Name: 골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 학습하세요 GM-CSF 유도 골수성 세포 분리법을 고속 세포 분류를 사용하여 수행하는 방법을. 소수의 마커로 저발현 세포를 대량 분리하여 발달 면역학 연구와 골수 이식 치료에 활용할 수 있습니다.

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우리는 앨리슨 교회 새에 어 번 대학교 학교의 수의학 흐름 Cytometry 시설, 오 번 대학에서 분자 생물학 프로그램 및 휴대 하는 NIH에서 EHS R15 R15 AI107773 하 고 자금에 대 한 기술 지원에 대 한 감사 여름 연구 자금 PBR을에 대 한.

모든 동물 작업 치료와 국립 보건원의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 설명 된 권장 사항에 따라 어 번 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 골 수 컬렉션에 대 한 준비
<ol><li>로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 10% 태아 종 아리 혈 청, 2mm 글루타민과 0.22 μ m 진공 필터 플라스 크 단위의 상단에 50 µ M 2-mercaptoethanol 보충의 솔루션을 추가 하 여 250 mL 완전 한 미디어를 준비 하 고 진공을 적용. 참고: 완전 한 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 2 개월까지.</li>
	<li>150 mL 살 균 H2O 500 mL 플라스 크에 100% 에탄올의 350 mL를 혼합 하 여 70% 에탄올 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>4 ° c 설정된 원심 분리기</li>
	<li>포 셉, 메스, 및 70% 에탄올에가 위를 소독.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 세 60 mm 페 트리 접시에 완전 한 미디어의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 튜브를 완전 한 미디어의 30 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>2입니다. Murine 골 수 세포 수집
<ol><li>안락사에 대 한 2013 미국 수의 의학 협회 (AVMA) 지침에 의해 설정 된 규칙에 따라 CO2 마 취 법에 의해 C57BL/6 마우스를 안락사.</li>
	<li>
제거 하 고 뒷 다리를 제거.
	<ol>
<li>75% 에탄올, 뒷 다리와 몸통을 포화 곡선된 조직이 위 고관절 주위 피부를 통해 얕은 상처를 확인. 근육을 드러내는 발목 쪽으로 엉덩이에서 피부를 당겨 단단히 집게를 사용 하 여. 가 위를 사용 하 여 제거 피부 플랩.</li>
		<li>전체 뒷 다리 대 퇴 골/고관절 보다 뼈를 통해 서 절단 하 여 제거 합니다. 참고: 살 균 그 지역을, 뿐만 아니라 에탄올 제공 하 고 깨끗 한 상처에 도움이 되며 샘플을 오염에서 머리카락을 방지.</li>
		<li>다리 골 수확에 대 한 새 위치로 전송 됩니다, 경우 완전 한 미디어에 다리 잠수함.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 biosafety 내각에서 working 전송 다리 접시는 이전 준비 중.</li>
	<li>그냥 잘라가 위를 사용 하 여 발목 아래 신중 하 게 최대한 근육과 탄성 결합 조직 제거. 두 번째 준비 페 트리 접시를 청소 뼈를 전송 합니다. 참고: 모든 근육을 제거 하지 않아도 됩니다, 하지만 너무 많은 나머지 조직이 어려울 수 있습니다 그것은 골 수 밖으로 플러시.</li>
	<li>
대 퇴 골, 무릎 및 경골을 구분 합니다.
	<ol>
<li>집게를 사용 하 여 무릎에서 다리를 개최 하 고 골 수를 찾습니다. 참고: 골 캐비티 내부에 뼈는 대 퇴 골 및 경골의 끝으로 상단에 희미 한 붉은 선으로 표시 됩니다.<ol>
<li>가 위를 사용 하 여 다음과 같이 3 개의 상처를 확인 합니다.<ol>
<li>바로 골 수 끝에 나타나는 위에 경골을 잘라.</li>
				<li>무릎 관절 아래 그냥 잘라.</li>
				<li>무릎 관절 위에 그냥 잘라.</li>
				<li>고관절 대 퇴 골에 여전히 연결 되어, 바로 고관절 아래 컷.</li>
			</ol>
</li>
			<li>페 트리 접시에 3 개의 파편을 반환 하 고 다른 다리에이 과정을 반복.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
대 퇴 골과 경골에서 골을 플러시.
