Name: Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 배우세요 식물 세포 간 연결을 위한 플라스모데스마 국소화 신호를 Nicotiana benthamiana에서 식별하는 방법을. 이 기법은 단백질 수송 메커니즘 연구에 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

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공간 부족에 대 한 우리 대부분 검토 기사를 인용 하 고 우리는 그의 원래 일 인용 하지 되었다 우리의 동료에 게 사과. V.C. 실험실에서 작업을 V.C., NIH, NSF, USDA/NIFA, 시인, 그리고 BSF에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 그리고 S.G.L. 실험실 NIH와 S.G.L.에 부서의 식물 병리학과 식물-미생물 생물학에서 자금에 의해 지원 됩니다.

1. 식물 재료
<ol><li>식물의 선택</li>
	<li>사용 하 여 관심, 즉, 하나는 내 인 성 단백질을 위한이 단백질을 인코딩합니다 또는 바이러스 성 단백질에 대 한 병원 체에 대 한 자연 호스트를 나타내는 단백질에 고유 식물 종. 또한, 선택 된 식물 종의 변이 유전자 변환의 선택한 방법에 순종 해야 합니다. 참고: 정기적으로 Nicotiana benthamiana, TMV에 대 한 좋은 호스트를 나타내고 있는 Agrobacterium 중재 하는 유전자 변형 기술, 즉, agroinfiltration에 의해 효율적으로 변환 됩니다 있는 고용 연구 (3 단계 참조). 명. benthamiana 또한 쉽게 성장 하는 식물과 큰 잎, 쉽게 Agrobacterium으로 주사 되 고 쉽게 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석.</li>
	<li>
식물 성장
	<ol>
<li>명. benthamiana 씨 높은 밀도에서 젖은 토양에서 식물. 20-25 ˚C ~ 75 µmol 광자 m-2의 -1 에서 빛의 아래 16 h와 어둠의 8 h에서 제어 환경 챔버에 그들을 유지. Euphyll의 직경에 0.5 cm를 도달 하면, 신중 하 게 더 큰 냄비에 묘를 전송 하 고 동일한 조건 하에서 동일한 약 실에서 성장을 계속 합니다.</li>
		<li>그들은 4-8-잎 단계 때 큰 잎은 4-6 cm 직경; 4 주 이내에 성장 될 때까지 식물을 유지 이 시점에서 그들은 사용할 수 있습니다 agroinfiltration (3 단계 참조). 참고: 중요 한 것은, 사용 하지 마십시오 식물 꽃이 발달 단계에서 잎 아키텍처는 종종24,25, 때로는 일관성 없는 결과 이끌어 다르기 때문에 시작.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 식 벡터 건설
<ol><li>
식 시스템의 선택
	<ol>
<li>식 시스템, 즉, 벡터 및 벡터 배달 방법을, 공부 하는 식물 종에 관심사의 단백질의 표현에 대 한 가장 적합 한 선택 하십시오. 참고: 때때로, 테스트 단백질/식물 종의 같은 특정 조합 수 있습니다 필요로 특정 벡터와 벡터 최적의 표현과 관심사의 단백질의 기능에 대 한 전달 방법. 그러나 가장 dicotyledonous 식물에 대 한, 표정 벡터와 배달 시스템으로 agroinfiltration 이진 플라스 미드를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단백질 형광 태그
	<ol>
