Name: BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 배우세요 BIBAC-Gateway 벡터를 활용하여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물을 효율적으로 생성하는 방법을. Arabidopsis를 포함한 다양한 식물 계통에 적용 가능한 이 기술은 안정적인 유전자 발현을 보장합니다.

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이 연구는 네덜란드 기술 재단 STW (12385), 네덜란드 조직에 대 한 과학적 연구 (NWO)의 부분 이다 고는 부분적으로 경제 통상 부 (OTP 부여 12385 ms)에 의해 자금이 지원 됩니다.  우리는 pCH20, BIBAC-GW 벡터의 등뼈를 제공 하기 위한 캐롤 M. 해밀턴 (코넬 대학, 미국) 감사 합니다.

<ol><li>Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcone+synthase+cosuppression+phenotypes+in+petunia+flowers%3A+comparison+of+sense+vs.+antisense+constructs+and+single-copy+vs.+complex+T-DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences.</a> Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).</li>
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<li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-dependent+methylation+and+transcriptional+silencing+of+transgenes+in+inverted+T-DNA+repeats%3A+implications+for+posttranscriptional+silencing+of+homologous+host+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li>
<li>Jin, Y., Guo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene-induced+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgene-induced gene silencing in plants.</a> Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).</li>
<li>Oltmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.plantphysiol.org/content/152/3/1158">Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA].</a> Plant Physiol. , (2010).</li>
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<li>Vega, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize+%28Zea+mays%29+with+Cre-lox+site+specific+recombination+cassettes+in+BIBAC+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors.</a> Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).</li>
<li>Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIBAC-GW-based+vectors+for+generating+reporter+lines+for+site-specific+genome+editing+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta.</a> Plasmid. 89, 27-36 (2017).</li>
<li>Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfer+of+intact+high+molecular+weight+DNA+into+plant+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).</li>
<li>Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+tandem+repeats+are+sufficient+for+paramutation-induced+trans-generational+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003773(2013).</li>
<li>Shizuya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+stable+maintenance+of+300-kilobase-pair+fragments+of+human+DNA+in+Escherichia+coli+using+an+F-factor-based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).</li>
<li>Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+new+BAC+and+BIBAC+vectors+that+facilitate+BAC%2FBIBAC+library+construction+and+intact+large+genomic+DNA+insert+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange.</a> Plant Methods. 7, 33(2011).</li>
<li>Woodman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+%28Colony+PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mol Biol.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).</li>
<li>Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+plant+genomic+DNA+for+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.</a> Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349(1991).</li>
<li>Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cetyltrimethyl+ammonium+bromide+%28CTAB%29+DNA+miniprep+for+plant+DNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/default.tpl?cart=1522085010728111106&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=934">Molecular Cloning</a>. , CSH Press. (2012).</li>
<li>Sosa, J. M. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac50056a031?journalCode=ancham">Chromatography with Sephadex Gels.</a> Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).</li>
<li>Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nopaline+synthase%3A+transcript+mapping+and+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence.</a> J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).</li>
<li>Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+BAC+and+BIBAC+libraries+from+sunflower+and+identification+of+linkage+group-specific+clones+by+overgo+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization.</a> Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).</li>
<li>Lee, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+plant-transformation-competent+BIBAC+library+and+genome+sequence+analysis+of+polyploid+Upland+cotton+%28Gossypium+hirsutum+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L).</a> BMC Genomics. 14, 208(2013).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+insert+Thellungiella+halophila+BIBAC+library+for+genomics+and+identification+of+stress+tolerance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes.</a> Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BAC-+and+BIBAC-based+physical+map+of+the+soybean+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome.</a> Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+physical+mapping+from+large-insert+clones+by+fingerprint+analysis+with+capillary+electrophoresis%3A+a+robust+physical+map+of+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum.</a> Nucleic Acids Res. 33 (5), e50(2005).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+physical+mapping+of+polyploids%3A+a+BIBAC+physical+map+of+cultivated+tetraploid+cotton%2C+Gossypium+hirsutum+L%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L.</a> PLoS One. 7 (3), e33644(2012).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+An+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato.</a> Transgenic Res. , (2001).</li>
<li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-Dependent+Methylation+and+Transcriptional+Silencing+of+Transgenes+in+Inverted+T-DNA+Repeats%3A+Implications+for+Posttranscriptional+Silencing+of+Homologous+Host+Genes+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants.</a> Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li>
<li>Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+new+and+established+methods+to+determine+T-DNA+copy+number+and+homozygosity+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants.</a> Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).</li>
<li>Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+PCR+and+Quantitative+PCR+as+Alternative+Methods+to+Southern+Blotting+Analysis+to+Assess+Transgene+Copy+Number+and+Characterize+the+Integration+Site+in+Transgenic+Woody+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Genet%22%5BJournal%5D)">Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants.</a> Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌을 선언합니다.

