BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

이 방법론의 전반적인 목표는 전달 DNA 또는 T-DNA의 손상되지 않은 단일 복제 삽입을 효율적인 방식으로 운반하는 형질전환 식물을 생성하는 것입니다. BIBAC-Gateway 벡터는 안정적인 유전자 발현을 보여주는 관심 염기서열의 온전한 단일 복제 삽입을 수행하는 형질전환 식물을 생성하기 위한 유용한 도구입니다. BIBAC-Gateway 벡터를 사용하면 Gateway 재조합 기술을 사용하여 최소한의 노력으로 관심 염기서열을 삽입할 수 있습니다.

BIBAC-Gateway 벡터를 포함한 모든 BIBAC 유도체는 큰 형질전환 DNA 단편을 식물 게놈으로 전달하는 데 적합합니다. BIBAC-GW 벡터는 옥수수, 쌀 및 토마토와 같은 많은 식물 시스템에 관심 염기서열을 삽입하는 데 사용할 수 있습니다. 두 가지 BIBAC-GW 플라스미드를 사용할 수 있습니다.

BIBAC-RFP-GW 플라스미드는 종피에서 발현되는 DsRed 유전자를 함유하고 있습니다. BIBAC-BAR-GW 플라스미드는 글루포시네이트에 저항성을 제공하는 유전자를 함유하고 있습니다. 두 벡터 모두 박테리아의 선택 마커로 카나마이신 내성 유전자를 포함하고 있습니다.

관심 있는 시퀀스를 이진 벡터에 삽입하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Gateway Entry 및 이진 벡터를 준비합니다. Gateway 반응을 수행하려면 공급업체의 제안에 따라 실온에서 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에서 LR 재조합 반응을 준비합니다. 100-300 나노그램의 supercoiled Entry 클론과 300 나노그램의 BIBAC-Gateway 벡터를 혼합합니다.

TE를 사용하여 혼합물의 부피를 16 마이크로 리터로 조정하십시오. 마지막으로 4 마이크로 리터의 LR Clonase 효소 혼합물을 넣고 볼텍싱으로 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양합니다. 혼합물에 2마이크로리터의 Proteinase K 용액을 첨가하여 LR 반응을 종료합니다.

섭씨 37도에서 10분 동안 혼합하고 배양한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 E.coli로 변형을 진행합니다. 애기장대 식물이 변형될 수 있도록 준비하려면 애기장대 식물이 꽃이 필 때까지 온실이나 기후 조절 성장실에서 자랍니다. 더 많은 보조 볼트가 나오도록 첫 번째 볼트를 클립합니다.

식물은 잘라낸 후 4-6일 후에 담글 준비가 되며, 식물에는 미성숙한 꽃 머리가 많고 수정된 실리크가 많지 않습니다. 꽃을 담그려면 꽃차례를 Agrobacterium 현탁액에 5-10초 동안 담그십시오. 부드럽게 저어주세요.

식물의 지상 부분을 접착 필름으로 싸서 습도를 높게 유지하고 화분을 상자로 덮어 식물을 어둡게 유지합니다. 온실이나 성장실에서 이틀 동안 식물을 배양하십시오. 이틀 후, 상자와 접착 필름을 제거하고 온실이나 성장실에서 식물을 성숙하게 자랍니다.

변형의 효율성을 높이기 위해 동일한 식물을 첫 번째 담글 후 7일 후에 다시 담글 수 있습니다. 다음으로, 변형된 식물이 성숙하고 건조하면 씨앗을 수확합니다. 단일 세트와 동일한 구조로 변형된 식물의 씨앗을 풀링하고 분석합니다.

식물이 BIBAC-RFP-Gateway 플라스미드 유도체로 형질전환된 경우, 형광 현미경을 사용하여 씨앗을 분석하여 형질전환 식물을 식별할 수 있습니다. 종피 털에서 DsRed 발현을 검출하려면 560나노미터의 여기(excitation)와 600 - 650나노미터의 방출에서 시드를 이미지화합니다. 겸자를 사용하여 형광 씨앗을 형광성이 아닌 형광 씨앗과 분리합니다.

BIBAC-BAR-Gateway 플라스미드 유도체로 형질전환된 형질전환 식물을 스크리닝하려면 토양으로 채워진 트레이에 씨앗을 파종합니다. 0.5x MS 배지에 0.1%한천에 씨앗을 현탁시켜 트레이에 씨앗이 고르게 퍼지도록 하고 1밀리리터 피펫을 사용하여 씨앗을 펴 놓습니다. 섭씨 4도에서 최소 2일 동안 씨앗을 부화하여 동시에 발아하도록 씨앗을 자극합니다.

이것은 씨앗을 파종하기 전이나 후에 수행 할 수 있습니다. 씨앗을 파종한 후 2주 및 3주 후에 묘목에 0.5%글루포시네이트-암모늄 용액을 뿌립니다. 1제곱미터당 500밀리리터의 글루포시네이트-암모늄 용액을 사용하십시오.

살아남은 묘목을 화분으로 옮깁니다. PCR로 글루포시네이트-암모늄 저항성 식물을 분석하여 관심 구조체의 존재 여부를 확인합니다. 제한 효소를 사용한 DNA 블로팅(blotting)을 통해 T-DNA 통합의 수와 무결성을 측정합니다.