<li>붙일 각 표현한 단백질의 subcellular 배포22, Pd 지역화를 포함 분석에 대 한 태그. 참고: 태그 autofluorescent 단백질, c f P, DsRed2, 등을 사용 합니다. CFP와 테스트 단백질 태그와 무료 DsRed2와 coexpress. C f P 기능 태그와 바이러스 없는 화물 분자. DsRed2 기능 과도 식의 전반적인 효율을 보정 하 고, 셀-자치, 처음 변형된 세포;을 식별 하는 때문에 이 후자의 기능은 잠재적으로 비-셀-자치 테스트 단백질의 셀 움직임을 평가할 때 중요 하다. 또한 세포 자치 이다는 Pd 표시 PDCB1와 함께 coexpression에 대 한 CFP와 DsRed2와 PDCB1 테스트 단백질 태그.</li>
		<li>엄지손가락의 규칙으로 표현 된 단백질의 carboxyl 종착역을 autofluorescent 태그 퓨즈. 그러나, 태그 전체 길이 테스트 단백질 전시 Pd 대상으로 손상 된 경우에 태그 단백질의 아미노 말단에 전송.</li>
		<li>적당 한 공장 식 벡터에 시험 될 단백질의 코딩 시퀀스를 복제. 참고: 형광 태그를 허용 하는 많은 다른 식물 식 벡터 있습니다. 우리 pSAT 플라스 미드26 의 시리즈 또는 그들의 유도체27,28의 직접 제안된 autofluorescent 태그 (2.2.1 단계 참조) 모두 아미노산에서 프레임 시퀀스의 복제에 대 한 적당 한의 일부를 사용 하 여-그리고 carboxyl 터미널 방향입니다.</li>
		<li>각 식 카세트 Agrobacterium 이진 벡터에 전송 합니다. 참고: pSAT 기반 구조는 식물 조직, agroinfiltration에 직접 biolistic 납품을 위한 적합 한 변환 방법 (3 단계 참조), 여기 추천입니다에서는 T-DNA 사이 식 카세트 이진 파일의 테두리 벡터29. 참고: 모든 pSAT 벡터 있도록 설계 되었습니다 pPZP RCS2 multigene 식 이진 벡터26,30 같은 전송 드문 절단 nucleases AscI,-PpoI,-SceI, 난-CeuI를 사용 하 여 단일-단계 복제 하 여 PI PspI와 PI-TliI 26. 연구원 recombinatorial 복제, 활용 하는 것을 선호 예, 분리 lox 사이트31를 사용 하 여 pSAT 벡터 변종26,27고용 수 있습니다.</li>
		<li>Coexpression, 두 식 카세트를 전송 예를 들어, 테스트 단백질-c f P DsRed2 또는 테스트 단백질-CFP 및 PDCB1 DsRed2 (참조 하십시오 단계 2.1), 동일한 pPZP RCS2 이진 벡터. 참고: 또는, 개별 이진 구조를 품고 Agrobacterium 문화 혼합 수 있습니다 함께 명. benthamiana 으로 침투에 대 한 (단계 3.1 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. Agroinfiltration
<ol><li>
EHA105 또는 GV3101 설명된32로 준비 Agrobacterium tumefaciens 스트레인의 유능한 세포의 단계 2.2.5 100 µ L 문화에서 pPZP-RCS2-기반 플라스 미드의 1 µ g을 추가, 30 분 동안 얼음에 품 어, 1 분, 액체 질소에 플래시 동결 및 15 분 동안 28 ° C에 품 어.
	<ol>
<li>다음, 유능한 세포 혼합물에 파운드 매체 (10 g/L tryptone, 5 g/L 효 모 추출 물, 및 10 g/L NaCl)의 1 mL을 추가 1 분에 3000 × g에서 셀 아래로 2 h. 회전 28 ° C에서 품 어, 다시 파운드의 0.2 mL에서 그들을 중지합니다 파운드 한 적절 한 항생제 (예, 100 mg/L spectinomycin와 pPZP-RSC2-기반 벡터26,3050 mg/L 리 팜 피신) 보충에 접시와. 개별 식민지 표시 될 때까지 48 h에 28 ° C에 성장 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>선택 하 고 신선한 파운드 한 접시에 여러 개별 식민지 접시 (단계 3.1 참조), 48 h, 28 ° C에서 성장 하 고 식민지 PCR33 특정 바이너리 구문의 존재를 확인 하 여 분석에 대 한 박테리아의 작은 금액을 취할.</li>
