Name: 효 모 세포 산화 스트레스에 단백질 집단의 영향 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 학습하세요 흐름 세포측정법을 이용하여 Saccharomyces cerevisiae에서 단백질 응집과 산화 스트레스의 상관관계를 평가하는 방법을. 이 기술은 신경퇴행성 질환 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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1. S. cerevisiae 문화와 단백질 표정
참고: Aβ 변종 전시 Aβ42 펩 티 드 (그림 1A)의 위치 19 (Phe19)에서 단일 잔류물에 돌연변이 인해 다른 상대 집계 경향. 이 펩 티 드 이체는 녹색 형광 단백질 (GFP), 집계 기자 (그림 1)29역할으로 태그 됩니다.
<ol><li>플라스 미드 BY4741 부모의 배경 (타 그의3Δ1 레이2Δ0 만난15Δ0 ura3Δ0)30효 모 세포로 20 Aβ42-GFP 변종에 대 한 인코딩 변환. 각 플라스 미드 GSSGSSG 링커에 의해 GFP를 융합 하는 Aβ42 돌연변이 인코딩합니다. 플라스 미드는 pESC(-URA) 이며 선택 가능한 마커 URA329를 포함.<ol>
<li>다음 구성 요소와 uracil (사우스 캐롤라이나-우 라) 없이 합성 완전 한 매체 준비: 1.9 g/L 효 질소 uracil, 5 g/L 황산 암모늄과 900 mL ddH2O의 기본 20% (w/v) 포도 당 100ml와 결합.</li>
		<li>2% 포도 당을 포함 하는 SC-우 라 중간의 20 mL로 변형 된 효 모 세포에의 한 식민지를 넣고 하룻밤 동요 210 rpm에서 30 ° C에서 문화를 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 날, 신선한 SC-우 라 중간의 5 mL에 접종 100 µ L의 숙박 문화에 의해 새로운 효 모 세포 배양 성장.</li>
	<li>에는 OD590 0.5, 원심 4 분 3000 x g에서 문화, 상쾌한, 삭제 고 resuspend 동일한 양의 신선한 SC-우 라 중 2% 유를 포함 하는 셀.</li>
	<li>30 분 동안 210 rpm 동요에서 30 ° C에서 품 어. 그리고 4 분 3000 x g에서 세포를 원심는 상쾌한을 삭제 합니다. 재조합 형 단백질 표정 유도 2% 갈 락 토스를 포함 하는 신선한 SC-우 라 매체에 셀 resuspend</li>
	<li>단백질 표정 2% 갈 락 토스를 포함 하는 사우스 캐롤라이나-우 라 중간에 유도의 16 h 후 4 분 3000 x g에서 원심 분리 하 여 살 균 microcentrifuge 관에 유도 세포의 1 mL를 수확. 참고: 가장 관련성이 높은 차이 발생 후 Aβ42 GFP 변종 표현 16 h. 유도 효 모 세포의 유도 기간 형광 현미경 검사 법 (그림 2B) 셀 안에 재조합 단백질 분포를 결정 하 여 구상 될 수 있다.</li>
</ol>2. 세포 얼룩
참고: 신선한 비 유발 세포는 FC 분석 동안 형광 임계값을 설정 하는 부정적인 컨트롤으로 구성 해야 합니다.