생성에 중요 한 제 닉은 transgene의 단일, 그대로 통합으로 사용 되는 이진 벡터의 선택입니다. BIBAC 가족 벡터 많은 식물 종23,,2425,26,,2728관심사의 순서를 전달 하기 위해 사용 되었습니다. BIBAC 벡터, BIBAC-GW를 포함 하 여 높은 효율으로 단일 복사 통합 항복: 줄 삽입의 평균 수는 1.5 ~ 2, 3 또는 더 높은 가장 일반적으로 사용 되는 이진 벡터5,9, 에 대 한 비교 29</...

유전자 변형 식물을 생성할 때 일반적으로 목적은 안정적으로 표현 하는 통합된 transgene(s) 것입니다. 이 transgene의 그대로 단일 복사본 통합 하 여 얻을 수 있습니다. 여러 통합은 transgene의 증가 표현 뿐만 아니라 유전자 입을 발생할 수 있습니다. Transgenes의 입을 경우 삽입된 시퀀스 협동 또는 거꾸로 반복1,2,,34에서 배열 된다 확률이 높다. 이진 벡터 Agrobacterium에 셔틀으로 이용 된다-식물 게놈으로 관심의 시퀀스를 제공 하는 변환 실험을 중재. 식물 게놈으로 통합의 수 Agrobacterium tumefaciens5,6. 이진 벡터의 복사본 수에 따라 달라 집니다. 많은 일반적으로 사용 되 이진 벡터는 높은 복사 벡터 및 따라서 높은 평균 transgene 복사본 수를 산출: 애기53.3 4.9 복사본.
BIBAC7또는 T-DNA A. tumefaciens 염색체5에서 시작 하 여 낮은 복사 번호 A. tumefaciens에 있는 이진 벡터를 사용 하 여 T-DNA 통합의 수를 낮출 수 있습니다. 이러한 경우 transgene 통합의 평균 수는 25,8,,910아래입니다. 따른 단일-복사 A. tumefaciens 에 대장균에서 BIBAC 파생 상품 수 유지 및 구문 150 kb11로 제공.
GW 호환 BIBAC 벡터10,12 게이트웨이 복제를 사용 하 여 벡터에 관심사의 유전자의 도입에 쉽게 수 있습니다. 게이트웨이 기술 사용 하 여 복제 프로시저를 단순화 하지만 또한 큰 낮은 복사 번호 벡터13,14, 낮은 DNA 수율 등 독특한 제한의 제한 된 선택과 관련 된 일반적인 문제를 극복 7,11복제에 사용할 수 있는 사이트. PBIBAC-GW 파생 상품 Glufosinate 염화 (pBIBAC-바-GW) 어느 저항 또는 DsRed 형광 씨 외 투 (pBIBAC-RFP-GW) 식물 (그림 1)10,12선택에 사용할 수 있습니다. 두 벡터에 대 한 대 저항 유전자는 박테리아에서 선택 마커로 사용 됩니다.
PBIBAC-GW 벡터 결합: (1) 쉬운 디자인 및 유전자 조작 대장균및 (2) 그대로 단일 복사 통합에서 planta에 높은 효율에. 들고 단일 유전자 변형 식물의 약 절반으로 애기 에 평균 1.7 통합에 pBIBAC GW 벡터 수확량은 통합 T DNA10.
안정적인 표현의 transgenes 대부분 제 닉 생성에 대 한 요구 사항입니다. 안정적인 transgene 식 그대로, 단일 복사 통합 하 여 얻을 수 있습니다. 그러나 유전자 변형 식물 그대로, 단일 복사 통합 운반 작업은,, 훨씬 더 중요 한 경우 예를 들어 목표 mutagenesis, 재결합, 또는 복구, 등 이러한 의존 chromatin 기반 프로세스의 효율성을 연구 하는 것입니다 genomic 위치 및 삽입 사이트에서 chromatin 구조에 처리 합니다. 우리의 관심 지역의 게놈 문맥에 의존 oligonucleotide 감독 mutagenesis (ODM)의 공부 mutagenesis 취재 원 유전자의 손상, 단일 복사 통합 기자 라인의 집합 생성된 (그림 2)10이었다. 이 일련의 줄을 사용 하 여, 보였다 ODM 효율 되 고 오히려 유사한 transgene 식 수준에도 불구 하 고 다른 genomic 위치의 통합 유전자 변형 loci 사이 변화 한다.