	<li>
성장 (단계 3.1.1 참조) 적절 한 항생제로 보충 파운드 매체의 5 mL에 28 ° C에서 하룻밤 관심의 구조와 각 Agrobacterium 식민지. 3000 × g에서 세포를 원심 및 다시 OD600중단 = 0.5 agroinfiltration 버퍼 (10 m m MgCl2, 10 m m MES (pH 5.6), 150 µ M acetosyringone). 실 온에서 2 h에 품 어.
	<ol>
<li>단백질 coexpression에 대 한 이진 플라스 미드 보다는 단일 multigene 식 플라스 미드의 혼합물을 사용 하는 경우 해당 셀 문화 침투 하기 전에 v/v를 1:1 비율로 섞는다. 다음 2 h 28 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
로드는 inoculum 1 mL 플라스틱 주사기와 완전히 성숙한 명. benthamiana 의 더 낮은 (abaxial) 표 피에 대 한 주사기 (바늘)의 노즐 단풍 누릅니다. Gloved 손가락으로 잎을 adaxial 얼굴34,35만요.
	<ol>
<li>천천히 주입 하 여 침투 매체에서 Agrobacterium을 소개 합니다. 통계적 의미에 대 한 각 식물에 몇 잎에 침투. 참고: Note로 그들은 일관 된 표현 레벨을 양보 하지 오래 된 잎 사용 되지 않습니다.</li>
		<li>모든 잎 원래의접종 1.2 단계에에서 설명 된 대로 관찰까지 침투 공장을 유지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. confocal 현미경 검사 법
<ol><li>블레이드를 사용 하 여 각 잎 정 맥 사이 조각으로 잘라 (에 따라 특정 테스트 단백질의 과도 한 표현의 효율성); 침투 후 24-48 h 각 조직 조각의 크기 조각을 현미경에 사용 되는 커버 유리 (22 m m x 40 m m)에 의해 완전히 덮여 되도록 해야 합니다.</li>
	<li>Abaxial 잎 표면 위로 향하도록 슬라이드 개체에서 잎 조각 장소 잎 조각에 물 한 방울 놓고 커버 글라스와 커버. 각 측에 테이프의 작은 조각 가진 덮개 유리를 고정 하 고</li>
	<li>
레이저 confocal 현미경 검사에서 agroinfiltrated 조직 관찰 하 고 결과 이미지를 기록 합니다.
	<ol>
<li>첫째, 10 X 객관적 렌즈를 사용 하 여 신호, 셀을 식별 하 고 63 x 렌즈를 사용 하 여 더 상세한 관측을 위해.</li>
		<li>C f P, 그리고 543을 자극 하는 아르곤 이온 레이저에서 사용 된 458 nm 파장 nm DsRed2를 자극. 이미지 수집, 즉, 레이저 강도 및 광 전 증폭 관 관 (PMT) 설정, 실험에 대 한 모든 설정을 유지 합니다. 평균, 각 실험 조건에 대 한 100-120 셀을 검사 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 식별의 PLS
<ol><li>Confocal 현미경 (4 단원)를 사용 하 여 테스트 단백질의 지 방화를 진단 합니다. 테스트 거친된 단백질 있다는 특성 주변 punctate 패턴25,36,,3738,39,40,41 colocalizes 있는지 확인 와 Pd 표식 PDCB123입니다. 이 테스트 단백질 대부분 PLS 시퀀스 포함 되어 있음을 나타냅니다.</li>
