효 모 세포 산화 스트레스에 단백질 집단의 영향 평가

단백질 집계 세포 산화 스트레스 elicits. 이 프로토콜 amyloidogenic 단백질의 세포내 주와 관련 된, cytometry 사용 하 여 산화 스트레스 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 아 밀 로이드 β 펩 티 드의 가용성과 집계 경향이 이체의 동작을 연구 하는 데 사용 됩니다.

이 절차의 전반적인 목표는 제빵 효모 Saccharomyces cerevisiae를 사용하여 세포 내 단백질 응집체의 형성과 세포 산화 스트레스에 미치는 영향 사이의 관계를 결정하는 것입니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환 및 비 신경 병성 아밀로이드 증후군과 같은 단백질 잘못 접힘 및 응집 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간단하고 빠르며 대규모 효모 집단에서 세포 산화 스트레스 손상을 정량화할 수 있다는 것입니다.

이 방법을 통해 아밀로이드 생성 단백질의 세포 내 용해성 또는 응집 상태와 효모의 산화 스트레스 수준 간의 상관 관계에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한, 재조합 단백질을 발현하는 다른 모델 유기체에도 적용할 수 있습니다. 유세포 분석 분석을 시연하는 사람은 UAB의 유세포 분석 시설(Flow Cytometry Facility)의 기술자인 마누엘라 코스타(Manuela Costa)입니다.

이 연구에서는 갈락토제 유도 프로모터의 제어하에 GFP에 융합된 A-베타-42에 대한 플라스미드 인코딩으로 형질전환된 S.cerevisiae를 사용하여 다양한 A-beta-42 펩타이드 변이체의 세포 내 응집 상태를 추적합니다. 형질전환된 효모 세포의 한 콜로니를 선택하고 20ml의 SC에서 2%포도당을 함유한 Ura 배지를 뺀 상태로 접종합니다. 하룻밤 동안 교반하듯 섭씨 30도에서 배양을 성장시킵니다.

다음 날, 하룻밤 배양 100마이크로리터를 5밀리리터의 신선한 SC에서 우라 배지를 뺀 농도로 접종하고 섭씨 30도에서 2-3시간 동안 세포를 성장시킵니다. 배양물이 0.5의 590 나노미터 OD 590에 광학 조밀도에 있을 때, 3, 4 분 동안 000배 g에 배양물을 원심 분리하고, 상층액을 버리고, 신선한 SC 마이너스 2%raffinose를 포함하는 Ura 매체의 5 밀리리터에 있는 세포를 refuse. 섭씨 30도에서 30분 동안 교반하면서 세포를 배양합니다.

30 분 후에, 3, 000 시간 g에 4 분 동안 세포를 원심 분리하고, 상등액을 버리고, 재조합 단백질 발현을 유도하기 위하여 2%galactose를 포함하는 신선한 SC 마이너스 Ura 매체에 있는 세포를 refuse. 세포를 16시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 16시간 후, 배양액의 1밀리리터 분취액을 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 4분 동안 3, 000회 g으로 원심분리하여 세포를 수확합니다.

16시간 유도 효모 세포의 OD 590을 측정하여 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 멸균 PBS의 세포를 0.1의 OD 590으로 희석합니다. 발현 세포 현탁액을 적절하게 표지된 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮기고 빛으로부터 보호합니다.

비유도 세포를 유세포 분석을 위한 negative control로 준비합니다. 각 샘플에 산화 스트레스 프로브를 최종 농도 5마이크로몰로 추가합니다. 샘플을 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 30도에서 30분 동안 배양합니다.

배양이 완료되면 세포를 스핀다운하고 상층액을 제거한 다음 세포 펠릿을 PBS에 재현탁합니다. PBS로 이런 식으로 세포를 세 번 씻습니다. 세 번째 세척 후 동일한 부피의 PBS에 세포를 재현탁합니다.

염색되지 않은 세포가 유세포 분석 분석에 포함되어 있는지 확인합니다. 적절한 레이저와 필터를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 GFP 및 산화 스트레스 프로브의 형광 신호를 검출합니다. 먼저 Open New Worksheet 패널을 클릭하고 실험에 이름을 지정합니다.

도구 모음에서 Scatter Plot Tool을 선택하고 y축의 Side Scatter Area 변수와 x축의 선형 스케일로 Forward Scatter Area 변수가 있는 플롯을 만듭니다. 산점도 도구를 클릭하고 x축의 변수 FITC 영역과 y축의 로그 스케일로 APC 영역이 있는 플롯을 만듭니다. Instrument Setting 아이콘을 클릭하고 Compensation 탭에서 모든 보상 수준을 0으로 설정합니다.