	<ol>
<li>23 G 바늘으로 50 mL 원뿔 튜브, 및 모자에서 완전 한 미디어 10 mL 주사기를 채우십시오.</li>
		<li>세 번째 준비 페 트리 접시 위에 집게와 뼈를 잡고, 뼈 운하에 바늘을 삽입 하 고, (또는 여러 클러스터는 그대로 "플러그"로 나타날 수 있습니다) 세포 밖으로 홍 조를 통해 미디어를 밀어. 뼈를 통해 서 더 많은 색깔을 볼 수 있다 때까지 반복 합니다. 필요에 따라 미디어와 주사기를 다시 채우십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
epiphyses 호감.
	<ol>
<li>두 번째 페 트리 접시에 무릎 모자 집게, 단단히 잡고 하 고 주사기의 팁과 무릎을 매쉬. epiphyses 빨간색 이상 될 때까지 계속 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주사기를 사용 하 여 전송 셀에서 두 번째 및 세 번째 페 트리 접시 50 mL 튜브. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 덩어리를 해체. 거품을 생성 하지 마세요. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.</li>
	<li>
붉은 혈액 세포를 lyse
	<ol>
<li>혈 청 학적인 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고, 터치 하 여 펠 릿을 꺼내 실 온에서 1 분에 대 한 ACK (염화 염화 칼륨) 세포의 용 해 버퍼의 1 mL에 배양 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse.</li>
		<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, HBSS (행 크 스 균형 소금 솔루션) 버퍼의 40 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 필터링 셀 비록 70 µ m 셀 거르는 새로운 50 mL 원뿔 관으로. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 완전 한 미디어의 40 mL로 세척 하 고 표면에 뜨는 셀을 제거 합니다. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기. 참고:이 단계에서 계보 긍정적인 세포 FACS 또는 자기 열 정화에 의해 제거할 수 있습니다. 그러나, 림프 톨 문화에 긴 기간을 유지 하지 됩니다. 거의 모든 결 석 하는 혈통 긍정적인 세포의 많은 수는 Ly6C-CD115-인구 비보 전골 수에에서 존재, 하루 5 (그림 2).</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 상쾌한, 제거 하 고 골 셀 1 x 106 셀/mL의 조밀도에 재조합 마우스 GM-CSF의 10 ng/mL와 함께 완전 한 미디어 문화. 참고: 일반적으로, 4 x 107 총 세포 수 수 수확 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 후. 그러나, 기대 2 x 107 조금 초보자를 위한 최대 5 x 107 셀 경험된 수확기에 대 한.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 세포 조직 문화 접시에 전송 하 고 37 ° c 5% CO2에서 품 어. 각 씨앗 24-잘 접시를 사용 하 여 경우 세포 현 탁 액 2 mL와 잘.</li>
	<li>모든 48 h 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 미디어의 절반을 제거 하 고 신선한 완전 한 미디어와 GM-CSF 대체. 참고: 문화 수 유지 9 일. 그러나, 구성 시간이 지남에 변경 됩니다. 자세한 내용은 섹션 3을 참조 하십시오.</li>
</ol>3. 선택 정렬의 하루
<ol><li>시간이 지남에 셀 인구 구성 변화로 원하는 셀의 가장 높은 번호를 생성 하는 일을 선택 합니다.</li>
	<li>1 x 107 셀 당 GM-CSF에 문화의 3, 5, 및 7 일 후 각 인구의 예상된 셀 항복 게시물 정렬 표 1을 참조 하십시오.</li>
</ol>4. 얼룩이 전략