	<li>확인 테스트 단백질의 PLS 활동의 점진적으로 작은 조각, autofluorescently, (예를 들어, c f P,)으로 그것의 열려있는 독서 구조 (ORF) (은행 승인 번호 BAF93925.1)를 분할 하는 후, 그들 각각의 태그 및 분석의 4 단계에서에서 설명한 대로 subcellular 지 방화입니다. 처음에, 각 세분화 조각에 대 한 100 아미노산 잔류물의 크기는 권장 됩니다.</li>
	<li>더 세분화 PLS 활동 고 아직도 Pd 하 localizes 작은 조각까지 4 단계에에서 설명 된 대로 그들의 subcellular 지 방화를 확인 잘린된 조각, 즉 autofluorescent 태그 화물을 수송 하기에 충분 Pd을 식별 됩니다. 이 조각 PLS 시퀀스를 나타내는 추정 됩니다.</li>
	<li>전체 길이 테스트 단백질에서 상 상속 PLS을 삭제, 즉 autofluorescent 태그를 putative PLS 없이 테스트 단백질의 나머지 부분을 융합 하 고 단계에 설명 된 대로 결과 돌연변이 단백질의 subcellular 지 방화를 결정 4. 못하면 부족 putative PLS이 돌연변이 단백질 Pd를 지역화 하이 확인 된 PLS는 하지만 충분 한 (참조 단계 5.3), 하지만 테스트 단백질의 Pd 수송을 위해 또한 필요 하는 것이 나타납니다.</li>
	<li>Agroinfiltrate 식 은닉 Agrobacterium 문화의 혼합 잎 c f P-태그 PLS 및 무료 DsRed2 (단계 3.3 참조)에 대 한 생성 합니다. 침투 조직 단계 4.3에서 동일한 설정을 사용 하 여 x 10의 렌즈와 confocal 현미경을 사용 하 여 관찰 합니다.</li>
	<li>점수와 점수는 CFP 그 신호에 포함 된 인접 한 셀을 전시 운동 처음 침투 셀, CFP와 DsRed2 신호를 포함 하는 셀. 참고:이 단계는 잠재적인 셀 운동 능력;에 대 한 확인 된 PLS를 검사 이것은 (포함 대부분 식물 바이러스 MPs) Pd를 대상으로 하는 많은 단백질 또한 이웃 세포에 Pd를 통해 이동 하기 때문 에입니다. Agrobacterium 침투에 대 한 사용의 농도 다른 구조의 식 효율성에 각각 따라 다릅니다. Agroinfiltration에 대 한 보장 내용이 인접 한 셀을 떠나 단일 셀의 변화 (i), (ii) 식의 유사한 효율성을 달성 하는 셀 문화 희석을 사용 하 여 있는지 확인 합니다. 예를 들어 우리의 실험은 각각 0.01 및 c f P-태그 PLS 및 무료 DsRed2의 표현 위한 0.005의 OD600 활용합니다.</li>
</ol>6. 키 PLS 잔류물 알라닌 스캔42 를 사용 하 여 식별
<ol><li>표준 PCR 프로토콜을 사용 하 여 설명 된 대로 원하는 돌연변이, 즉, 알라닌, 각 뇌관의 중앙 지역의 주위에 함께 대상 아미노산 잔류물의 대체를 포함 하도록 하는 뇌관의 쌍을 사용 하는 시퀀스를 코딩 PLS 증폭 21. 뇌관 디자인 및 사이트 지시 된 mutagenesis 키트를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 사이트 감독 mutagenesis에 대 한.</li>
	<li>모든 표준 DNA 정제 키트를 사용 하 여 결과 PCR 제품을 정화 하 고 37 ° C는 부모의 제거 하는 DpnI에 그들을 소화 (즉, 비 돌연변이) 갠 및 hemimethylated DNA. (얼음)에 실 온에서 5 분 동안 이것을 식혀. 그리고 혼합물을 대장균 유능한 세포43, 직접 변환 단계 3.2에 설명 된 대로 원하는 돌연변이 구문으로 식민지를 식별 합니다.</li>
	<li>2.2.4 단계에서 설명한 대로 이진 벡터에 돌연변이 구조를 소개 하 고 3 단계에에서 설명 된 대로 agroinfiltration를 수행 5.1 4 단계에 설명 된 대로 Pd 대상으로 평가.</li>
</ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