<table><tbody><tr><td>카나마이신 황산염 일수화물</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신 황산염</td><td>Duchefa</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>리팜피신</td><td>Duchefa</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린 염산염</td><td>Sigma</td><td>T-3383</td><td></td></tr><tr><td>DB3.1 유능 세포</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11782-018</td><td>Invitrogen에 의한 One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) 또는 다른 ccdB 저항성 E. coli 균주를 대신 사용할 수 있습니다&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>DH10B 유능한 세포</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>18290-015</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR 클로나제 효소 혼합물&nbsp;</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>tri-sodium citrate dihydrate</td><td>Merck</td><td>106432</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium dihydrate</td><td>Duchefa</td><td>E0511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>박토 트립톤</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Honeywell Fluka</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-포도당 일수화물</td><td>Merck</td><td>108346</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳, 0.1cm 간격</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1652089</tr><tr><td>Electroporator Gene Pulser</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td><td>Calbiochem</td><td>442613</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Maltose monohydrate 90%</td><td>Acros Organics</td><td>32991</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138454</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog 매체</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>글루포시네이트-암모늄 (Basta)</td><td>바이엘</td><td>79391781</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>바이오 라드</td><td>1610433</td><td></td></tr><tr><td>전기 영동 시스템</td><td>바이오 라드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화</td> <td>나트륨Merck</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Merck</td><td>100316</td><td></td></tr><tr><td>블로팅 나일론 멤브레인 Hybond N+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15358</td><td>또는 GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM Chr 압지</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-931</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>아세틸화 BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 Coarse</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17004401</td><td>또는 Sephadex G-50 Medium (17004301)</td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate&nbsp;</td><td>US Biological</td><td>S5010</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소나트륨 일수화물</td><td>Merck</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Storage 형광체 스크린 및 케이스</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>형광체 이미저</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon FLA 7000</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>Stratalinker 1800</td><td></td></tr><tr><td>집착 필름 (Saran wrap)</td><td>Omnilabo</td><td>1090681</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Merck</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>DNA 마커 ' 블라우'; DNA 사다리.</td><td>MRC 네덜란드</td><td>MCT8070</td><td></td></tr><tr><td>DNA 마커 ' 루드'; DNA 사다리</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8080</td><td></td></tr><tr><td>Hexanucleotide Mix</td><td>Roche</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>Large-Construct Kit</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>열 밀봉 가능한 폴리에틸렌 튜빙, 투명</td><td>다양한 공급 업체</td><td></td><td>튜빙의 너비는 블로팅 멤브레인의 너비보다 넓어야합니다</td></tr>. 열 <tr><td>밀봉 멤브레인</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터 디스크</td><td>Merck</td><td>VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Merck</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 메쉬</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2519</td><td></td></tr></tbody></table>