<ol><li>16 h 유발 효 모 세포를가지고 고 590에서 그들의 광학 밀도 결정 nm (OD590). 0.1의 OD590 를 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 분 (PBS)에 그들을 희석.<ol>
<li>버퍼링 인산 염 분 x 1을 다음과 같이 준비: NaCl, KCl, 나2HPO4, 1.44 g의 0.2 g의 8 g을 추가 하 고 KH2포4 ddH2오의 800 mL의 0.24 g pH 7.4에 조정 후 1 L ddH2O의 솔루션 작성 HCl. 버퍼 0.2 µ m 필터를 통해 필터링.</li>
	</ol>
</li>
	<li>레이블이 표시 된 튜브 (12 × 75 m m 라운드 하단 폴리스 티 렌)을 표현 하는 세포 정지를 전송 하 고 빛에서 그들을 보호. 그들은 비 유도 및 비-얼룩진 셀 함께 분석에 대 한 교류 cytometer에 로드할 준비가 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>5 µ M의 최종 농도에 각 샘플을 (예를 들어, CellROX 딥 레드) 산화 스트레스 프로브를 추가 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 30 ° C에 세포를 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 셀 1 x PBS로 3 회 세척 하 고 FC 그들의 분석 전에 버퍼의 동일한 볼륨에 그들을 resuspend.</li>
</ol>3. 교류 Cytometry 분석
참고: 적절 한 레이저와 필터는 FC 설치를 사용 하 여 GFP와 산화 스트레스 프로브 형광 신호를 감지. 교류 cytometer GFP의 발견을 위한 488 nm 청색 레이저와 산화 스트레스 프로브 형광의 탐지를 위한 635 nm 빨간 레이저를 사용할 수 있습니다. GFP와 산화 스트레스 프로브 방출 형광의 인수는 각각 530/30 nm BP 필터와 660/20 BP 필터 수행 (표 1).
<ol><li>새 워크시트 패널 열기 에 클릭 하 고 다음 인수 점 플롯을 만들.<ol>
<li>도구 모음에서 분산형 플롯 도구 를 선택 하 고 A를 만들기 음모 쪽 분산형-지역 변수 (SSC-)는 y 축 대 앞으로 피해 지역에 (FSC-A)는 x 축에 선형 눈금에.</li>
		<li>도구 모음에서 분산형 플롯 도구 를 클릭 하 고 x 축 대에 변수 FL1 지역 (FITC)와 음모를 만들. FL3 지역 (APC)는 y 축에 로그 눈금.</li>
	</ol>
</li>
	<li>악기 설정 아이콘을 클릭 합니다. 보상 탭을 클릭 하 고 모든 보상 수준을 설정 합니다. 인수 탭에서 클릭 하 고 기록 20000 이벤트의 총 수를 선택 합니다.</li>
	<li>유량 아이콘 낮은흐름 속도 전환 하려면 클릭 합니다.</li>
	<li>취득 탭 비 유도, 흠 없는 세포 실행 시작을 클릭 하 고 인구 중간 왼쪽 사분면에 배포 될 때까지 측면 분산형 및 앞으로의 악기 설정 에서 전압을 조정 합니다.<ol>
<li>다각형 아이콘 세포 인구 세포 파편을 제외 하 고 주변 지역 R1 설정을 클릭 하 고이 문이 인구 p 1을 사용 하 여 모든 형광 점 플롯과 히스토그램 표시 (그림 3)에 대 한 R1 =.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 신호의 PMT 전압을 조정 하려면 셀 낮은 왼쪽된 사분면에 배포 될 때까지 튜닝 악기 설정 탭에서 이득 FL1 FL3 점 플롯에 흠 없는 셀을 실행 합니다.</li>
	<li>GFP 형광을 측정 하는 유도 셀에 샘플을 변경 합니다. 악기 설정 탭에서 인구 오른쪽 아래 사분면에 배포 될 때에는 FSC-A 대 FL1 (FITC) 이득을 설정 합니다. 게이트 (게이트 P2) 긍정적인 세포 인구를 정의 합니다.</li>
	<li>변경 샘플 비 유발 산화 스트레스는 FSC-A 대 FL3 (APC) 도트 음모에 형광으로 표시 하려면 셀 스테인드. 튜닝 이득 셀 인구는 왼쪽 위 사분면에서 배 부 될 때까지. P3에 긍정적인 세포 인구 게이트입니다.</li>
