재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

이 실험 시스템은 농업 침투를 사용하여 높은 수준의 재조합 단백질을 생산하기 위해 유전자 구조를 잎에 효과적으로 전달합니다. 먼저, 침투하기 3일 전인 6주 동안 통제된 환경에서 하마나 식물을 재배합니다. 침투 당일 식물에서 발현될 타겟 유전자를 포함하는 아그로박테리움 배양물을 준비합니다.

주사기 또는 진공 침투를 통해 아그로박테리움 배양물을 식물 조직에 도입합니다. 자외선 하에서 담배 잎에 있는 GFP의 녹색 형광의 강렬과 같은 결과는 현재 포유류, 박테리아 및 곤충에 근거한 발현 체계의 그것과 경쟁하는 식물에 있는 재조합 단백질의 강한 표정을 보여줍니다. 농업 침투는 식물 세포에 트랜스 유전자를 도입하는 효과적인 방법이며, 이는 재조합 단백질의 높은 수준의 발현으로 이어집니다.

다양한 식물 종에 사용할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 제약 단백질의 상업적 생산을 위해 확장할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 방법은 GFP의 동역학 그리고 표정으로 통찰력을 제공할 수 있고 subunit 백신, 재조합 단클론 항체 같이 다른 단백질에 적용될 수 있고, 암과 전염병을 위한 처리에서 사용될 수 있습니다.

성공적인 실험을 위해서는 박테리아 배양과 식물 물질 모두에 대한 최적의 조건이 필요합니다. 이 침투 프로세스는 시각적 시연 후 복제하기가 더 쉽습니다. 최대 60개의 이탄 펠릿을 번식 트레이에 넣는 것으로 시작합니다.

수돗물 4리터를 넣고 완두콩 알갱이가 물을 흡수하도록 2시간 동안 둡니다. 이제 각 이탄 펠릿에 두 개의 하마나 씨앗을 추가하고 발아를 위해 투명한 플라스틱 돔으로 트레이를 덮습니다. 씨앗을 섭씨 25도, 습도 84%의 환경에 놓습니다.

파종 후 2 주 후에 돔을 제거하고 식물을 새 트레이로 옮깁니다. 그런 다음 리터당 1.48g의 2리터를 추가합니다. 잭의 비료 섭씨 25도에서 식물을 계속 자랍니다.

이틀에 한 번씩 50%습도 환경. 트레이당 2리터의 잭 비료를 공급합니다. 4주차에 이탄 알갱이가 있는 식물을 6주까지 더 성장하기 위해 6개의 식물이 있는 새 트레이로 옮깁니다.

4주, 6주 된 하마마 식물을 선택하고 각각 5-6개의 잎을 가지고 있으며 각 3개의 잎은 관심 유전자를 보유한 농업 박테리아 균주에 완전히 침투합니다. 네거티브 컨트롤을 위한 하나의 잎과 스팟 침투를 위한 하나의 잎. 잎 뒷면의 표피에 바늘로 작은 흠집을 내고 잎이 양쪽을 관통하지 않도록 주의합니다.

첫 번째 잎의 앞면을 단단히 잡고 목에 부드러운 역압을 가합니다. 한 손의 엄지 손가락으로. 침투 완충액의 아그로박테리움 혼합물을 주사기, 바늘로 목에 주입합니다.

더 짙은 녹색 원이 팽창을 멈출 때까지 아그로박테리움 혼합물을 흠집에 계속 주입합니다. 그런 다음 다른 흠집을 만들고 잎 전체가 침투하고 잎 전체가 더 짙은 녹색으로 바뀔 때까지 주사를 반복합니다. 각 식물의 네 번째 잎에 대한 처음 세 개의 잎과 마지막 잎의 완전한 침투는 4개의 쌍둥이자리 바이러스 벡터 또는 3개의 마그콘 벡터의 벡터 조합으로 침투합니다.

또한 아그로박테리움 균주의 각 조합에 대해 하나의 흠집을 만들고 하나의 조합으로 각 흠집에 침투시킵니다. 침투 후 식물을 성장실로 다시 옮기고 2일에서 15일 사이에 단백질 발현을 모니터링합니다. 침투 후에는 욕조를 진공 건조제에 넣고 아그로박테리움 균주가 포함된 3리터의 침투 완충액을 주입합니다.