bibac-gw 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

유전자 변형 식물을 생성할 때 일반적으로 목표는 transgene의 안정적인 식 것입니다. 이 transgene의 단일, 그대로 통합 다중 복사 통합 유전자 입을 대상이 종종 필요 합니다. 다른 pBIBAC 파생 상품 같은 세균성 인공적인 염색체 (pBIBAC-GW)에 따라 게이트웨이 호환 이진 벡터 고효율 단일 카피 transgenes의 삽입을 수 있습니다. 원래 pBIBAC에 개선으로 게이트웨이 카세트는 되었습니다 복제 pBIBAC GW에 관심의 시퀀스 지금 통합 될 수 있다 쉽게 벡터 전송 DNA (T-DNA)에 게이트웨이 복제 하 여 그렇게. 일반적으로, pBIBAC GW와 변환 결과 0.2-0.5 효율 %, 그것에 의하여는 제 닉의 T-DNA의 본래 단일 복사 통합 수행. PBIBAC-GW 벡터 Glufosinate 염화에 저항 또는 선택 식물, 씨 외 투에서 DsRed 형광와 저항 대에 박테리아에서 선택 항목으로 사용할 수 있습니다. 여기, 프로토콜의 시리즈 pBIBAC GW를 사용 하 여 유전자 변형 식물 생성의 과정을 통해 독자를 안내 하는 표시 됩니다: 진상을 공장 로 변환 하는 선택의 pBIBAC GW 벡터에 관심의 시퀀스에서 시작 Agrobacterium, 제 닉, 그리고 테스트 DNA 럽을 사용 하 여 삽입의 intactness 및 복사 번호에 대 한 식물의 선택. 주의는 DNA 더 럽 히 전략을 인식 하는 단일 및 다중 loci에서 단일 및 다중 복사 통합 주어 집니다.

BIBAC-GW 시스템을 사용 하 여, 식물에서 ODM을 공부 기자 구문이 생성된10했다. 구문을은 게이트웨이 항목 벡터 pENTR gm12 설계 되었고에 pBIBAC-바-GW (그림 1) 게이트웨이 LR 재결합 반응을 사용 하 여 삽입.
애기는 pDM19, BIBAC-바-GW 플라스 변환 정지 codon 위치 120 eYFP 독서 프레임에 운반 한 mTurquoise eYFP 기자와 함께 변형 되었다 (mTurquoise2-eYFP * 40) (그림 2)10. 총에서 126 애기 식물은 변형된 (냄비, 냄비 14 ...

PBIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 생성 유전자 변형 식물을 그대로 단일 복사본 삽입, 쉬운 과정을 만든다. 여기, 프로토콜의 시리즈는 유전자 변형 애기 식물을 생성 하 고 intactness에 대 한 식물을 테스트 과정을 통해 독자를 안내 하 고 삽입의 수를 복사 하 여.

BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

이 방법론의 전반적인 목표는 전달 DNA 또는 T-DNA의 손상되지 않은 단일 복제 삽입을 효율적인 방식으로 운반하는 형질전환 식물을 생성하는 것입니다. BIBAC-Gateway 벡터는 안정적인 유전자 발현을 보여주는 관심 염기서열의 온전한 단일 복제 삽입을 수행하는 형질전환 식물을 생성하기 위한 유용한 도구입니다. BIBAC-Gateway 벡터를 사용하면 Gateway 재조합 기술을 사용하여 최소한의 노력으로 관심 염기서열을 삽입할 수 있습니다.BIBAC-Gateway 벡터를 포함한 모든 BIBAC 유도체는 큰 형질전환 DNA 단편을 식물 게놈으로 전달하는 데 적합합니다. BIBAC-GW 벡터는 옥수수, 쌀 및 토마토와 같은 많은 식물 시스템에 관심 염기서열을 삽입하는 데 사용할 수 있습니다. 두 가지 BIBAC-GW 플라스미드를 사용할 수 있습니다.BIBAC-RFP-GW 플라스미드는 종피에서 발현되는 DsRed 유전자를 함유하고 있습니다. BIBAC-BAR-GW 플라스미드는 글루포시네이트에 저항성을 제공하는 유전자를 함유하고 있습니다. 두 벡터 모두 박테리아의 선택 마커로 카나마이신 내성 유전자를 포함하고 있습니다.관심 있는 시퀀스를 이진 벡터에 삽입하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Gateway Entry 및 이진 벡터를 준비합니다. Gateway 반응을 수행하려면 공급업체의 제안에 따라 실온에서 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에서 LR 재조합 반응을 준비합니다. 100-300 나노그램의 supercoiled Entry 클론과 300 나노그램의 BIBAC-Gateway 벡터를 혼합합니다.TE를 사용하여 혼합물의 부피를 16 마이크로 리터로 조정하십시오. 마지막으로 4 마이크로 리터의 LR Clonase 효소 혼합물을 넣고 볼텍싱으로 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양합니다. 혼합물에 2마이크로리터의 Proteinase K 용액을 첨가하여 LR 반응을 종료합니다.섭씨 37도에서 10분 동안 혼합하고 배양한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 E.coli로 변형을 진행합니다. 애기장대 식물이 변형될 수 있도록 준비하려면 애기장대 식물이 꽃이 필 때까지 온실이나 기후 조절 성장실에서 자랍니다. 더 많은 보조 볼트가 나오도록 첫 번째 볼트를 클립합니다.식물은 잘라낸 후 4-6일 후에 담글 준비가 되며, 식물에는 미성숙한 꽃 머리가 많고 수정된 실리크가 많지 않습니다. 꽃을 담그려면 꽃