이 프로토콜은 4 명의 코어 성분: 시퀀스를 필요 하 고 충분 한 Pd, 길이, 점차적으로 줄어드는 조각으로 관심사의 단백질의 체계적인 부문 융합는 테스트 대상에 대 한 식별의 개념 태그와 고분자 화물, 및 Pd 생활에 대상에 대 한 기능 분석 결과 제공 하는 autofluorescent 단백질 조각 공장 테스트 융해 단백질의 과도 식 다음 조직. Note Agrobacterium 중재 과도 식 시간, 즉, 몇 일, 유사한 연구15에서 자주 사용 하는 유전자 변형 식물의 생산에 필요한 개월에 비해 상대적으로 짧은 기간 내에 데이터를 생성 합니다.
Coexpression subcellular 지 방화 마커 관심사의 단백질의 예를 들어, PDCB1 또는 무료 DsRed2, 보통 수행 multigene 표정 벡터에서. 그러나, 단일 벡터에 여러 식 카세트의 전송 기술적으로 문제가 있는 경우에, coexpress...

Plasmodesmata (Pd) 식물 개발 및 녹음 방송 요인에서 mRNA와 작은 RNA 분자에 이르기까지 morphogenesis의 키 레 귤 레이 터의 세포 수송을 위한 도관으로 작동 합니다. 또한,이 고분자 전송 용량 Pd의 활용 그들의 세포 확산에 대 한 대부분의 식물 바이러스에 의해 감염; 시 Pd를 통해 이동, 식물 바이러스 이동 단백질 (MPs), 특히 Pd1,2,3,4,,56 대상 되 나 특수 단백질 진화 , 7. Pd 전송의 분자 경로 대부분 이러한 경로에 수송된 단백질을 대상으로 특정 시퀀스와 밀접 하 게 상호는. 따라서, 이러한 Pd 지역화 신호 (PLSs)의 진단 해당 Pd 전송 통로의 있을 수 있습니다. 이것은 Pd 전송8, 비유 하 여 예를 들어 다른 핵 지 방화 신호 (NLS) 시퀀스9,10에 대 한 특정 될 수 있는 다른 핵 가져오기 경로. 개념적으로, NLSs와 PLSs 비 쪼갤 subcellular 타겟팅은 시퀀스를 필요 하 고 대상에 대 한 충분 한을 나타냅니다. 그러나, NLSs11, 달리 PLSs에 대 한 시퀀스 정보 심각 하 게 제한 됩니다. 특히, 단지 4 개의 단백질 시퀀스 Pd 대상에 관련 된 보고 되었습니다, 내 생 식물 단백질에서 파생 된 그들의 모든. 첫 번째 KN112 -13 의 식물 잎 표 피 안쪽 세포 층에서 이동 하는 녹음 방송 요인-와 그것의 녹 스 homologs14의 homeobox 도메인으로 표시 됩니다. 또한 두 번째 주제15전사 요소, Dof, 세포 매매 (그것)으로 상 상속 PLS를 포함에서입니다. 세 번째 순서 PDLP1 plasmodesmata 거주 유형 1 막 단백질에서 이며 막 횡단 도메인16로 표현 됩니다. 마지막으로, 네 번째 Pd 시퀀스를 대상으로 최근에 알려졌다 glycosylphosphatidylinositol (GPI)에 대 한-고정 된 단백질과 그것 glycosylphosphatidylinositol (GPI) 수정 신호17로 표시 됩니다.
흥미롭게도, 아주 최근까지, 아무 PLSs 바이러스 MPs에 대 한 보고 되었습니다. 이전 연구에서 식물 바이러스 MPs18,19, 하지만 아무 진정한 PLS, 즉, 최소한의 아미노산 시퀀스 필요 하 고 Pd 없는 화물 분자 (대상에 대 한 충분 한 상 상속 PLS 시퀀스의 존재 표시 예., CFP) 바이러스 MP에서 발견 되었습니다. 그러나이 단백질, 담배 모자이크 바이러스 (TMV), MP 중 하나는 Pd에 대 한 지역화 및 전송 되었습니다 시연된20하는 첫번째 이었다.
이 차이 해결 하기 위해 우리는 TMV MP PLS를 식별 하는 실험적인 전략을 개발 했다. 이 전략은 세 가지 개념을 기반으로 합니다. (i) 정의 PLS 최소한의 아미노산 시퀀스를 필요 하 고 Pd21대상 단백질에 대 한 충분 한로. (ii) 때문에 TMV MP Pd를 대상으로 먼저 하 고 다음 이러한 채널22를 통해 translocates, 우리는 이러한 두 활동을 분리 시에 타고 난 PLS, Pd를 대상으로, 대만 그리고 후속 전송 함수를 식별 목적. (iii) 우리는 구조적 또는 기능적 활동을 대상으로 하는 Pd에 대 한 중요 한 아미노산 잔류물에 대 한 확인 된 PLS를 분석. 이 방법을 사용 하 여, 우리에 아미노-타고 난 PLS 역할 TMV MP의 50-아미노 산 성 잔류물 시퀀스 구분 된. 이것은 단백질의 전체 길이 포화 TMV MP 파편의 시리즈를 생산, 그들의 carboxyl-테르미니 CFP와 태그와 뚜렷이 식물 조직에서 그들을 표현 하 여 이루어졌다. Pd 지역화 테스트 조각의 각 Pd 마커 단백질, PDCB1 (Pd callose 의무적인 단백질 1)23로 그들을 coexpressing에 의해 결정 되었다. 여전히 Pd로 하지만 Pd, 통과 하지 않았다 작은 조각 PLS를 표현 하기 위해 고려 되었다. 마지막으로,는 PLS 주요 아미노산 잔류물의 구조 또는 기능에 필요한 확인 하려면 알라닌 스캔 했다.
반면 여기 우리는 TMV MP PLS의 식별을 설명 하 여이 방법을 설명 하기 위해, 그것은 식물 병원 균에 의해 또는 스스로; 식물에 의해 인코딩 여부에 어떤 다른 Pd 대상 단백질에 PLSs를 채택 수 있습니다. 이 때문에 우리의 방법 Pd를 대상으로 그들의 능력에 관해서는 바이러스 MPs의 모든 고유 기능을 고려 하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)</td><td>Zeiss</td><td>LSM5</td><td>유사한 기능을 가진 모든 CLSM이 적합합니다</td></tr>. <tr><td>컨포칼 현미경 이미징에 적합한 Zen 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>2009 버전</td><td>이 소프트웨어는 사용된 CLSM과 호환되어야 합니다.</td></tr><tr><td>Quickchange II 사이트 지시 돌연변이 유발 키트&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>200523</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td></td></tr><tr><td>바늘 없는 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>FisherScientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>리팜피신</td><td>시그마-알드리치</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>암피실린&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>A0166</td><td></td></tr></tbody></table>