	<li>확인을 셀 형광을 나타내는 히스토그램 아이콘 두 히스토그램 플롯 합니다. 형광 강도 나타내는 FL1 (FITC) GFP 형광을 나타내는 x 축, 이며 FL3 (APC) 형광을 나타내는 y에 로그 눈금에 P2 및 P3 인구를 각각 적용 있는지 확인 합니다. 참고: 막대 그래프 오버레이 다른 Aβ 이체를 표현 하는 셀의 형광 프로필 간의 차이 설명 하기 위해 좋은 방법입니다.</li>
</ol>4. 재조합 단백질 Immunodetection
<ol><li>단백질 표정 수준 결정, 16 h에 대 일 분, 4000 x g에서 원심 분리에 의해 유도 된 효 모 배양 수확을-80 ° c.에 셀 펠 릿 저장<ol>
<li>PBS에 16 h에 대 한 재조합 단백질을 표현 하는 수집 된 셀 resuspend 20의 OD590 를 각 Aβ42 GFP 돌연변이의 200 µ L 셀 정지를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>총 단백질 분수 분석에 대 일 분 14000 x g에서 원심 분리 하 여 각 돌연변이의 100 µ L를 수확 하 고 효 모 세포의 용 해 버퍼 Y의 동일한 볼륨에 셀 펠 릿 resuspend-(50 mM Tris HCl pH 8.0, 1 %DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA 10 mg/mL SB3-14 (myr 포함 된 당 istyl sulfobetaine) 보충 1 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF)).<ol>
<li>온화한 동요에서 실 온에서 20 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 추출 농도 결정 합니다. 15% 아크릴 SDS 페이지 젤 전기 이동 법에 60 분 100 V에서 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 오 각 샘플의 단백질 추출의 최대 5 µ g를 로드 합니다.<ol>
<li>브래드 퍼 드 Coomassie 화려한 블루 G-250의 100 밀리 그램으로 시 약 50ml 95% 에탄올에에서 용 해 하 고 85% (w/v) 인산의 100ml를 추가 준비. 다음, 염료 해산 완전히 ddH2O 1 l 혼합물을 희석 하 고 그냥 사용 하기 전에 셀 루 로스 필터 종이 통해 필터링. 참고: 브래드 퍼 드 시 해야 될 빛 갈색.</li>
		<li>소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 브래드포드 시 약 1000 µ L에서 단백질의 5-100 µ g에서 배열의 표준 준비.</li>
		<li>1-10 µ L 단백질의 브래드포드 시의 1 mL에 추출 하 고 품 어 5 분 동안 실내 온도에 혼합물을 추가 합니다.</li>
		<li>표준과 마약595에서 단백질 추출 물 샘플의 흡 광도 측정 한다.</li>
		<li>분석을 위해 표준 대에 대 한 얻은 흡 광도 값으로 음모를 확인 합니다. 단백질의 µ g입니다. 표준 곡선에 따라 달라 집니다, 있는 경우 볼륨 및 희석, 고려는 양의 단백질에서 원래 샘플의 농도 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>린스 Tris 버퍼 염 분 (TBS), x 1 막 0.1% Tween 20 (TTBS), 1 x TTBS의 5% (w/v) 무 지방 건조 우유를 사용 하 여 차단 하 고.<ol>
<li>10 x TBS의 1 리터를 준비 하려면 기본 트리 스의 24 g와 H2Odd 900 mL에 NaCl의 88 g을 녹이 고 pH 7.6 조정. DdH2O l. 1의 최종 볼륨을 추가 10 x 재고 1 일부 ddH2o.의 9 부분 혼합 1 x 솔루션에 대 한</li>
	</ol>
</li>
	<li>기본 β 아 밀 로이드 항 체 희석 6E10 1:1,000와 함께 1 시간에 대 한 막 품 어 그리고 이차 항 체 염소와 실 온에서 1 h에 대 한 반대로 마우스 IgG HRP 공액 희석 1:10, 000.</li>
	<li>막 Luminata 형광 시 약의 1 mL를 사용 하 여 개발 및 단계 5.2에서에서 설명한 densitometric 분석 하 여 밴드를 계량 합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>FC에서 얻은 데이터를 분석 하려면 표시 의미 형광 강도 (MFI) 테이블을 만듭니다와 그 해당 표준 오류 또는 GFP 형광 및 산화 스트레스 수준에 대 한 차이 (CV)의 계수 중간 형광.<ol>