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Genetics

유전학

이 비디오에서는 Agrobacterium 매개 이진 박테리아 인공 염색체 기반 유전자 변형을 통해 안정적인 전이유전자를 발현하는 형질전환 애기장대 식물의 생성을 보여줍니다.

애기장대 식물의 이진 박테리아 인공 염색체 벡터 기반 유전자 변환: 단일 사본 삽입으로 형질전환 식물을 생성하는 기술

농약침과 PVX 농병은 식물에 있는 유전자의 일시적인 자궁 발현을 위한 일상적인 기능적인 분석입니다. 이 방법은 효과적인 전략 (급속한 저항 및 비열유전자 발견)에 있는 능률적인 연구및 분자 식물 병리학에 있는 현대 연구에 결정적입니다. 그들은 공장에서 강력한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족합니다.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

이 작품은 선택적으로 바이오 래드 유전자 총을 사용하여 정량, 식물의 세포 내 소기관을 대상으로하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

유전자 표적화 방법론을 사용하여 knockout, knock-in 및 tagged 대립유전자가 있는 형질전환 마우스를 생성할 수 있습니다.  여기에서는 E. coli에서 재조합하는 개선된 방법, 즉 'subcloning plus insertion'이라고 하는 재조합 방법을 설명하며, 이는 맞춤형 유전자 표적화 벡터를 빠르게 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법

여기, 우리는 꽃 딥 통해 아그로 박테 리움을 매개 성 식물 형질 전환을 사용하여 아마 변환하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 수행 간단하고 저렴하면서도 아마 변환에 대한 현재 가능한 방법보다 더 높은 변환 속도를 산출한다.

아마의 꽃 - 딥 변환 ( LINUM usitatissimum) 높은 변환 속도와 형질 전환 자손을 생성합니다

DNA 조립체를 사용하여, 여러 CRISPR 벡터가 CRISPR 다수의 구성을 하나 복제 반응에 병렬로 구성 될 수있는 간단한 작업 벡터. 토마토 털이 뿌리는 CRISPR 경로를 확인하고 돌연변이 물질을 생성 할 수있는 훌륭한 모델 시스템입니다.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

여기, 우리가 첫 번째 코딩 exon 유전자의 전사 드라이버 대체 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 방법 제시. CRISPR/Cas9-기반 방법 대체 유전자의 생 규칙에서 transactivator 시퀀스를 장소 따라서 유전자 특정 spatiotemporal 패턴에 독점적으로 transctivator 식을 촉진 한다.

게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.

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여기, 우리 세대를 설명 하 고 유전자 변형 애기 thaliana 의 집합의 응용 프로그램 세 가지 주요 meristems, 싹 정점 분열 조직, 뿌리 정점 분열 조직에는 레이어의 활성화 유도할 수 있는, 조직 관련 식 라인.

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

가을 군벌레, 스포드옵테라 검거르다에서성공적인 생식선 변환은, 활동적인 돼지박 트랜스포사제의 mRNA를 사용하여 달성되었다.

가을 육군벌레, 스포드옵테라 검소한에서 활동적인 피기박 트랜스포사스 중재 된 세균라인 변환

여기에서는 안정적인 zpc:cas9 knock-in line과 sgRNA 발현 카세트의 Tol2 매개 전달을 결합하는 모계 돌연변이를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성

배우세요 BIBAC-Gateway 벡터를 활용하여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물을 효율적으로 생성하는 방법을. Arabidopsis를 포함한 다양한 식물 계통에 적용 가능한 이 기술은 안정적인 유전자 발현을 보장합니다.

BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

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