<ol><li>셀의 작은 aliquots를 사용 하 여 제어 샘플을 준비 하. 흠 없는 컨트롤, 보상 제어 샘플 하나만 형광 항 체 각, 물 포함 고 형광-마이너스-1 제어 하나, 일반적인 형광 해당 채널에 대 한 제어를 제외 하 고는 모든 항 체에 추가 합니다. 기본, 보조, 포함 간접적인 라벨을 사용 하 고 모두 기본 및 보조. 참고: Phycoerythrin (PE) 및 allophycocyanin (APC) 태그 항 체 제공 최소한의 출혈과 뚜렷한 분리에 함께 사용 될 때. 그러나, 형광 색소 옵션이 제한 됩니다, 경우 CD115는 표현 상대적으로 낮은 수준에서 Ly6C은 매우 높은 수준에서 표현 하는 동안. 따라서, 밝은 형광은 필요한 안티-CD115, 그리고 안티-Ly6C 형광 이상의 출혈을 방지 하기 위해 선택 됩니다.</li>
	<li>3 mL 50 mL 원뿔 튜브, 혈 청 태아 종 아리와 함께 냉장된 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)의 97 mL를 혼합 하 여 100 mL FACS 워시 버퍼 (FWB)의 준비 하 고 얼음 목욕에.</li>
	<li>한 피 펫을 사용 하 여 부드럽게, 그러나 철저 하 게, 플라스틱 셀 아래로 느슨하게 부착 셀을 꺼내 려.</li>
	<li>
혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송 합니다. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
	<ol>
<li>셀 볼륨 50 mL를 초과 하는 경우 튜브의 필요한 수를 셀을 전송 하 고 착 단계에서 결합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부드럽게 부는 상쾌한 어 하 고 혈 청 학적인 피 펫으로 FWB의 30 mL를 추가 하 여 수송과 세포를 씻어. 10 분, 4 ° C에서 250 x g 에서 centrifuge 고 세척을 반복 합니다. 참고: 높은 세포 죽음을 예상 하는 경우 셀 세척 될 수 있다와 FWB와 낮은 0.5% 태아 종 아리 혈 청 (FCS). 이 세포 응집 되지 것입니다.</li>
	<li>
일시 중지 하 고 항 체 제조 업체의 지시 당 세포 얼룩.
	<ol>
<li>5 x 107 셀 FWB의 1 mL를 일시 중단 하 고 2 µ g 각 안티-Ly6C 및 안티-CD115 (의 연구자의 선택) fluorophores 표시를 추가 합니다. 더 CMP 구별 moDC (둘 다은 Ly6C-CD115-), 추가 안티-CD11c 항 체의 2 µ g (CMP는 CD11c-; moDC는 CD11c+). 얼음에 30 분 동안 품 어. 참고: 그림 3 Ly6C-PE와 CD115 APC를 사용 하 여 생성 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 10 분 동안 4 ° C에서 250 x g 에서 FWB, 그리고 원심 분리기의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 부는 상쾌한 어 하 고 혈 청 학적인 피 펫으로 FWB의 30 mL를 추가 하 여 수송과 세포를 씻어. 10 분, 4 ° C에서 250 x g 에서 centrifuge 고 세척을 반복 합니다.</li>
	<li>셀을 중단 하기 전에 철저 하 게 펠 릿을 꺼내 려 튜브를 터치 합니다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 1 x 107 셀/mL FWB의 세포를 중단 하 고 35 µ m 셀 필터를 통해 필터링. 폴 리 프로필 렌 튜브에 필터링 된 셀 전송 정렬 준비가 될 때까지 얼음에 배치 하는 혈 청 학적인 피 펫을 사용 합니다. 참고: 지금까지 폴 리 프로필 렌, 사용할 수 없는 경우에 단백질 코팅 (무 지방 건조 우유 또는 FCS) 폴리스 티 렌 튜브 바인딩을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 설정 제어 샘플에 따라 게이츠
참고: 고속 흐름 스트림의 압력 때문에 세포 파쇄를 방지 하려면 셀 정렬에 대 한 100-130 µ m 노즐을 사용 합니다.
<ol><li>
흠 없는 컨트롤 실행 (단계 4.1 참조) 셀 정렬 통해 작은 파편 (낮은 앞으로 분산형;를 제외 하려면 게이트를 적용 하 고 FSC) 및 매우 세분화 된 (높은 쪽 분산형; SSC) 입자입니다.