<li>관리자 탭 및 통계 아이콘 각 채널에 필요한 통계 데이터를 사용자 지정을 클릭 합니다. 참고: 비교할 때 단백질 이체, 접이식 배경 또는 해상도 통계 (RD)에 형광 값 데이터 변환: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> 이 통계에서 평균 샘플 문제 샘플의 평균 형광, 평균 컨트롤은 컨트롤을 사용 하는 셀의 평균 형광 이며 SD는 평균 형광의 표준 편차. RD 요소 MFI 값 보다 더 정확한 인덱스는 그것 뿐만 아니라 샘플 뿐만 아니라 데이터의 확산을 위한 계정 사이의 차이 계산 합니다. 이 계산은 시간이 지남에 수행 다른 실험 데이터를 비교 하는 때 특히 적합 합니다. 일단는 RDs를 계산 통계 시험의 사용은 단백질 이체의 관찰 된 차이점의 중요성을 확인 하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단백질 immunodetection에 대 한 재조합 단백질 수준 서쪽 오 점 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 계량.<ol>
<li>Densitometry 분석 하기 전에 개발 된 막의 원래 raw 이미지를 JPEG 파일 형식와 회색조 모드 변환.</li>
		<li>회색값 의미 분석 메뉴의 설정 측정 섹션을 조정 합니다.</li>
		<li>ImageJ에서 사각형 도구를 클릭 하 고 밴드 densitometry 분석에 대 한 일관 된 크기와 관심 (ROI)의 영역을 정의. 만든된 사각형 프레임 안에 막 이미지에 각 밴드 센터 고 측정 Ctrl + M (측정 명령)를 사용 하 여 하나 하나를 기록 합니다.</li>
		<li>동일한 투자 수익 영역을 적용 하는 각 밴드에 인접 한 로컬 백그라운드를 측정 합니다. 측정 후 각각의 개별 밴드에서 해당 로컬 백그라운드를 뺍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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다양 한 질병 세포 예금6,,78,33으로 misfolded 단백질의 축적에 연결 된다. 많은 노력 계정 단백질 농도를 고려 하지 않습니다, 계산 방법을 사용 하 여 이러한 질병의 발병을 트리거하는 분자 메커니즘을 해명 되었습니다 또는 생체 외에서 접근, 어떤 단백질 농도 반응 동안 상수 남아 있습니다. 그러나, 셀, 내 단백질 지속적으로 합성 되며 혼잡과 비 균질 환경에서 저하. 이 철에, 에서 시험관 및 생체 내에서 집계 속성 사이 amyloidogenic 단백질의 빈번한 불일치를 설명합니다.
왜 간단한 휴대 전화 모델, 효 모, 합리적인 선택 집계를 공부 하 고 더 많은 생물 학적 맥...

Proteostasis 셀 체력과 노화 프로세스의 근본적인 결정 이다. 셀, 네트워크는 올바른 refolding misfolded 단백질 conformers의 보호자 또는 그들의 타겟된 베이스로 몇 가지 잘 보존 메커니즘1 보장 하기 위한 정교한 단백질 품질 관리에 의해 단백질 항상성 유지 ,2,3,,45. 연구의 많은 발병과 인간의 질병의 광범위 한 범위와 proteostasis, 단백질 misfolding 및 집계의 실패의 진행 사이의 링크에 지원을 제공 합니다. 예를 들어, 단백질 예금의 존재는 많은 신경 퇴행 성 질환, 알츠하이머병, 파 킨 슨 병, 등, 헌팅턴의 질병6,7,8의 병 적인 특징을 간주 됩니다. prionogenic 질병, 고 퇴행 성 비 amyloidoses9. 그것은 집계 반응에서 초기 oligomeric 및 protofibrillar 어셈블리 붐비는 셀룰러 환경10다른 단백질 들과 탈 선 상호 작용을 설정 하는 세포 독성의 주요 elicitors는 건의 되었다. 또한, 전파 하는 그들의 독성 효과11,12셀 사이의 단백질 포함 (PI)를 전송할 수 있습니다. 따라서, PI의 대형 셀, 어디 처리 될 수 있다 또는 주요 부작용 없이 축적에서 특정 위치에 위험한 집계 된 종의 존재를 제한 하는 해독 메커니즘 구성 실제로 수 있습니다. 수 있습니다. 13 , 14.
