골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

이 방법을 통해 연구자들은 발달 면역학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있는 충분한 수의 세포 유형을 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전통적으로 생체 외에서 낮은 수로 발견되는 많은 수의 세포를 분리하기 위해 몇 가지 선택 마커에 의존한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 치료적 골수 이식으로 확장되는데, 이는 많은 수의 전구 세포를 분리할 수 있기 때문입니다.

프로토콜을 시작하려면 미리 준비한 쥐의 뒷다리와 몸통을 75% 에탄올로 적시고 구부러진 조직 가위로 고관절 주변 피부를 얕게 자릅니다. 그런 다음 뒷다리를 제거하고 벗겨냅니다. 집게를 사용하여 엉덩이에서 발목 쪽으로 피부를 단단히 당겨 근육을 드러내고 가위를 사용하여 피부 덮개를 제거합니다.

대퇴골과 고관절 바로 위를 자르고 뼈를 잘라 뒷다리 전체를 제거합니다. 멸균 생물 안전 캐비닛에서 작업하면서 다리를 미리 준비된 페트리 접시 중 하나로 옮깁니다. 가위를 사용하여 발목 바로 아래를 자르고 가능한 한 많은 근육과 탄력 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다.

청소한 뼈를 두 번째로 준비된 페트리 접시에 옮깁니다. 다음으로 대퇴골, 무릎, 경골을 분리합니다. 겸자를 사용하여 다리를 무릎으로 잡고 대퇴골 상단과 경골 끝을 향한 골강 내부의 희미한 빨간색 선인 골수를 찾습니다.

가위로 골수가 끝나는 것처럼 보이는 바로 위의 경골을 자릅니다. 무릎 관절 바로 아래를 자르고 무릎 관절 바로 위를 자릅니다. 그런 다음 대퇴골과 경골에서 골수를 씻어냅니다.

10ml 원뿔형 튜브의 완전한 매체로 10ml 주사기를 채우고 23게이지 바늘로 주사기를 닫습니다. 세 번째로 준비된 페트리 접시 위에 집게로 뼈를 잡고 바늘을 골관에 삽입하고 매체를 밀어 세포를 씻어냅니다. 뼈를 통해 더 이상 색상이 보이지 않을 때까지 이 단계를 반복합니다.

골단을 부수어 절차를 계속합니다. 두 번째 페트리 접시에 있는 동안 집게로 슬개골을 단단히 잡고 주사기 끝으로 무릎을 으깨십시오. 골단이 더 이상 빨간색이 아닐 때까지 계속합니다.

주사기를 사용하여 두 번째 및 세 번째 페트리 접시의 세포를 50ml 튜브로 옮깁니다. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 덩어리를 부수고 거품이 생기지 않도록 하십시오. 세포를 원심분리하십시오.

그런 다음 혈청학적 피펫으로 상층액을 제거하고, 튕겨 펠릿을 제거하고, 실온에서 1분 동안 1ml의 염화암모늄 칼륨 또는 ACK 용해 완충액에 적혈구를 배양하여 적혈구를 용해합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 40ml의 HBSS 완충액을 추가합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 여과하여 새로운 50ml 원추형 튜브에 넣고 세포를 원심분리합니다.

혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 골수 세포를 1밀리리터당 10 곱하기 10에서 밀리리터당 6번째 세포의 밀도로 재조합 마우스 GM-CSF를 포함한 완전한 배지에서 배양합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 조직 배양 플레이트로 옮기고 염색을 진행할 준비가 될 때까지 섭씨 37도의 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 부드럽지만 철저하게 세포를 위아래로 피펫팅하여 느슨하게 부착된 세포를 제거합니다.

혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 50ml 원추형 튜브로 옮기고 세포를 원심분리합니다. 상층액을 부드럽게 붓고 혈청학적 피펫과 함께 30ml의 FACS 세척 완충액(SFWB)을 추가하여 펠릿화된 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포를 원심분리하고 세척을 반복합니다.

다음으로, 항체 제조업체의 지침에 따라 세포를 현탁시키고 염색합니다. FWB 1밀리리터에 10에서 7번째 세포를 5회 재현탁하고, 형광단으로 표지된 항 Ly-6C 및 항 CD115를 각각 2마이크로그램씩 첨가합니다. CMP와 MODC를 추가로 구별하려면 2마이크로그램의 항 CD11C 항체를 첨가합니다.