	<ol>
<li>분석에 후기 (monocytes, moMac/MoDP, 및 MoDC), 더 큰 셀 (높은 FSC)만 포함 하도록 게이팅 적용 됩니다.</li>
		<li>생존 얼룩 사용 중인 경우 사용 하 여 이러한 스테인드, 비-가능한 이벤트 (예를 들어 그림 1에 설명 된다)를 제외 하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 정렬 통해 단일 형광 제어 샘플을 실행 하 고 필요에 따라 보상을 조정 합니다.</li>
	<li>다중 표시 된 샘플의 샘플을 실행 합니다. 4 개의 명료한 인구를 관찰: Ly6C + CD115-(GMPs) Ly6C + CD115 + (monocytes), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), 및 Ly6C-CD115-(CMPs/moDCs). 각 4 개의 주요 인구를 분리 하는 게이트를 적용 합니다. 참고: CMPs와 moDC Ly6C-CD115-표현 형을 공유합니다. 그러나, 그들은 분화 될 수 있다 CD11c 식에 따라: CMP 부족 CD11c, MoDCs 익스프레스 CD11c 반면.</li>
</ol>6입니다. 고립 된 인구의 수집
<ol><li>적어도 20%를 달성 하기 위해 충분 한 FCS를 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 최종 농도 전체. 예를 들어 5 mL 튜브를 사용 하는 경우 정렬, 전에 FCS의 1 mL을 추가 하 고 5 mL 전체 볼륨에 도달할 때 튜브를 제거.</li>
	<li>
막 회전율과 항 체 이해를 방지 하기 위해, 일종에 걸쳐 4 ° C에서 모든 샘플 (혼합 및 정렬)을 유지 합니다.
	<ol>
<li>만약 이것이 가능 하지, 유지 가능한 얼음에 정렬 하 고 필요에 따라 정렬에 aliquots를 전송 하는 셀을 포함 하는 관.</li>
		<li>또한, 모든 20-30 분 얼음 정렬된 샘플 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원하는 셀 수를 수집한 후에 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 새로운 원뿔 튜브에 세포를 전송. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.<ol>
<li>각 수집 된 인구에서 작은 aliquots에 정렬 후 분석 순도 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제거는 상쾌한, FWB 및 두 세척의 총 10 분 반복에 대 한 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기의 10 mL에 일시 중지. 참고: 그것은 펠 릿을 dislodging 없이 모든 상쾌한을 제거 하려면 어려울 수 있습니다. 피 펫 팁 진공 라인을 연결 제거 도울 수 있습니다. 사용할 수 없는 경우는 상쾌한 펠 릿 분리의 경우 신선한 튜브에 수집 될이 좋습니다.</li>
	<li>두 번째 세척 후에 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>경우 사용자의 실험 디자인 셀 다시 경작 될 지시, 단계 2.12-2.14. 그렇지 않으면, 셀 즉각적인 분석을 위해 사용 될 경우 원하는 프로토콜에 따라 셀을 준비 합니다. 참고: 일반적인 기능 분석의 예는 그림 4에 포함 됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 충돌이 있다.

이 프로토콜 GM-CSF 구동 시 조 및 전조 세포 유형 분석 생 화 확 적인 분석 실험, 세포 기능 시험관또는 주입 비보의 분석 실험 등의 여러 종류에 대 한 충분 한 숫자의 분리를 촉진 한다. 이 메서드는 신뢰할 수 있는 격리 및 식별이이 통로 그 차별화 된 셀 형식으로 개발의 초기에 셀의 더 일반적으로 사용 하는 monocyte 파생 된 모 수석 세포 개발의 분야에서 상당한 사전을 나타냅니다. 이전 연구에 격리.
창시자 및 생체 외에서 골 수에서 생성 하는 선구자의 격리에 대 한 이전 프로토콜 골수성 세포 18의 마커로 CD31와 Ly6C 얼룩 또는 증식 조상 세포 17 식별 CFSE 얼룩에 의존 . CFSE Naik에 의해 설명 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 Flt3L 기반 DC 창시자와 선구자 17...