표준 체 외에서 생 화 확 적인 접근 집계 반응와 그들의 속성15,16종에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 했다. 그러나, 이러한 분석 실험에서 사용 하는 조건 셀 내에 발생 하는 명확 하 게 다른 있으며, 따라서 그들의 생리 적인 관련성 질문. 세포질 통로 단백질 품질 관리, autophagy, 진핵생물19,20,21 중 세포질 산화 환 원 상태17,18 의 규제 등의 주목할 만한 절약 때문에 ,,2223, 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 단백질 집단의 분자 결정 요인 연구 특권 간단한 세포 모델 나왔다 그리고 생물학으로 관련 환경24,,2526에 관련 된 세포 독성 영향.
단백질 집계 성향 본질적으로 기본 순서로 인코딩 기능입니다. 따라서, 아 밀 로이드 같은 구조의 형성 예측할 수 있습니다 식별 및 집계 추진의 힘의 평가에 따라 지역 polypeptides27에. 그러나, 예측 단백질 시퀀스의 생체 외에서 집계 속성 bioinformatic 알고리즘의 성공에도 불구 하 고 그들은 여전히 이러한 경향 vivo에서 세포 독성 영향으로 번역 하는 어떻게 예측까지 있습니다. 체계적인 방식으로 주어진된 단백질의 집계 상태 및 그것의 관련 된 세포 손상을 사이 연결 하는 연구는 전산이 한계를 우회 하는 데 도움이 있습니다. 이 연결은 현재 연구, 아 밀 로이드 β 펩 티 드 Aβ42 단일 잔류물에만 서로 다른 하지만 집계 경향 vivo에서28의 연속 범위 표시의 이체의 큰 세트의 활용에서 해결 됩니다. 특히, 구조적 종 효 모 세포에서 집계 하기 쉬운 단백질에 의해 elicited 산화 손상에 대 한 회계를 식별 하는 FC 기반 접근 방식을 설명 합니다. 방법론에는 단순, 높은 처리 능력, 그리고 정확한 양적 측정 등 많은 이점을 제공합니다. 이 방법은 PI 놀이 산화 스트레스에 대 한 보호 역할을 확인 가능 합니다.

<table><tbody><tr><td>효모 세포 BY4741&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>201388</td>형 <td>: MATa his3 &Delta; 1 leu2&Delta; 0 met15&델타; 0 ura3&델타; 0</td></tr><tr><td>pESC(-Ura) 플라스미드&nbsp;</td><td>Agilent Genomics</td><td>217454</td><td>Gal promotor를 사용한 효모 발현 플라스미드. 선택 가능한 마커 URA3</td></tr><tr><td>효모 합성 드롭아웃 매체 보충제</td><td>Sigma</td><td>Y1501</td><td>분말</td></tr><tr><td>효모 질소 염기 아미노산 없음</td><td>시그마</td><td>Y0626</td><td>분말</td></tr><tr><td>라피노스</td><td>시그마</td><td>R7630</td><td>분말</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G7021</td><td>분말</td></tr><tr><td>갈락토스</td><td>시그마</td><td>G0750</td><td>분말</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991&nbsp;</td><td>솔루션 10X</td></tr><tr><td>CellROX 딥 레드 시약&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10422</td><td>자유 라디칼 세포 투과성 형광 센서, 감소 상태에서는 비형광, 반응성 산소종(ROS)에 의한 산화 시 밝은 형광을 나타내며, 흡수/방출 최대값은 644/665 nm입니다.</td></tr><tr><td>Y-PER 단백질 추출 시약&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78990</td><td>액체 세포 용해 버퍼</td></tr><tr><td>아크릴아미드/비스-아크릴아미드</td><td>시그마</td><td>A6050</td><td>솔루션</td></tr><tr><td>브래드포드 염료 시약</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td>단백질 농도의 한 단계 측정을 위한 5000205 염료 시약</td></tr><tr><td>&베타;-아밀로이드 항체 6E10&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>803001</td><td>마우스 IgG1. 