plasmodesmal 지역화 시퀀스 planta에 단백질의 식별

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd)는 셀 연결 게이트웨이 통해 크고 작은 분자는 식물 세포 사이 수송으로 작동. 생물 고분자, 그러한 단백질의 셀 전송에 특정 대상 신호를 포함 하는 활성 메커니즘을 통해 대부분 발생 Pd 전송 작은 분자, 이온과 물, 등의 수 동적으로 발생 추정, 반면에 분자를 수송. 식별된 plasmodesmata (Pd) 지역화 신호 (PLSs)의 부족은 심각 하 게 단백질 분류의 이해 제한 경로에 관련 된 식물 셀 고분자 전송 및 통신. 다양 한 식물에서에서 Pd 통해 트래픽을 알려진 내 인 성 및 바이러스 성 단백질 3 PLSs 보고 되었습니다 데이트, 내 생 식물 단백질에서 그들의 모든. 따라서, 그것은 필요 하 고 생활에 직접 Pd 대상에 대 한 충분 한 기능 PLS 시퀀스를 식별 하는 안정적이 고 체계적인 실험 전략을 개발 하는 중요 한 식물 세포. 여기, 우리가 같은 전략 패러다임으로 담배 모자이크 바이러스 (TMV)의 셀 운동 단백질 (MP)를 사용 설명. 이러한 실험을 확인 하 고 첫 번째 특징 식물 바이러스 PLS, PLS 시퀀스 가장 Pd 대상 단백질의 발견에 대 한 적용할 수 있습니다.

충실 하 게 설명된 프로토콜에서 예상 결과 설명 하 고 식별 TMV MP PLS, 대표적인 데이터는 원 외. 에서 적응 21. 그림 1A 먼저 전장 TMV MP (1-268), TMV의 MP PLS (함유 단백질, 1-50의 처음 50 아미노산 잔류물), 표현 하는 주요 구조를 요약 하 고 V4A 파생 상품 검색의 알라닌 CFP (생성으로 융합 단계 2.2, 5.2 및 6에에서 설명 된) 그림 1B 요약 하 고 이러한 태그 단백질의 subcellular 지 방화를 수량화 하는 반면. 그림 1C 설명 특성 주변 punctate Pd 지역화 패턴 coexpressed Pd 마커, PDCB1-DsRed2에 관해서는 TMV MP에 대 한 CFP 위한 TMV MP PLS-CFP 뿐만 관찰 (단계 5.1 참조). 그림 ...