그런 다음 건조제를 진공 브랜드의 다이어프램 진공 펌프에 연결합니다. 이제 건조제 플레이트에 식물을 거꾸로 놓고 플레이트가 욕조 위에 놓인 상태에서 전체 잎과 줄기 시스템이 침투 완충액에 잠길 때까지 식물과 함께 플레이트를 내립니다. 다음으로 가장자리를 따라 건조제 O 링을 배치합니다.

챔버에 건조제 뚜껑을 씌운 후 진공 펌프를 켜고 진공이 100밀리바에 도달하면 타이밍을 시작합니다. 진공 펌프를 끈 후 100mbar에서 1분 후에 건조제의 릴리스 밸브를 천천히 열어 침수된 식물 조직의 틈새 공간으로 농업 박테리아가 들어갈 수 있도록 합니다. 이 침투를 반복합니다.

좋은 침투를 보장하기 위한 단계. 그런 다음 건조제에서 식물을 제거하고 똑바로 세운 위치에 다시 놓습니다. 식물을 다시 성장실로 옮기고 침투 후 2일에서 15일 사이에 단백질 발현을 모니터링합니다.

아그로박테리움이 식물 조직으로 침투하는 주사기의 효과를 입증하기 위해 두 개의 서로 다른 해체된 식물 바이러스 벡터인 Gemini, viral 및 magcon for end에 의한 두 가지 형광 단백질인 GFP와 Ds red의 발현을 테스트했습니다. 쌍둥이자리 바이러스 벡터를 포함하는 농업 박테리아에 완전히 침투한 하마나 잎. GFP 발현은 빠르면 2D PI부터 시작하여 4DPI에서 최대 축적에 도달하여 자외선 아래에서 전체 잎 영역에서 관찰되었습니다.

대조적으로, 아그로박테리움 조합을 포함하는 마그콘 벡터에 침투한 잎은 5DPI 후에만 GFP 형광을 보였으며 7DPI에서 최대 축적에 도달했습니다. EP 1 10 plus P 19의 음성 대조군 농업 박테리아 혼합물로 침투한 잎에서는 녹색 형광이 관찰되지 않았으며, 이는 형광이 GFP 유전자에 특이적이며 잎의 배경 형광의 결과가 아님을 나타냅니다. 최대 축적 상태에서 GFP로 발현된 magcon 벡터의 형광은 Gemini 바이러스 벡터의 형광보다 더 강합니다.

주사기 반점이 침투한 Gemini 바이러스 벡터를 통해 동일한 잎에서 두 형광 단백질이 발현되었을 때 GFP 구조체로 침투한 잎에서 주요 괴사가 관찰되지 않았으며, 침투한 지점에서 예상되는 형광색으로 검출되었습니다. 흥미롭게도, GFP와 DS RED의 동시 침투는 황색 형광을 일으켰습니다. 진공 침투는 또한 식물 일시적 발현 시스템에 의한 재조합 단백질의 대규모 생산에 사용할 수 있는 확장 가능한 농업 침투 방법을 개발하기 위해 검토되었습니다.

예상대로 주사기 침투와 비교하여 침투된 식물의 모든 잎에서 GFP 형광이 관찰되었습니다. 더 견고하고 훨씬 더 짧은 시간 프레임으로 각 식물의 침투를 달성할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 48시간 안에 수행할 수 있습니다.

대부분의 경우 실제 침투 시간이 몇 분에 불과하기 때문에 농업 박테리아 배양을 위한 것입니다.최적의 농업 침투 효율성과 표적 단백질 발현을 위해. 프로토콜을 따릅니다. 식물 생명 공학 분야에서 식물 성장 조건, 농업 박테리아 농도, 진공 압력 및 지속 시간을 포함한 중요한 매개 변수를 제어하는 것을 잊지 마십시오.

이 실험적 접근 방식은 광범위한 식물 종에서 새로운 제약 단백질의 발달 및 생물 생산을 탐구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 농업 침투를 사용하여 표적 유전자 구조를 식물에 전달하고 식물의 일시적인 발현 시스템이 포유류 박테리아 및 곤충 세포 배양에 필적하는 재조합 단백질을 생산할 수 있도록 하는 방법에 대해 잘 알게 될 것입니다.