에피토프는 베타 아밀로이드(EFRHDS)의 아미노산 3-8 내에 있습니다.</td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgG-HRP 접합체&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1721011</td><td></td></tr><tr><td>Membrane Immobilon-P, PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Luminata forte</td><td>Merk</td><td>WBLUF0100</td><td>Premixed, 즉시 사용 가능한 화학발광 HRP 검출 시약</td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td>Protease inhibitor. 에탄올</td></tr><tr><td>FACSCanto 유세포 분석기에</td> 0.1m에서 용해됨&nbsp;<td>BD Biosciences</td><td>657338</td><td>488&nbsp; GFP 검출을 위한 nm 블루 레이저, 그리고 635&nbsp; nm 적색 레이저 / 530/30nm BP 필터 및 660/20 BP 필터</td></tr><tr><td>미니 트랜스 블롯 전기 영동 전사 셀</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td>단백질 전달 시스템</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 핸드 캐스트 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td>전기 영동 시스템</td></tr></tbody></table>

효 모 세포 산화 스트레스에 단백질 집단의 영향 평가

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

단백질 misfolding 및 녹말 체 conformations로 집계 발병 및 여러 신경 퇴행 성 질환의 진행에 관련 되어있다. 그러나, 여전히 약간의 정보는 어떻게 불용 성 단백질에 대 한 집계는 그들의 독성 효과 비보를 발휘. 단순 간결한 및 진 핵 모형 유기 체, 박테리아와 효 모, 등 세포내 녹말 체 형성, 집계 전파 및 독성 뒤에 있는 메커니즘의 우리의 현재 이해에 크게 기여 했다. 이 프로토콜에서 효를 사용 하 여 단백질의 형성 및 세포질 산화 스트레스에 미치는 영향 관계를 해 부 모델로 설명 합니다. 메서드는 amyloidogenic 단백질의 세포내 수용 성/집계 상태 감지 세포 산화 손상 cytometry (FC)을 사용 하 여 식에서 결과의 정량화 결합 합니다. 이 방법은 간단 하 고 빠르며, 양적입니다. 연구는 그들의 각각 고유한 집계 경향으로 아 밀 로이드 β 펩 티 드 이체의 큰 세트에 기인한 세포질 산화 스트레스를 연관 하 여 기법을 보여 줍니다.

이 프로토콜 어디 Phe19은 모든 자연 proteinogenic 아미노산28변경 되었습니다 Aβ42 펩 티 드의 20 이체의 컬렉션을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이 단백질의 이론적인 집계 경향 두 다른 bioinformatic 알고리즘 (AGGRESCAN와 탱고31,32)를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 두 경우 모두에서이 분석 집계 추세, ascribing, 일반적으로 높은 값과 가장 낮은 소수 성 잔류물을 충전 하 고 극 지 것의 진보적인 그라데이션 렌더링 (그림 1B, 1c).
실험적으로 다른 Aβ42 이체의 세포내 집...

단백질 집계 세포 산화 스트레스 elicits. 이 프로토콜 amyloidogenic 단백질의 세포내 주와 관련 된, cytometry 사용 하 여 산화 스트레스 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 아 밀 로이드 β 펩 티 드의 가용성과 집계 경향이 이체의 동작을 연구 하는 데 사용 됩니다.

