Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

본 절차의 전반적인 목표는 표적 단백질 내의 원형질연락사 국소화 신호를 식별하는 것입니다. 이 방법은 단백질을 원형질연락사로 유도하는 신호 내의 핵심 요소를 식별함으로써 식물의 세포 간 연결 연구와 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 이는 결과적으로 거대 분자의 세포 간 수송을 용이하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 절차가 신뢰할 수 있으며, 대부분의 원형질연락사 표적 단백질에서 원형질연락사 국소화 신호 서열을 발견하기 위해 쉽게 응용될 수 있다는 점입니다.

식물 여과 및 공초점 관찰 준비 단계는 일반적인 인쇄 기반 출판물로는 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 비디오 시연이 매우 중요합니다. Nicotiana benthamiana 씨앗을 젖은 토양에 고밀도로 심으십시오. 성장시키는 동안 20~25 °C의 온도가 유지되고, 매일 16시간 동안 약 75 µmol m⁻² s⁻¹의 광량이 제공되는 제어된 환경 챔버에 보관하십시오.

u. fil의 직경이 0.5 cm에 도달하면, 유묘를 더 큰 화분으로 조심스럽게 옮기고 동일한 챔버 내의 동일한 조건에서 계속 성장시킵니다. 4주 이내에 식물이 4~8엽 단계까지 성장할 때까지 유지합니다.

이 시점에서 가장 큰 잎의 직경은 4~6 cm가 되어야 합니다. 식별과 분석을 용이하게 하기 위해, 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 발현 시스템을 선택하고 발현된 각 단백질에 형광 표지를 합니다. 설명된 대로 pPZP-RCS2 기반 플라스미드를 준비하여 Agrobacterium tumefaciens 컴피턴트 세포 100 µL 배양액에 1 µg를 첨가합니다.

세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 액체 질소에서 세포를 1분 동안 급속 냉동시킵니다. 다음으로, 28°C에서 세포를 15분 동안 가온한 후, 수용성 세포 혼합물에 LB 배지 1 mL를 첨가합니다.

LB 배지를 추가한 후, 세포를 28 °C에서 2시간 동안 다시 배양합니다. 그다음, 세포를 3,000 ×g에서 1분 동안 원심 분리합니다. 세포 펠릿을 0.2 mL의 LB 배지에 다시 현탁하고 항생제 선택 LB 한천 배지에 도말합니다.

개별 콜로니가 보일 때까지 28 °C에서 48시간 동안 플레이트에서 세포를 배양합니다. 그런 다음, 여러 개의 개별 콜로니를 선택하여 신선한 LB agar 플레이트에 도말하고 28 °C에서 48시간 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 분석을 위해 각 플레이트에서 소량의 박테리아를 채취하고 Colony PCR을 사용하여 관심 있는 특정 바이너리 컨스트럭트의 존재를 확인합니다.

관심 컨스트럭트가 포함된 각 아그로박테리움 콜로니를 적절한 항생제가 첨가된 5 mL의 LB 배지에 접종합니다. 세포를 28 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그 다음, 세포를 3,000 ×g에서 원심분리합니다. 펠렛을 아그로인필트레이션 버퍼로 재현탁하여 OD600을 0.5로 맞춥니다.

현탁액을 실온에서 2시간 동안 배양한 후, 접종액을 1mL 플라스틱 주사기에 넣습니다. 장갑을 낀 손가락으로 성숙한 N.Benthamiana 잎의 상표면(adaxial face)을 잡고, 주사기 노즐을 잎의 하표피에 밀착시킵니다. 그런 다음, 침투 배지가 포함된 agrobacterium을 천천히 주입합니다.

관찰 시점까지 침투시킨 식물을 유지합니다. 침투 24~48시간 후, 칼을 사용하여 잎의 맥 사이를 조각내어 절단합니다. 잎의 뒷면이 위를 향하도록 하여 슬라이드 글라스 위에 잎 조각들을 배치합니다.

그 다음, 잎 절편 위에 물 한 방울을 떨어뜨리고 커버글라스로 덮습니다. 커버글라스의 양 옆을 작은 테이프 조각으로 고정합니다. 슬라이드를 레이저 주사 공초점 현미경 아래로 옮기고, 10X 대물렌즈를 사용하여 신호가 가장 좋은 세포를 찾습니다.

그런 다음, 더 상세한 관찰을 위해 63X 대물렌즈를 사용하여 이미지를 기록합니다. 또한, 발현된 형광 단백질을 여기시키기 위해 적절한 형광 필터를 사용하십시오. 실험 간의 일관성을 유지하기 위해 이미지 획득에 사용된 모든 설정을 유지하십시오.

각 실험 조건당 평균 100~120개의 세포를 관찰하십시오. 공초점 현미경 이미지를 사용하여 테스트 단백질의 국소화를 진단하십시오. 이 이미지들은 화물 분자인 CFP가 융합된 전장 TMV 이동 단백질과 CFP가 융합된 확인된 원형질연락관 국소화 신호, 그리고 DsRed가 융합되어 함께 발현된 원형질연락관 국소화 단백질 PDCB1에서 관찰되는 특징적인 주변부 점상 원형질연락관 국소화 패턴을 보여줍니다.

대조군 조건에서 CFP와 융합된 전장 TMV 이동 단백질의 원형질연락사 타겟팅과 CFP와 융합된 TMV 이동 단백질 내 국소화 신호의 위치는 CFP의 세포 내 국소화 및 마커 DsRed2의 핵-세포질 국소화와 함께 여기와 같이 나타납니다. 네 번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 돌연변이되면, 전장 TMV 이동 단백질과 TMV 이동 단백질에서 확인된 국소화 신호 모두의 원형질연락사 타겟팅이 소실됩니다. 이는 해당 잔기가 원형질연락사 국소화 신호의 구조 또는 기능에 중요하다는 것을 나타냅니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 50시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 식물이 매우 건강한 상태여야 하며, 잎의 발달 단계가 적절해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면 원형질연락사(plasmodesmata) 국소화 단백질 신호를 식별하는 방법뿐만 아니라, 식물 단백질의 다른 특정 신호들을 식별하는 방법에 대해서도 충분히 이해하게 될 것입니다.