Murine 골 수 세포는 사이토카인의 경작 Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)은 널리 이용 방법으로 큰 숫자 1, monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC;로 알려진 염증 DC)를 생성 하 2,3,,45. 이 세포의 수지상 세포 (DC) 함수 6,,78의 학문의 다양 한에서 매우 유용 되었습니다. 일반적으로, 이러한 murine 골 수 세포 교양 6-8 일 이며 수지상 세포 기능 5의 연구를 위해 사용 됩니다. 이러한 문화 오래 되어 고려 했다 주로 균질 성, 차별화 된 moDC의 대부분의 구성 된. 최근에, 그것은 분명이 6-8 일 문화 기간의 끝에, 차별화 된 monocyte 파생 된 세포 (moMacs) 9,,1011의 큰 하위 집합 뿐 아니라 실제로 많은 moDC 되었다. 우리 자신의 연구 더 적은 개발된 세포, monocytes, moDC 전 (moDP) 등의 다른 하위 집합 107 일 후에 낮은 주파수에서 문화에 남아 있는 것을 보여주는이 발견을 확대 했습니다. 따라서, 수지상 세포 (DC) 함수 사용 하 여이 시스템에 의해 생성 된 셀의 연구 이전 감사 보다 세포 유형의 광범위 한 코 호트의 응답을 반영 수 있습니다.
우리는 훌륭한 제의로 GM-CSF 생성 moDC 차별화 12,,1314의 마지막 단계에서 이러한 세포의 기능에 관련 된 연구에서 배웠습니다. 그러나, 우리가 이해 크게 이들의 발달 경로 대 한 세포 2,,1516 어떻게 그리고 언제 그들은 구체적인 전시의 같은 기능: 병원 체 관련 분자에 응답 패턴 (PAMPs), 식 균 작용, 항 원 처리 및 프레 젠 테이 션 13, 그리고 항균 활동. 기존의 Flt3L 기반 DC 창시자와 선구자의 많은 수의 격리 프로토콜 보고 17되었습니다. 이러한 고유한 인구의 격리 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE)를 사용 하 여 달성 되었다-스테인드 골 수 세포 (세포를 분할 추적)와 3 일 동안 Flt3L에 문화. 셀은 비재귀 긍정적인 세포의 고갈 그리고 조상과 전조 인구 CD11c 식 17을 기반으로 정렬 했다. GM-CSF 중심 문화에서 DC의 이른 창시자를 식별 하기 위해 Leenen의 그룹에 의해 또 다른 방법은 CD31 Ly6C 18에 따라 셀을 정렬 했다. 초기 목표는 창시자 및 GM-CSF 기반 moDC의 선구자는 비슷한 방법을 만드는 것 이었다. GM-CSF에 의해 생성 된 특정 세포 유형으로 인해 우리는 접근 및 전략 개발의 초기 및 이후 단계에서 표현 했다 분자의 식에 따라 정렬 적응. 우리가 궁극적으로 결정 하는 Ly6C, CD115 (CSF-1 수용 체), CD11c 10종류 구별이 셀에 대 한 최고의 마커를 했다.
여기, 우리 GM-CSF에 의해 구동 하는 차별화의 통로 따라 개발의 일부의 단계에서 세포의 분리 방법 제시: 일반적인 골수성 조상 (CMP), Granulocyte Macrophage 조상 (GMP), monocyte, monocyte 파생 된 대 식 세포 (MoMac) 및 monocyte 파생 된 DC (MoDC). MoMac 인구 수 추가 분리 될 기반 MHC 클래스 II 식의 수준에 moDC 전조 인구 (moDP) 10공개. 우리가 활용 고속 형광 활성화 셀이 5 인구 Ly6C, CD115, 및 CD11c의 식에 따라 분리 (FACS) 전략을 정렬 합니다. PAMP 자극에 대 한 답변을 공개 하는 기능 분석에서 이러한 셀의 시험 다음 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청(FCS)</td><td>HyClone</td><td>SV30014.04</td>는 <td>완전 배지를 보충하고 FWB</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050</td>은 <td>완전 배지</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(2-ME)</td><td>MP 생물의학</td><td>190242</td><td>보충하여 완전한 배지</td></tr><tr><td>75mM 진공 필터를</td> 보충합니다.<td>Thermo Scientific</td><td>156-4045</td><td>완전한 매체를 살균하기 위해</td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>적혈구</td></tr><tr><td>HBSS 버퍼</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>적혈구 용해 후 백혈구 구</td></tr>출 인<tr><td>산염 완충 식염수 (PBS), Dulbecco의</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>는 내독소가 없어야합니다. 4 &deg에서 냉각; C</td></tr><tr><td>35 & 마이크로; m 세포 필터</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>세포 분석기를 통과하기 전에 덩어리를 분해합니다.