식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.

Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

본 절차의 전반적인 목표는 표적 단백질 내의 원형질연락사 국소화 신호를 식별하는 것입니다. 이 방법은 단백질을 원형질연락사로 유도하는 신호 내의 핵심 요소를 식별함으로써 식물의 세포 간 연결 연구와 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 이는 결과적으로 거대 분자의 세포 간 수송을 용이하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 절차가 신뢰할 수 있으며, 대부분의 원형질연락사 표적 단백질에서 원형질연락사 국소화 신호 서열을 발견하기 위해 쉽게 응용될 수 있다는 점입니다.식물 여과 및 공초점 관찰 준비 단계는 일반적인 인쇄 기반 출판물로는 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 비디오 시연이 매우 중요합니다. Nicotiana benthamiana 씨앗을 젖은 토양에 고밀도로 심으십시오. 성장시키는 동안 20~25 °C의 온도가 유지되고, 매일 16시간 동안 약 75 µmol m⁻² s⁻¹의 광량이 제공되는 제어된 환경 챔버에 보관하십시오.u. fil의 직경이 0.5 cm에 도달하면, 유묘를 더 큰 화분으로 조심스럽게 옮기고 동일한 챔버 내의 동일한 조건에서 계속 성장시킵니다. 4주 이내에 식물이 4~8엽 단계까지 성장할 때까지 유지합니다.이 시점에서 가장 큰 잎의 직경은 4~6 cm가 되어야 합니다. 식별과 분석을 용이하게 하기 위해, 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 발현 시스템을 선택하고 발현된 각 단백질에 형광 표지를 합니다. 설명된 대로 pPZP-RCS2 기반 플라스미드를 준비하여 Agrobacterium tumefaciens 컴피턴트 세포 100 µL 배양액에 1 µg를 첨가합니다.세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 액체 질소에서 세포를 1분 동안 급속 냉동시킵니다. 다음으로, 28°C에서 세포를 15분 동안 가온한 후, 수용성 세포 혼합물에 LB 배지 1 mL를 첨가합니다.LB 배지를 추가한 후, 세포를 28 °C에서 2시간 동안 다시 배양합니다. 그다음, 세포를 3,000 ×g에서 1분 동안 원심 분리합니다. 세포 펠릿을 0.2 mL의 LB 배지에 다시 현탁하고 항생제 선택 LB 한천 배지에 도말합니다.개별 콜로니가 보일 때까지 28 °C에서 48시간 동안 플레이트에서 세포를 배양합니다. 그런 다음, 여러 개의 개별 콜로니를 선택하여 신선한 LB agar 플레이트에 도말하고 28 °C에서 48시간 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 분석을 위해 각 플레이트에서 소량의 박테리아를 채취하고 Colony PCR을 사용하여 관심 있는 특정 바이너리 컨스트럭트의 존재를 확인합니다.관심 컨스트럭트가 포함된 각 아그로박테리움 콜로니를 적절한 항생제가 첨가된 5 mL의 LB 배지에 접종합니다. 세포를 28 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그 다음, 세포를 3,000 ×g에서 원심분리합니다. 펠렛을 아그로인필트레이션 버퍼로 재현탁하여 OD600을 0.5로 맞춥니다.현탁액을 실온에서 2시간 동안 배양한 후, 접종액을 1mL 플라스틱 주사기에 넣습니다. 장갑을 낀 손가락으로 성숙한 N.Benthamiana 잎의 상표면(adaxial face)을 잡고, 주사기 노즐을 잎의 하표피에 밀착시킵니다. 그런 다음, 침투 배지가 포함된 agrobacterium을 천천히 주입합니다.관찰 시점까지 침투시킨 식물을 유지합니다. 침투 24~48시간 후, 칼을 사용하여 잎의 맥 사이를 조각내어 절단합니다. 잎의 뒷면이 위를 향하도록 하여 슬라이드 글라스 위에 잎 조각들을 배치합니다.그 다음, 잎 절편 위에 물 한 방울을 떨어뜨리고 커버글라스로 덮습니다. 커버글라스의 양 옆을 작은 테이프 조각으로 고정합니다. 슬라이드를 레이저 주사 공초점 현미경 아래로 옮기고, 10X 대물렌즈를 사용하여 신호가 가장 좋은 세포를 찾습니다.그런 다음, 더 상세한 관찰을 위해 63X 대물렌즈를 사용하여 이미지를 기록합니다. 또한, 발현된 형광 단백질을 여기시키기 위해 적절한 형광 필터를 사용하십시오. 실험 간의 일관성을 유지하기 위해 이미지 획득에 사용된 모든 설정을 유지하십시오.각 실험 조건당 평균 100~120개의 세포를 관찰하십시오. 공초점 현미경 이미지를 사용하여 테스트 단백질의 국소화를 진단하십시오. 이 이미지들은 화물 분자인 CFP가 융합된 전장 TMV 이동 단백질과 CFP가 융합된 확인된 원형질연락관 국소화 신호, 그리고 DsRed가 융합되어 함께 발현된 원형질연락관 국소화 단백질 PDCB1에서 관찰되는 특징적인 주변부 점상 원형질연락관 국소화 패턴을 보여줍니다.대조군 조건에서 CFP와 융합된 전장 TMV 이동 단백질의 원형질연락사 타겟팅과 CFP와 융합된 TMV 이동 단백질 내 국소화 신호의 위치는 CFP의 세포 내 국소화 및 마커 DsRed2의 핵-세포질 국소화와 함께 여기와 같이 나타납니다. 네 번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 돌연변이되면, 전장 TMV 이동 단백질과 TMV 이동 단백질에서 확인된 국소화 신호 모두의 원형질연락사 타겟팅이 소실됩니다. 이는 해당 잔기가 원형질연락사 국소화 신호의 구조 또는 기능에 중요하다는 것을 나타냅니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 50시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 식물이 매우 건강한 상태여야 하며, 잎의 발달 단계가 적절해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면 원형질연락사(plasmodesmata) 국소화 단백질 신호를 식별하는 방법뿐만 아니라, 식물 단백질의 다른 특정 신호들을 식별하는 방법에 대해서도 충분히 이해하게 될 것입니다.