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

이 절차의 전반적인 목표는 제빵 효모 Saccharomyces cerevisiae를 사용하여 세포 내 단백질 응집체의 형성과 세포 산화 스트레스에 미치는 영향 사이의 관계를 결정하는 것입니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환 및 비 신경 병성 아밀로이드 증후군과 같은 단백질 잘못 접힘 및 응집 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간단하고 빠르며 대규모 효모 집단에서 세포 산화 스트레스 손상을 정량화할 수 있다는 것입니다.이 방법을 통해 아밀로이드 생성 단백질의 세포 내 용해성 또는 응집 상태와 효모의 산화 스트레스 수준 간의 상관 관계에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한, 재조합 단백질을 발현하는 다른 모델 유기체에도 적용할 수 있습니다. 유세포 분석 분석을 시연하는 사람은 UAB의 유세포 분석 시설(Flow Cytometry Facility)의 기술자인 마누엘라 코스타(Manuela Costa)입니다.이 연구에서는 갈락토제 유도 프로모터의 제어하에 GFP에 융합된 A-베타-42에 대한 플라스미드 인코딩으로 형질전환된 S.cerevisiae를 사용하여 다양한 A-beta-42 펩타이드 변이체의 세포 내 응집 상태를 추적합니다. 형질전환된 효모 세포의 한 콜로니를 선택하고 20ml의 SC에서 2%포도당을 함유한 Ura 배지를 뺀 상태로 접종합니다. 하룻밤 동안 교반하듯 섭씨 30도에서 배양을 성장시킵니다.다음 날, 하룻밤 배양 100마이크로리터를 5밀리리터의 신선한 SC에서 우라 배지를 뺀 농도로 접종하고 섭씨 30도에서 2-3시간 동안 세포를 성장시킵니다. 배양물이 0.5의 590 나노미터 OD 590에 광학 조밀도에 있을 때, 3, 4 분 동안 000배 g에 배양물을 원심 분리하고, 상층액을 버리고, 신선한 SC 마이너스 2%raffinose를 포함하는 Ura 매체의 5 밀리리터에 있는 세포를 refuse. 섭씨 30도에서 30분 동안 교반하면서 세포를 배양합니다.30 분 후에, 3, 000 시간 g에 4 분 동안 세포를 원심 분리하고, 상등액을 버리고, 재조합 단백질 발현을 유도하기 위하여 2%galactose를 포함하는 신선한 SC 마이너스 Ura 매체에 있는 세포를 refuse. 세포를 16시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 16시간 후, 배양액의 1밀리리터 분취액을 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 4분 동안 3, 000회 g으로 원심분리하여 세포를 수확합니다.16시간 유도 효모 세포의 OD 590을 측정하여 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 멸균 PBS의 세포를 0.1의 OD 590으로 희석합니다. 발현 세포 현탁액을 적절하게 표지된 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮기고 빛으로부터 보호합니다.비유도 세포를 유세포 분석을 위한 negative control로 준비합니다. 각 샘플에 산화 스트레스 프로브를 최종 농도 5마이크로몰로 추가합니다. 샘플을 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 30도에서 30분 동안 배양합니다.배양이 완료되면 세포를 스핀다운하고 상층액을 제거한 다음 세포 펠릿을 PBS에 재현탁합니다. PBS로 이런 식으로 세포를 세 번 씻습니다. 세 번째 세척 후 동일한 부피의 PBS에 세포를 재현탁합니다.염색되지 않은 세포가 유세포 분석 분석에 포함되어 있는지 확인합니다. 적절한 레이저와 필터를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 GFP 및 산화 스트레스 프로브의 형광 신호를 검출합니다. 먼저 Open New Worksheet 패널을 클릭하고 실험에 이름을 지정합니다.도구 모음에서 Scatter Plot Tool을 선택하고 y축의 Side Scatter Area 변수와 x축의 선형 스케일로 Forward Scatter Area 변수가 있는 플롯을 만듭니다. 산점도 도구를 클릭하고 x축의 변수 FITC 영역과 y축의 로그 스케일로 APC 영역이 있는 플롯을 만듭니다. Instrument Setting 아이콘을 클릭하고 Compensation 탭에서 모든 보상 수준을 0으로 설정합니다.그런 다음 Acquisition 탭을 클릭하고 낮은 유속으로 기록할 총 20, 000개의 이벤트를 선택합니다. 