Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments, telles que le cadre de culture tissulaire le plus pertinent pour l’identification du hit to lead. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de cultiver des cellules en trois dimensions, de manière à haut débit, à l’aide de 1536 plaques de puits. La démonstration de ce protocole sera assurée par Kalyani Gampa, un scientifique principal de mon laboratoire.

Pour mettre en place une culture de sphéroïdes tumoraux en 3D, détachez les lignées cellulaires cancéreuses d’intérêt avec trois lavages de BBS. Suivi de l’ajout d’un millilitre de trypsine par zone de cinq centimètres carrés de la fiole de culture. Après cinq minutes, neutralisez la trypsine avec cinq fois le volume de milieu supplémenté en sérum dans chaque flacon et comptez les cellules.

À l’aide d’une petite cassette stérilisée à embout en acier inoxydable avec un système basé sur une pompe péristaltique, ensemencez un total de 500 cellules dans huit microlitres de milieu sphéroïde dans chaque puits d’une plaque traitée pour la culture tissulaire de 1 536 puits. Utilisez ensuite un joint de plaque adhésif respirant pour couvrir la plaque. Et placez la plaque dans un incubateur rotatif réglé à 37 degrés Celsius et 10 tr/min avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité relative pendant trois jours.

L’étape la plus critique consiste à s’assurer que les plaques sont bien scellées avant d’être placées dans l’incubateur. Les sphéroïdes auront besoin de trois jours pour se former et cette étape empêche l’évaporation du milieu. À la fin de l’incubation, faites tourner rapidement les plaques de culture tapissées de cancer à 100 fois la gravité pour recueillir toute condensation et retirez les joints adhésifs.

Placez chaque plaque à traiter sur un distributeur acoustique configuré pour délivrer un total de huit nanolitres de chaque composé. Dilution à une concentration finale de 0,1 % de DMSO par puits et à une dose maximale de composé de 10 micromolaires. Lorsque le composé a été ajouté aux plaques appropriées, placez un couvercle de culture cellulaire en acier inoxydable sur mesure sur chaque plaque pour éviter l’évaporation, et remettez les plaques dans l’incubateur rotatif pendant cinq jours supplémentaires.

À la fin de l’incubation, ajoutez trois microlitres de réactif de lyse cellulaire préchauffé, complété par de la luciférine dans chaque puits de chaque plaque de culture cellulaire. Et incubez les plaques à température ambiante pendant au moins 15 minutes. Capturez ensuite la luminescence ATP sur un luminomètre à plaque.

Lorsque toutes les plaques ont été analysées, extrayez les données brutes de l’instrument et normalisez tous les champs contenant les composés d’essai à la moyenne de tous les puits contenant uniquement du DMSO comme contrôle neutre. Le pourcentage d’inhibition de la croissance de chaque composé peut ensuite être calculé en fonction de la formule, et des courbes dose-réponse, et des CI50 inhibitrices peuvent être générées. Une variété de cellules cancéreuses établies, connues pour bien se développer dans des conditions de culture 2D, ont également formé des structures 3D lorsqu’elles ont été cultivées, comme nous venons de le démontrer, malgré leurs différences morphologiques.

Lorsqu’il est utilisé pour le criblage à grande échelle, on peut observer une sensibilité différentielle entre les cultures cultivées en 2D et celles cultivées en 3D. Chaque point représentant la concentration inhibitrice d’un seul composé pour lequel une réponse de destruction cellulaire de 50 % est observée dans les deux contextes de culture. Dans cette expérience représentative, les deux composés inhibiteurs de kinases RAF testés étaient plus puissants dans des conditions 3D dans une culture de lignée de cancer du poumon non à petites cellules hébergeant une mutation activatrice dans la protéine KRAS.

Cependant, les composés démontrent une puissance similaire dans les cultures de sphéroïdes 3D et de lignées de cancer du côlon 2D qui contiennent une mutation activatrice G13D dans KRAS. Le test 3D permet également d’observer le phénomène paradoxal d’activation de la croissance, qui se produit lorsqu’il y a une inhibition incomplète des dimères RAF dans les lignées mutantes RAF hautement activées, comme en témoigne la croissance cellulaire à de faibles concentrations du médicament, qui est réprimée à des concentrations élevées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la découverte de médicaments anticancéreux pour explorer des conditions de culture alternatives afin d’identifier de nouvelles matières chimiques efficaces contre des cibles connues.