</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Biosource</td><td>PMC2011</td><td>10ng/mL의 사용 가능한 농도</td></tr><tr>수확 <td>후 골수 세포용</td><td>조직 배양 처리 플레이트</td><td>VWR</td><td>10062-896</td></tr><tr><td>Anti-Ly6C, 클론 HK1.4</td><td>Biolegend</td><td>128018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115, 클론 AFS98</td><td>Tonbo Bioscience</td><td>20-1152-U100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c, 클론 HL3</td><td>BD Biosciences</td><td>557400</td><td>CMP와 MoDC를 구별하기 위해</td></tr><tr><td>MoFlo XPD 유세포 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td>660517</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 페트리 디쉬</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 튜브</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>000664</td><td>여성; 10-20주 된</td></tr><tr><td>Biosafety Hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>8354-30-0011</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>23 G 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5810&nbsp; R</td><td>eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10</td><td>BD Biosciences</td><td>Version 10</td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

문화 monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC) Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)를 사용 하 여 마우스 골 수에서 생성 된의 최근 이전 감사 보다 더 이질적인 것 인정 되었습니다. 이러한 문화는 정기적으로 뿐만 monocyte 파생 된 moDC 대 식 세포 (moMac), 및 monocytes 등도 일부 덜 개발 된 셀 포함. 이 프로토콜의 목표는 일관 된 방법을 제공 식별 및 분리는 많은 종류의 세포가이 문화에 대 한 개발로 서 그들은, 특정 기능 추가 조사 될 수 있도록. 여기에 제시 된 정렬 전략 4 인구 둘 다는 표현 정도 세포에 의해 그들은 GM-CSF 중심 문화에서 개발 Ly6C 및 CD115의 식을 기반으로 먼저 세포를 분리 합니다. 이 4 개의 인구는 일반적인 골수성 창시자 또는 CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage 창시자 또는 GMP (Ly6C +, CD115-), monocytes (Ly6C +, CD115 +), 및 monocyte 파생 된 세포 또는 moMac (Ly6C-, CD115 +)를 포함합니다. CD11c는 Ly6C-, CD115-인구 내에서 두 개의 인구를 구분 하는 정렬 전략에도 추가 됩니다: CMP (CD11c-) 및 moDC (CD11c +). 마지막으로, 두 개의 인구는 Ly6C-, CD115 + 인구 MHC 클래스 II 식의 수준에 따라 내 더 구별 될 수 있습니다. MoMacs 익스프레스 MHC 종류 II, 더 낮은 수준의 높은 MHC 종류 II를 표현 하는 monocyte 파생 된 DC 전조 (moDP) 하는 동안. 이 메서드는 여러 발달 고유 인구 숫자의 신뢰할 수 있는 격리에 대 한 다양 한 기능과 발달 분석에 대 한 충분 한 있습니다. 우리는 하나 같은 기능 판독, 이러한 종류의 세포 차동 응답 Pathogen-Associated 분자 패턴 (PAMPs) 자극을 강조.

가능 하 고, 실행 가능한 세포로 분석을 위해 사용할 수 있는 많은 채널을 유지 하기 위해에서 매우 작고 매우 세부적인 이벤트 (일반 게이트 모든 적용 됩니다 도트 그림 1A에플롯)를 제외 하 고 측면 분산형에 따라 선택 일상적으로 했다. 이 제어 전략은 안정적으로 죽은 세포를 제외 하는 경우를 확인 하려면 우리는 7-아미노 악티노마이신 d (7-AAD) (그림 1B) 스테인드. 7AAD는 DNA 죽음과 죽어가는 세포 막 침투성 때문에 얼룩 그리고 가능한 세포에 의해 제외 됩니다. GM-CSF 배양된 골 수 세포 수확 후 (PH)와 1, 3, 그리고 5 박사 셀 분석 PH 즉시 즉시 분석의 일반 FSC/SSC 게이트 뼈에서 갓 격리 된 셀에 적용 된 7 AAD 긍정적인 세포의 약 10%를 했다 수 (그림 1, 수...