그런 다음 Acquisition 탭을 클릭하고 낮은 유속으로 기록할 총 20, 000개의 이벤트를 선택합니다. 한 형광 색소의 형광 방출 신호는 다른 검출기에 의해 감지될 수 있기 때문에 모든 검출기에서 각 형광 색소의 최소 신호를 단색 제어로 균등화하기 위해 보상 프로세스를 수행하는 것이 중요합니다. 튜브 001의 이름을 negative control로 바꾸고 Acquire 탭을 클릭하여 비유도 및 염색되지 않은 세포의 실행을 시작합니다.

모집단이 왼쪽 중간 사분면에 분포될 때까지 전방 및 측면 산란의 기기 설정에서 전압을 조정합니다. 폴리곤(Polygon) 아이콘을 클릭하여 세포 파편을 제외한 세포 집단 주위의 영역 R1을 설정하고, 이 게이트 집단 P1을 모든 형광 점도표 및 히스토그램 표현에 R1과 동일하게 사용합니다. 형광 신호의 PMT 전압을 조정하려면 FL1에서 FL3 점도표에서 염색되지 않은 세포를 실행하고 세포가 왼쪽 하단 사분면에 분포될 때까지 기기 설정 탭에서 게인을 조정합니다.

산점도 도구를 사용하여 x축의 변수 FITC-A와 FSC-A의 도트플롯을 생성하고, x축의 변수 APC-A와 FSC-A의 두 번째 도트플롯을 생성합니다. 다음으로, GFP 형광을 측정하기 위해 샘플을 유도 세포로 변경합니다. Instrument Setting 탭에서 모집단이 오른쪽 하단 사분면에 분포되어 있을 때 FSC-A 대 FITC의 게인을 설정합니다.

게이트를 사용하여 GFP 양성 세포 집단을 정의합니다. 샘플을 유도되지 않은 염색된 세포로 변경합니다. FSC-A 대 APC-A 점도표에서 형광에 의한 산화 응력을 표시합니다.

세포 집단이 왼쪽 상단 사분면에 분포될 때까지 게인을 조정합니다. P3에서 양성 세포 집단을 게이트합니다. Histogram(히스토그램) 아이콘을 사용하여 세포 형광을 나타내는 두 개의 히스토그램 플롯을 만들며, 하나는 FITC에 대한 것이고 다른 하나는 APC 형광에 대한 것입니다. 평균 형광 강도 및 중앙값 형광을 해당 표준 오차 및/또는 GFP 형광 및 산화 스트레스 수준에 대한 분산 계수와 함께 표시하는 표를 만듭니다.

보정 탭을 클릭하고 모든 보정 수준을 0으로 설정합니다. 획득 탭을 클릭하고 기록할 총 20, 000개의 이벤트 수를 선택합니다. 3개의 새로운 샘플 튜브를 준비하고 non-induced, induced soluble 및 induced aggregated로 명명합니다.

사전 설정된 설정으로 샘플에서 데이터를 수집합니다. 새 시트를 열고 변수 FITC-A 및 APC-A에 대한 점도표를 만들고 CellROX 염색을 위한 양성 세포를 게이팅하여 데이터를 분석합니다. 각 샘플에 대해 FITC 및 APC 채널에 대한 평균 형광과 표준 오차가 포함된 통계 테이블을 생성합니다.

응집된 단백질 계수 후 FACS 분류기로 세포를 분류하는 것도 가능합니다. 16시간의 유도 기간 후 A-beta-42 변이체를 발현하는 효모 세포를 형광 현미경으로 시각화하여 세포 내부의 재조합 단백질 분포를 확인합니다. 이러한 이미지는 선별된 A-beta-42 GFP 변형체를 대표합니다.

단백질 내포물(PI)의 형성은 분석된 컬렉션의 20개 변이체 중 10개에서 확인되었습니다. 이 막대 그래프는 각 변이체에 대해 총 500개의 형광 세포에서 생물학적 복제물로 계산된 서로 다른 수의 PI를 포함하는 세포의 백분율을 나타냅니다. 예측된 응집 특성과 생체 내 응집 특성 사이의 우수한 일치가 관찰되었습니다.

세포 추출물의 단백질 발현 수준은 A-베타 특이적 항체를 사용하여 정량화되었습니다. 일반적인 경향으로, 녹색으로 표시된 PI 형성 A-beta-42 변이체는 빨간색으로 표시된 세포질에 확산 분포된 변이체보다 낮은 수준으로 존재합니다. A-beta-42 변이체 간의 중요한 차이점은 산화 스트레스 프로브 형광, 단백질 수준 및 GFP 형광 특성이 PI를 형성하는 능력과 AGGRESCAN 또는 TANGO 생물정보학 알고리즘에 의해 예측된 고유 응집 성향과 관련하여 나타낼 때 관찰되었습니다.

PI 형성 변형은 녹색이고 비 PI 형성 변형은 빨간색입니다. 이 절차에 따라 프로피듐 요오드화물 또는 아넥신 V 염색과 같은 다른 방법을 수행하여 세포 내 발현 단백질 변이체가 세포 사멸 또는 세포 독성에 미치는 영향을 결정하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수도 있습니다.