이 방법을 사용하면 게놈의 동일하거나 다른 유전자 자리에서 단일 및 반복 통합을 식별할 수 있습니다. 일련의 제한 소화를 사용하여 가능한 다양한 통합 패턴을 식별합니다. T-DNA의 중간에서 한 번 절단하는 효소를 선택하면 제한 부위의 상류 및 하류에서 염기서열을 독립적으로 프로브할 수 있습니다.

또한 관심 있는 전체 염기서열을 한 번에 잘라내는 효소 또는 효소 조합을 선택합니다. 시토신 메틸화에 민감하지 않은 제한 효소만 사용하도록 주의하십시오. DNA 블로팅을 수행한 후 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 블롯 분석을 수행합니다.

분석은 사용된 제한 전략에 따라 달라집니다. T-DNA 중간에 하나의 제한 부위가 있는 전략을 사용하여 블롯을 분석할 때 검출된 단편의 수를 계산합니다. 이 전략에서 혼성화된 단편의 수는 T-DNA 통합의 수를 암시합니다.

검출된 단편의 수를 T-DNA의 왼쪽과 오른쪽에 대한 프로브와 비교합니다. 두 프로브에서 서로 다른 수의 혼성화 단편이 검출되면 역 반복에서 여러 T-DNA 통합 또는 불완전하게 통합된 T-DNA가 존재합니다. T-DNA의 탠덤 및 반전 배열을 식별하려면 마커 밴드의 크기를 기반으로 블롯의 혼성화 단편의 크기를 추정하고 추정된 크기를 제한 전략에 따라 계산된 예상 단편 크기와 비교합니다.

관심 형질전환 염기서열이 손상되지 않았는지 검사하려면 관심 염기서열의 말단에 제한 부위가 있는 전략에 따라 준비된 블롯을 분석합니다. 마커 밴드의 크기를 기준으로 블롯의 혼성화 단편의 크기를 추정하고 예상 크기와 비교합니다. 손상되지 않은 삽입은 정의된 길이의 단일 조각을 생성합니다.

예상 길이에서 벗어나면 통합이 불완전함을 나타냅니다. T-DNA 통합의 수와 온전함을 결정하기 위한 DNA 제한 및 블로팅 전략이 표시됩니다. ScaI 제한 사이트는 리포터 염기서열을 바용 프로브를 사용할 때 감지되는 좌측 경계 근위 부분과 eYFP 용 프로브를 사용할 때 감지되는 우측 경계 근위 부분으로 나눕니다.

BglII 및 PciI 제한 부위는 리포터 구조체 외부의 T-DNA 내부에 위치합니다. 이중 분해는 정의된 크기의 단편을 생성하며, 모든 편차는 불완전한 삽입을 나타냅니다. 확인된 혼성화 단편의 수는 T-DNA 삽입의 수를 반영합니다.

ScaI로 절단된 9개의 형질전환 유전자의 게놈 DNA를 포함하는 하나의 블롯을 bar 및 eYFP용 프로브와 혼성화했습니다. 여러 레인은 단일 T-DNA 통합이 있는 형질전환(transgenics)을 나타냅니다. 4번째 레인은 막대가 있는 2개의 프래그먼트와 eYFP가 있는 1개의 프래그먼트를 표시하며, 이는 eYFP 시퀀스의 잘림 또는 오른쪽 테두리 주위의 반전된 반복을 나타냅니다.

레인 6에는 bar 및 eYFP가 있는 두 개의 프래그먼트가 표시됩니다. 하나의 단편은 막대 프로브의 강도가 약합니다. 다른 단편은 강도가 높아 두 개의 T-DNA 삽입을 나타내며 그 중 하나는 잘렸습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 Gateway 재조합을 사용하여 관심 있는 DNA 염기서열을 BIBAC-GW 이진 벡터에 통합하는 방법과 애기장대 변환, 스크리닝 및 T-DNA 통합 횟수 및 무결성 평가를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 형질전환 식물을 생성하고 특성화하는 것은 시간이 많이 걸립니다. BIBAC-Gateway를 binary vector로 사용할 때, 온전한 단일 복제 통합으로 형질전환 유전자를 식별하는 프로세스를 단축할 수 있습니다.

BIBAC 유도체로 생성된 형질전환 유전자 변형의 약 절반은 손상되지 않은 단일 복제 통합을 수행합니다. 일반적으로 개인은 일반적인 이진 벡터를 사용하여 생성된 많은 형질전환 식물이 유전자 침묵을 나타내는 전이유전자 또는 전이유전자의 잘린 사본을 가지고 있다는 것을 깨닫지 못합니다. BIBAC 유도체를 사용하면 생성된 대부분의 형질전환 식물은 거의 유전자 침묵을 보이는 전이유전자의 온전한 단일 통합을 가지고 있습니다.

형질전환(transgenics)을 생성하기 위해 BIBAC-GW를 사용할 때는 BIBAC 유도체의 전체 형질전환 효율이 일반적으로 사용되는 binary 벡터보다 낮기 때문에 충분한 수의 식물 물질을 형질전환시키는 것이 중요합니다. BIBAC-GW의 형질전환 효율은 일반적으로 0.2%에서 0.5% 사이입니다.손상되지 않은 단일 복제 T-DNA 통합을 수행하는 형질전환 식물을 식별한 후 필요한 경우 T-DNA 삽입의 정확한 게놈 위치를 정의하기 위해 추가 분석을 수행할 수 있습니다. 손상되지 않은 단일 복제 통합이 있는 형질전환은 전이유전자의 유사한 발현 수준을 보여줍니다.

이는 게놈에서 T-DNA의 통합 위치가 전이유전자의 발현 수준에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니다.