여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

이 방법을 통해 연구자들은 발달 면역학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있는 충분한 수의 세포 유형을 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전통적으로 생체 외에서 낮은 수로 발견되는 많은 수의 세포를 분리하기 위해 몇 가지 선택 마커에 의존한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 치료적 골수 이식으로 확장되는데, 이는 많은 수의 전구 세포를 분리할 수 있기 때문입니다.프로토콜을 시작하려면 미리 준비한 쥐의 뒷다리와 몸통을 75% 에탄올로 적시고 구부러진 조직 가위로 고관절 주변 피부를 얕게 자릅니다. 그런 다음 뒷다리를 제거하고 벗겨냅니다. 집게를 사용하여 엉덩이에서 발목 쪽으로 피부를 단단히 당겨 근육을 드러내고 가위를 사용하여 피부 덮개를 제거합니다.대퇴골과 고관절 바로 위를 자르고 뼈를 잘라 뒷다리 전체를 제거합니다. 멸균 생물 안전 캐비닛에서 작업하면서 다리를 미리 준비된 페트리 접시 중 하나로 옮깁니다. 가위를 사용하여 발목 바로 아래를 자르고 가능한 한 많은 근육과 탄력 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다.청소한 뼈를 두 번째로 준비된 페트리 접시에 옮깁니다. 다음으로 대퇴골, 무릎, 경골을 분리합니다. 겸자를 사용하여 다리를 무릎으로 잡고 대퇴골 상단과 경골 끝을 향한 골강 내부의 희미한 빨간색 선인 골수를 찾습니다.가위로 골수가 끝나는 것처럼 보이는 바로 위의 경골을 자릅니다. 무릎 관절 바로 아래를 자르고 무릎 관절 바로 위를 자릅니다. 그런 다음 대퇴골과 경골에서 골수를 씻어냅니다.10ml 원뿔형 튜브의 완전한 매체로 10ml 주사기를 채우고 23게이지 바늘로 주사기를 닫습니다. 세 번째로 준비된 페트리 접시 위에 집게로 뼈를 잡고 바늘을 골관에 삽입하고 매체를 밀어 세포를 씻어냅니다. 뼈를 통해 더 이상 색상이 보이지 않을 때까지 이 단계를 반복합니다.골단을 부수어 절차를 계속합니다. 두 번째 페트리 접시에 있는 동안 집게로 슬개골을 단단히 잡고 주사기 끝으로 무릎을 으깨십시오. 골단이 더 이상 빨간색이 아닐 때까지 계속합니다.주사기를 사용하여 두 번째 및 세 번째 페트리 접시의 세포를 50ml 튜브로 옮깁니다. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 덩어리를 부수고 거품이 생기지 않도록 하십시오. 세포를 원심분리하십시오.그런 다음 혈청학적 피펫으로 상층액을 제거하고, 튕겨 펠릿을 제거하고, 실온에서 1분 동안 1ml의 염화암모늄 칼륨 또는 ACK 용해 완충액에 적혈구를 배양하여 적혈구를 용해합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 40ml의 HBSS 완충액을 추가합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 여과하여 새로운 50ml 원추형 튜브에 넣고 세포를 원심분리합니다.혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 골수 세포를 1밀리리터당 10 곱하기 10에서 밀리리터당 6번째 세포의 밀도로 재조합 마우스 GM-CSF를 포함한 완전한 배지에서 배양합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 조직 배양 플레이트로 옮기고 염색을 진행할 준비가 될 때까지 섭씨 37도의 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 부드럽지만 철저하게 세포를 위아래로 피펫팅하여 느슨하게 부착된 세포를 제거합니다.혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 50ml 원추형 튜브로 옮기고 세포를 원심분리합니다. 상층액을 부드럽게 붓고 혈청학적 피펫과 함께 30ml의 FACS 세척 완충액(SFWB)을 추가하여 펠릿화된 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포를 원심분리하고 세척을 반복합니다.