얼음 위에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 혈청학 피펫을 사용하여 10ml의 FWB를 추가하고 세포를 원심분리합니다. 상층액을 부드럽게 붓고 혈청학적 피펫으로 FWB 30ml를 추가하여 펠릿화된 세포를 세척합니다.

세포를 원심분리하고 세척을 반복합니다. 세포를 현탁시키기 전에 튜브를 철저히 튕겨 펠릿을 제거합니다. 혈청학 피펫을 사용하여 FWB 10에서 7번째 세포의 1배로 세포를 재현탁하고 35마이크로미터 세포 필터를 통해 필터링합니다.

혈청학 피펫을 사용하여 여과된 세포를 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 분류할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 염색되지 않은 대조군을 세포 분류기를 통해 실행하고 게이트를 적용하여 작은 파편과 매우 입상인 입자를 제외합니다. 세포 분류기를 통해 단일 형광 대조군 샘플을 실행하고 필요에 따라 보상을 조정합니다.

다중 레이블이 지정된 표본의 표본을 실행하고 4개의 고유한 모집단을 관찰합니다. 게이트를 적용하여 4개의 주요 개체군 각각을 격리합니다. 가득 찼을 때 최소 20%의 최종 농도를 달성할 수 있도록 충분한 태아 송아지 혈청(FCS)을 추가하여 채취 튜브를 준비합니다.

예를 들어, 5 밀리리터 튜브를 사용하는 경우 분류하기 전에 1 밀리리터의 FCS를 추가하고 총 부피가 5 밀리리터에 도달하면 튜브를 제거합니다. 멤브레인 회전율 및 항체 흡수를 방지하려면 분류 내내 모든 샘플을 섭씨 4도로 유지하십시오. 원하는 수의 세포를 수집한 후 혈청학 피펫을 사용하여 세포를 새로운 원뿔형 튜브로 옮기고 세포를 원심분리합니다.

상등액을 조심스럽게 제거하고 FWB 10ml에 세포를 재현탁시킨 다음 세포를 다시 원심분리합니다. FWB 서스펜션을 총 두 번 세탁합니다. 마지막으로 두 번째 세척 후 상층액을 제거하고 실험 설계에 따라 진행합니다.

분석에 사용할 수 있는 채널을 최대한 많이 유지하기 위해, 매우 작고 매우 세분화된 이벤트를 제외하고 전방 및 측면 산란을 기반으로 생존 가능한 세포를 일상적으로 선택했습니다. 이 게이팅 전략이 죽은 세포를 안정적으로 배제하는지 확인하기 위해 샘플을 7-Aminoactinomycin D.Cells로 염색했습니다.수확 직후 분석된 세포는 7-AAD 양성 세포의 약 10%를 가지고 있으며, 이때 전형적인 FSC, SSC 게이트를 골수에서 갓 분리된 세포에 적용했습니다. 비슷한 비율의 죽은 세포가 배양의 stay 1 및 stay 3에도 존재했습니다.

5일째에는 게이트 내의 사멸 세포 수가 5%로 감소했기 때문에 이러한 생존 게이트를 사용하는 것이 일반적으로 5일째 및 그 이후에 분류하는 데 적합합니다. 유세포 분석은 Ly6C 음성, CD115 집단 내에서 CD3, CD45R 양성 세포가 0일차부터 3일차까지 강력하게 유지되었음을 밝혔습니다. 4일째에는 CD3, CD45R 양성 세포가 몇 개만 남았고, 5일과 6일째에는 CD3, CD45R 발현 세포가 없었습니다. 따라서, GM-CSF에서 배양 후 4일 이내에 계통 양성 세포는 본질적으로 존재하지 않았으며, 배양 5일과 6일째에는 전혀 검출되지 않았습니다.

이 절차를 시도하는 동안 세포 구성이 배양 기간에 따라 달라진다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 수확 후 3일을 분류하면 초기 단계의 수는 많고 후기 단계는 거의 나오지 않으며, 5일 후에 분류된 배양물의 경우 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.