Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

이 절차의 전반적인 목표는 표적 단백질에서 원형질세포 국소화 신호를 확인하는 것입니다. 이 방법은 단백질을 원형질세포(plasmodesmata)로 유도하는 신호에서 비판적 사고를 식별함으로써 식물의 세포 간 연결을 연구하는 데 있어 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 차례로 큰 분자의 세포 간 수송을 촉진합니다. 이 기술의 주요 장점은 절차가 신뢰할 수 있고 대부분의 플라스모데마타 표적 단백질에서 플라스모데마타 국소화 신호 염기서열을 발견하는 데 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다.

이 방법에 대한 비디오 시연은 심기, 여과 및 컨포칼 관찰 단계 준비는 일반적인 인쇄 기반 출판물로는 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. Nicotiana benthamiana 씨앗을 젖은 토양과 고밀도로 심습니다. 자라는 동안 섭씨 20-25도의 통제된 환경 챔버에 보관하고 하루에 16시간 미만의 광량을 유지하며, 여기에는 초당 제곱미터당 약 75마이크로몰의 광자가 포함되어 있습니다.

u. fil의 직경이 50cm에 도달하면 묘목을 더 큰 화분으로 조심스럽게 옮기고 동일한 조건에서 같은 챔버에서 성장을 계속하십시오. 4주 이내에 4-8개의 잎 단계로 자랄 때까지 식물을 유지하십시오.

이 시점에서 가장 큰 잎은 지름이 4-6cm가 되어야 합니다. 쉬운 식별 및 분석을 위해 발현 시스템을 선택하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 발현 단백질을 형광 태그합니다. 설명된 대로 pPZP-RCS2 기반 플라스미드를 준비하고 그 중 1마이크로그램을 Agrobacterium tumefaciens의 수용 세포 100마이크로리터 배양액에 첨가합니다.

세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 액체 질소에서 1분 동안 급속 동결합니다. 다음으로, 세포를 섭씨 28도에서 15분 동안 가열한 다음 유능한 세포 혼합물에 1ml의 LB 배지를 첨가합니다.

LB 배지를 추가한 후 셀을 섭씨 28도에서 2시간 동안 다시 놓습니다. 다음으로, 1분 동안 3, 000배 G로 셀을 스핀다운합니다. 세포 펠릿을 0.2ml의 LB 배지에 재현탁시키고 항생제 선택적 LB 한천 플레이트에 플레이트합니다.

개별 군체가 보일 때까지 섭씨 28도에서 48시간 동안 플레이트의 세포를 성장시킵니다. 그런 다음 여러 개의 개별 콜로니를 골라 새로운 LB 한천 플레이트에 플레이트하고 섭씨 28도에서 48시간 동안 세포를 성장시킵니다. 다음으로, 분석을 위해 각 플레이트에서 소량의 박테리아를 채취하고 Colony PCR을 사용하여 관심 있는 특정 이진 구조의 존재를 확인합니다.

적절한 항생제가 보충된 5ml의 LB 배지에 관심 구조가 있는 각 아그로박테리움 콜로니를 추가합니다. 섭씨 28도에서 밤새 세포를 성장시킵니다. 다음, 3, 000배 G.Resuspend에 세포를 agroinfiltration 완충액에 있는 0.5의 OD600에 펠릿을 원심 분리하십시오.

실온에서 2시간 동안 현탁액을 배양한 다음 접종물을 1ml 플라스틱 주사기에 넣습니다. 완전히 성숙한 N.Benthamiana 잎을 장갑을 낀 손가락으로 인접면에 대고 주사기의 노즐을 잎의 아래쪽 표피에 대고 누릅니다. 그런 다음 배지를 주입하여 침투 배지에 아그로박테리움을 천천히 도입합니다.

침투한 식물이 관찰될 때까지 유지하십시오. 칼날을 사용하여 침투 후 24-48시간 후에 각 잎을 정맥 사이의 조각으로 자릅니다. 나뭇잎 조각을 아축성 잎 표면이 위를 향하도록 하여 개체 슬라이드에 놓습니다.

그런 다음 잎 조각에 물 한 방울을 떨어뜨리고 커버 유리로 덮습니다. 양쪽에 작은 테이프 조각으로 커버 유리를 고정합니다. 슬라이드를 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 아래로 옮기고 10X 주관적 렌즈를 사용하여 최상의 신호를 가진 세포를 식별합니다.

그런 다음 63X 주관적 렌즈를 사용하여 이미지를 기록하여 보다 자세한 관찰을 할 수 있습니다. 또한, 발현된 형광 단백질을 여기시키기 위해 적절한 형광을 사용합니다. 실험 간의 일관성을 유지하기 위해 이미지 획득에 사용되는 모든 설정을 유지합니다.

평균적으로 각 실험 조건에 대해 100-120개의 세포를 검사합니다. 컨포칼 현미경 이미지를 사용하여 테스트된 단백질의 국소화를 진단합니다. 이러한 이미지는 화물 분자 CFP에 융합된 전장 TMV 운동 단백질, CFP에 융합된 식별된 플라스모데마타 국소화 신호, DsRed에 융합된 공동 발현 플라스모데마타 국소화 단백질인 PDCB1에서 관찰된 특징적인 말초 반점 플라스모데마타 국소화 패턴을 보여줍니다.

대조군 조건하에서, CFP에 융합된 전장 TMV 운동 단백질의 플라스모데마타 표적화 및 CFP에 융합된 TMV 운동 단백질의 국소화 신호는 CFP의 세포 내 국소화 및 마커 DsRed2의 핵세포질 국소화와 함께 여기에 나타난 바와 같이 나타납니다. 네 번째 아미노산인 발린(valine)이 알라닌으로 돌연변이되면, 전장 TMV 운동 단백질과 TMV 운동 단백질에서 확인된 국소화 신호에 의한 플라스모데마타(plasmodesmata)는 소실됩니다. 이는 이 잔류물이 원형질세포의 국소화 신호 구조 또는 기능에 중요하다는 것을 나타냅니다.

이 기술은 한 번 마스터하면 제대로 수행하면 50시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 식물이 매우 건강한 상태에 있고 식물이 올바른 잎 단계에 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 플라스모데마타 국소화 단백질 신호를 식별하는 방법뿐만 아니라 식물 단백질에서 다른 특정 신호를 식별하는 방법도 잘 이해하게 될 것입니다.