한 형광 색소의 형광 방출 신호는 다른 검출기에 의해 감지될 수 있기 때문에 모든 검출기에서 각 형광 색소의 최소 신호를 단색 제어로 균등화하기 위해 보상 프로세스를 수행하는 것이 중요합니다. 튜브 001의 이름을 negative control로 바꾸고 Acquire 탭을 클릭하여 비유도 및 염색되지 않은 세포의 실행을 시작합니다.모집단이 왼쪽 중간 사분면에 분포될 때까지 전방 및 측면 산란의 기기 설정에서 전압을 조정합니다. 폴리곤(Polygon) 아이콘을 클릭하여 세포 파편을 제외한 세포 집단 주위의 영역 R1을 설정하고, 이 게이트 집단 P1을 모든 형광 점도표 및 히스토그램 표현에 R1과 동일하게 사용합니다. 형광 신호의 PMT 전압을 조정하려면 FL1에서 FL3 점도표에서 염색되지 않은 세포를 실행하고 세포가 왼쪽 하단 사분면에 분포될 때까지 기기 설정 탭에서 게인을 조정합니다.산점도 도구를 사용하여 x축의 변수 FITC-A와 FSC-A의 도트플롯을 생성하고, x축의 변수 APC-A와 FSC-A의 두 번째 도트플롯을 생성합니다. 다음으로, GFP 형광을 측정하기 위해 샘플을 유도 세포로 변경합니다. Instrument Setting 탭에서 모집단이 오른쪽 하단 사분면에 분포되어 있을 때 FSC-A 대 FITC의 게인을 설정합니다.게이트를 사용하여 GFP 양성 세포 집단을 정의합니다. 샘플을 유도되지 않은 염색된 세포로 변경합니다. FSC-A 대 APC-A 점도표에서 형광에 의한 산화 응력을 표시합니다.세포 집단이 왼쪽 상단 사분면에 분포될 때까지 게인을 조정합니다. P3에서 양성 세포 집단을 게이트합니다. Histogram(히스토그램) 아이콘을 사용하여 세포 형광을 나타내는 두 개의 히스토그램 플롯을 만들며, 하나는 FITC에 대한 것이고 다른 하나는 APC 형광에 대한 것입니다. 평균 형광 강도 및 중앙값 형광을 해당 표준 오차 및/또는 GFP 형광 및 산화 스트레스 수준에 대한 분산 계수와 함께 표시하는 표를 만듭니다.보정 탭을 클릭하고 모든 보정 수준을 0으로 설정합니다. 획득 탭을 클릭하고 기록할 총 20, 000개의 이벤트 수를 선택합니다. 3개의 새로운 샘플 튜브를 준비하고 non-induced, induced soluble 및 induced aggregated로 명명합니다.사전 설정된 설정으로 샘플에서 데이터를 수집합니다. 새 시트를 열고 변수 FITC-A 및 APC-A에 대한 점도표를 만들고 CellROX 염색을 위한 양성 세포를 게이팅하여 데이터를 분석합니다. 각 샘플에 대해 FITC 및 APC 채널에 대한 평균 형광과 표준 오차가 포함된 통계 테이블을 생성합니다.응집된 단백질 계수 후 FACS 분류기로 세포를 분류하는 것도 가능합니다. 16시간의 유도 기간 후 A-beta-42 변이체를 발현하는 효모 세포를 형광 현미경으로 시각화하여 세포 내부의 재조합 단백질 분포를 확인합니다. 이러한 이미지는 선별된 A-beta-42 GFP 변형체를 대표합니다.단백질 내포물(PI)의 형성은 분석된 컬렉션의 20개 변이체 중 10개에서 확인되었습니다. 이 막대 그래프는 각 변이체에 대해 총 500개의 형광 세포에서 생물학적 복제물로 계산된 서로 다른 수의 PI를 포함하는 세포의 백분율을 나타냅니다. 예측된 응집 특성과 생체 내 응집 특성 사이의 우수한 일치가 관찰되었습니다.세포 추출물의 단백질 발현 수준은 A-베타 특이적 항체를 사용하여 정량화되었습니다. 일반적인 경향으로, 녹색으로 표시된 PI 형성 A-beta-42 변이체는 빨간색으로 표시된 세포질에 확산 분포된 변이체보다 낮은 수준으로 존재합니다. A-beta-42 변이체 간의 중요한 차이점은 산화 스트레스 프로브 형광, 단백질 수준 및 GFP 형광 특성이 PI를 형성하는 능력과 AGGRESCAN 또는 TANGO 생물정보학 알고리즘에 의해 예측된 고유 응집 성향과 관련하여 나타낼 때 관찰되었습니다.PI 형성 변형은 녹색이고 비 PI 형성 변형은 빨간색입니다. 이 절차에 따라 프로피듐 요오드화물 또는 아넥신 V 염색과 같은 다른 방법을 수행하여 세포 내 발현 단백질 변이체가 세포 사멸 또는 세포 독성에 미치는 영향을 결정하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수도 있습니다.

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

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연구

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Biochemistry

생화학

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