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

이 문서에서는 열대 응답 중 plasmodesmal 투과성 때문에 옥신 기울기를 제어하는​​ 유전자를 선별하기위한 방법을 설명합니다. 이것은 배축 트로픽 반응의 정도의 측정을 포함   애기 장대와 8-hydroxypyrene-1,3,6- trisulfonic 산 (HPTS)로드 그리고 마지막으로 callose 수준의 평가에 의해 plasmodesmal 투과성을 체크.

전략은 트로픽 응답에 Callose 매개 Plasmodesmal 게이팅의 역할을 확인하려면

우리는 라이브 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘을 연구를 많은 양의 콩 protoplasts의 준비를 위한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발.

콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 장기와 조직의 최소한의 처리로 개발 프로그램을 해부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표적화된 세포로부터 고품질의 RNA를 산출합니다. qRT-PCR 또는 RNA-seq와 같은 다운스트림 분석 도구는 조직 및 세포 유형별 발현 프로파일을 밝힙습니다.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

이 프로토콜은 바이러스-플라스모데스마타 상호 작용 또는 플라스모데스마 수송 중 플라스모데스마타를 표적으로 하는 단백질의 컨포칼 현미경 기반 분석을 위한 최적의 플라스모데스마 마커 선택에 대해 설명합니다.

Nicotiana benthamiana에서 Plasmodesmata에 대한 단백질 분류의 컨포칼 현미경 분석

배우세요 식물 세포 간 연결을 위한 플라스모데스마 국소화 신호를 Nicotiana benthamiana에서 식별하는 방법을. 이 기법은 단백질 수송 메커니즘 연구에 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

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