다음으로, 항체 제조업체의 지침에 따라 세포를 현탁시키고 염색합니다. FWB 1밀리리터에 10에서 7번째 세포를 5회 재현탁하고, 형광단으로 표지된 항 Ly-6C 및 항 CD115를 각각 2마이크로그램씩 첨가합니다. CMP와 MODC를 추가로 구별하려면 2마이크로그램의 항 CD11C 항체를 첨가합니다.얼음 위에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 혈청학 피펫을 사용하여 10ml의 FWB를 추가하고 세포를 원심분리합니다. 상층액을 부드럽게 붓고 혈청학적 피펫으로 FWB 30ml를 추가하여 펠릿화된 세포를 세척합니다.세포를 원심분리하고 세척을 반복합니다. 세포를 현탁시키기 전에 튜브를 철저히 튕겨 펠릿을 제거합니다. 혈청학 피펫을 사용하여 FWB 10에서 7번째 세포의 1배로 세포를 재현탁하고 35마이크로미터 세포 필터를 통해 필터링합니다.혈청학 피펫을 사용하여 여과된 세포를 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 분류할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 염색되지 않은 대조군을 세포 분류기를 통해 실행하고 게이트를 적용하여 작은 파편과 매우 입상인 입자를 제외합니다. 세포 분류기를 통해 단일 형광 대조군 샘플을 실행하고 필요에 따라 보상을 조정합니다.다중 레이블이 지정된 표본의 표본을 실행하고 4개의 고유한 모집단을 관찰합니다. 게이트를 적용하여 4개의 주요 개체군 각각을 격리합니다. 가득 찼을 때 최소 20%의 최종 농도를 달성할 수 있도록 충분한 태아 송아지 혈청(FCS)을 추가하여 채취 튜브를 준비합니다.예를 들어, 5 밀리리터 튜브를 사용하는 경우 분류하기 전에 1 밀리리터의 FCS를 추가하고 총 부피가 5 밀리리터에 도달하면 튜브를 제거합니다. 멤브레인 회전율 및 항체 흡수를 방지하려면 분류 내내 모든 샘플을 섭씨 4도로 유지하십시오. 원하는 수의 세포를 수집한 후 혈청학 피펫을 사용하여 세포를 새로운 원뿔형 튜브로 옮기고 세포를 원심분리합니다.상등액을 조심스럽게 제거하고 FWB 10ml에 세포를 재현탁시킨 다음 세포를 다시 원심분리합니다. FWB 서스펜션을 총 두 번 세탁합니다. 마지막으로 두 번째 세척 후 상층액을 제거하고 실험 설계에 따라 진행합니다.분석에 사용할 수 있는 채널을 최대한 많이 유지하기 위해, 매우 작고 매우 세분화된 이벤트를 제외하고 전방 및 측면 산란을 기반으로 생존 가능한 세포를 일상적으로 선택했습니다. 이 게이팅 전략이 죽은 세포를 안정적으로 배제하는지 확인하기 위해 샘플을 7-Aminoactinomycin D.Cells로 염색했습니다.수확 직후 분석된 세포는 7-AAD 양성 세포의 약 10%를 가지고 있으며, 이때 전형적인 FSC, SSC 게이트를 골수에서 갓 분리된 세포에 적용했습니다. 비슷한 비율의 죽은 세포가 배양의 stay 1 및 stay 3에도 존재했습니다.5일째에는 게이트 내의 사멸 세포 수가 5%로 감소했기 때문에 이러한 생존 게이트를 사용하는 것이 일반적으로 5일째 및 그 이후에 분류하는 데 적합합니다. 유세포 분석은 Ly6C 음성, CD115 집단 내에서 CD3, CD45R 양성 세포가 0일차부터 3일차까지 강력하게 유지되었음을 밝혔습니다. 4일째에는 CD3, CD45R 양성 세포가 몇 개만 남았고, 5일과 6일째에는 CD3, CD45R 발현 세포가 없었습니다. 따라서, GM-CSF에서 배양 후 4일 이내에 계통 양성 세포는 본질적으로 존재하지 않았으며, 배양 5일과 6일째에는 전혀 검출되지 않았습니다.이 절차를 시도하는 동안 세포 구성이 배양 기간에 따라 달라진다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 수확 후 3일을 분류하면 초기 단계의 수는 많고 후기 단계는 거의 나오지 않으며, 5일 후에 분류된 배양물의 경우 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.

generation-large-numbers-myeloid-progenitors-dendritic-cell

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

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골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

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