로박테리움 혼합물을 계속 주입하십시오. 그런 다음 다른 닉을 만들고, 잎 전체에 침투하여 전체적으로 진한 녹색으로 변할 때까지 주입 과정을 반복하십시오. 각 식물의 처음 세 장의 잎에 대해 침투를 완료하고, 네 번째 잎에는 4종의 제미니(Gemini) 바이러스 벡터 모두 또는 3종의 magcon 벡터 조합을 사용하여 침투시키십시오.

또한, 아그로박테리움 균주(agrobacterium strains)의 각 조합당 하나의 닉(nick)을 만들고, 각 닉에 한 가지 조합을 침투시킵니다. 침투시킨 후, 식물을 다시 생장실로 옮겨 2일에서 15일 사이에 단백질 발현을 모니터링합니다. 침투 후, 진공 데시케이터에 통을 넣고 아그로박테리움 균주가 포함된 3L의 침투 완충액을 옮겨 담습니다.

그 다음 데시케이터를 진공 브랜드 다이아프램 진공 펌프에 연결합니다. 이제 식물을 데시케이터 플레이트 위에 거꾸로 놓은 뒤, 잎과 줄기 전체가 침투 완충액에 잠길 때까지 식물이 놓인 플레이트를 내리고 플레이트를 조(tub) 상단에 거치합니다. 다음으로 데시케이터 O-링을 가장자리를 따라 배치합니다.

데시케이터 뚜껑을 챔버에 닫은 후, 진공 펌프를 켜고 진공도가 100 millibar에 도달했을 때부터 시간을 측정하기 시작합니다. 진공 펌프를 끈 후, 100 millibar 상태로 1분 뒤에 데시케이터의 릴리스 밸브를 천천히 열어 아그로박테리아가 침수된 식물 조직의 간질 공간으로 들어갈 수 있게 합니다. 이 침투 과정을 반복합니다.

충분한 침투를 위해 1단계 과정을 수행합니다. 그 다음 건조제에서 식물을 꺼내 다시 똑바로 세웁니다. 식물을 생장실로 옮기고 침투 후 2일에서 15일 사이에 단백질 발현을 모니터링합니다.

주사기를 이용한 아그로박테리움(agrobacterium)의 식물 조직 침투 효과를 입증하기 위해, 두 가지 서로 다른 해체된 식물 바이러스 벡터인 Gemini viral 및 magcon for end를 사용하여 두 가지 형광 단백질 GFP와 Ds red의 발현을 테스트하였습니다. Gemini viral 벡터가 포함된 아그로박테리움으로 완전히 침투시킨 함나나(Hamana) 잎의 경우, UV 광선 아래에서 2 DPI부터 빠르게 전체 잎 영역에서 GFP 발현이 관찰되었으며 4 DPI에 최대 축적량에 도달하였습니다.

반면에 agrobacterium 조합이 포함된 magcon 벡터를 침투시킨 잎에서는 5 DPI 이후에만 GFP 형광이 나타났으며, 7 DPI에 최대 축적량에 도달했습니다. 음성 대조군인 EP 10 plus P 19 agrobacterium 혼합물을 침투시킨 잎에서는 녹색 형광이 관찰되지 않았으며, 이는 해당 형광이 GFP 유전자에 특이적이며 잎의 배경 형광 결과가 아님을 나타냅니다. 최대 축적 시점에서 GFP를 발현한 magcon 벡터의 형광은 Gemini 바이러스 벡터의 형광보다 더 강했습니다.

GFP 구조체가 침투된 잎에서는 주요한 괴사가 관찰되지 않았으며, 두 형광 단백질이 제미니 바이러스 벡터를 통한 주사기 점적 침투법으로 동일한 잎에 발현되었을 때, 침투된 지점에서 각각 예상되는 형광 색상으로 검출되었습니다. 흥미롭게도, GFP와 DS RED를 함께 침투시켰을 때 황색 형광이 나타났습니다. 또한, 식물 일시 발현 시스템을 이용한 재조합 단백질의 대량 생산에 사용할 수 있는 확장 가능한 아그로 침투법을 개발하기 위해 진공 침투법 또한 검토되었습니다.

기대했던 대로 주사기 침투법과 비교하여 침투시킨 식물의 모든 잎에서 GFP 형광이 관찰되었습니다. 이 방법은 더 강력하며 훨씬 짧은 시간 내에 각 식물에 침투시킬 수 있습니다. 숙련되면 이 기술을 48시간 이내에 수행할 수 있습니다.

실제 침투 시간은 단 몇 분에 불과하므로, 대부분의 시간은 아그로박테리움 배양을 위해 소요됩니다. 최적의 아그로 침투 효율과 표적 단백질 발현을 위해 프로토콜을 준수하십시오. 식물 생물공학 분야에서 식물 성장 조건, 아그로박테리움 농도, 진공 압력 및 지속 시간을 포함한 핵심 파라미터를 제어하는 것이 중요함을 기억하시기 바랍니다.

이 실험적 접근 방식은 광범위한 식물 종에서 새로운 의약용 단백질의 개발 및 바이오 생산을 탐구하는 데 활용될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 아그로 인필트레이션(agro infiltration)을 사용하여 표적 유전자 구축물을 식물에 전달하고, 식물 일시 발현 시스템을 통해 포유류, 박테리아 및 곤충 세포 배양에 필적하는 재조합 단백질을 생산하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.