Name: 드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 학습하세요 오류 수정 DNA 및 RNA 시퀀싱 방법을 통해 희귀 돌연변이를 정확하게 검출하는 기술입니다. Illumina 플랫폼과 고유 분자 식별자를 활용하여 변이 대립유전자 비율 0.0001 수준의 민감한 검출이 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리 아 이들의 종양학 그룹 AAML1531 연구 및 환자 샘플의 형태로 그들의 공헌에 대 한 간호사 건강 연구에서 참가자를 감사합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회 (UM1 CA186107, RO1 CA49449 RO1 CA149445), 아 이들의 발견 연구소의 워싱턴 대학교 세인트 루이스 어린이 병원 (엠씨-II-2015-461)와 일 라이 세스 매튜 스 백혈병 재단에 의해 투자 되었다.

<ol><li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li>
<li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li>
<li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li>
<li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27546487">Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> NatureCommunications. 7, 12484(2016).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1486">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li>
<li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq%3A+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li>
<li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li>
<li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li>
<li>Vander Heiden, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pRESTO%3A+a+toolkit+for+processing+high-throughput+sequencing+raw+reads+of+lymphocyte+receptor+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires.</a> Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22NatureBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li>
<li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGERI%3A+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOSComputationalBiology%22%5BJournal%5D)">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).</li>
<li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li>
<li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li>
<li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ScienceTranslationalMedicine%22%5BJournal%5D)">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).</li>
<li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

다른 질병에 낮은 VAFs와 돌연변이 연구를 쉽게 구현할 수 있는 오류 수정 시퀀싱 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 그들은 원시 읽기 오류 보정을 가능 하 게 가장 중요 한 요소 시퀀싱 전에 각 분자 Umi의 법인입니다. 여기에 설명 된 방법을 상용 유전자 패널을 자체 설계 유전자 특정 oligos 사용자 지정된 Umi를 통합 하는 연구를 허용 합니다.
표준 NGS 프로토콜 precludes 시퀀싱 오류 비율 때문 2% 아래 VAF와 변이의 탐지 하 고이 희소 한 이체의 탐지는 중요 한 연구에서 NGS의 응용 프로그램을 제한 합니다. 우회 표준 NGS 오류율, ECS이 원시 이체의 민감한 감지 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 돌연변이 처음 (따라서 데 낮은 VAF) 발생 때 병원 성 변이의 탐지 병14,15의 조기 개입에 게 필수적입니다. 백혈병 연구, 최소한의 잔류의 검출에에서 질병 (잔여 leukemic 세포 후 처리) 위험 계층을 알립니다 및 이진 흐름 cytometric 평가 수 없습니다 하는 방식으로 치료 옵션을 통보 하는 데 사용할 수. 또한, ECS 순환 종양 핵 산을 검출 하 고 단단한 종양 환자에서 전이성 잠재력을 평가 하는 존재/부재로의 기본 특성은 특정 돌연변이의 변형 부담을 평가 하 여 적용 됩니다. 종양16.
표 1에서처럼 변종 전화 위치 특정 오류 이항 분포-기반 모델을 사용 하 여 전원 시퀀싱 오류 모델을 구축 하는 데 사용의 깊이 뿐만 아니라 시퀀스 라이브러리의 수에 따라 달라 집니다. 오류 모델의 견고성 샘플 및 시퀀싱 깊이 더 높은 수가 증가합니다. 각 샘플에 대 한 오류 프로필 범위의 오류 수정 읽기 샘플 당 3000 x의 평균 최소한 10 시퀀스 샘플을 사용 하는 것이 좋습니다. 위치-특정 방식은 비슷한 MAGERI, 하지만 모든 6 다른 대체 종류에 대 한 집계 오류 비율을 사용 하는 대신 (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, 우리 모든 위치에 독립적으로 각 대체 모델. 예를 들어, C의 오류 비율 > T는 genomic 위치는 다른 위치에서 다른. 우리의 접근 방법 또한 걸립니다 계정에 연속 배치 효과 관찰 한 시퀀싱 실행 기본 대체 속도에서 실행 하는 다른 다를 수 있습니다. 따라서 그것은 특히 다른 시퀀싱 실행에서 샘플 모델 구축 풀링되지 때 모든 대체 형식에 대 한 각 위치를 모델링 하는 것이 중요.
ECS 실험을 설계할 때 중요 한 고려 사항은 원하는 검출 임계값입니다. NGS 연구의 아름다움은 그 그들은 쉽게 확장할 수 유전자/대상 관심, 검출 임계값 (시퀀싱의 깊이 의해 결정), 및 쿼리 하는 개인의 수의 점에서. 예를 들어 연구원은 0.0001의 감지 임계값을 갖는 2 개의 amplicons에 드문 돌연변이 찾을 관심이 있다면, 그들은 최대 15 백만 읽기 출력 MiSeq V2 화학을 사용 하 여 실행 한 시퀀싱에 극대로 75 샘플 수영장 수 (2 amplicons * 10000 분자 * 10 오류 수정에 대 한 읽기 * 75 샘플 15 백만 시퀀싱 읽기 =). 연구원은 시퀀싱 또는 단일 시퀀스 검출 임계값 조정 실행에 풀링된 샘플 수로가 하는 분자의 수를 변화할 수 있다. 우리의 연구에서 우리 0.0001 VAF (1:10, 000)의 감지 임계값으로 돌연변이 찾을 목적 Illumina 유전자 패널을 사용 하 여. 우리가 일상적으로 250를 사용 하 여 상기 검출 임계값을 달성 하기 위해 충분 한 분자 캡처되는지 확인에 DNA 시작의 ng. 연구팀은 DNA의 낮은 금액으로 시작 하도록 선택할 수 있습니다 (50 ng는 것이 좋습니다) 원하는 검색 제한이 > 0.001 VAF.
Umi i5 인덱스에 추가 됩니다, 시퀀싱 설정을 적절 하 게 수정 되어야 할. 예를 들어 16 N Umi, 사용 하 고 시퀀싱 설정 된 2 x 144 짝된 끝 읽기, 인덱스 1의 8 주기 및 인덱스 2의 일반적인 8 사이클 반대로 인덱스 2의 16 주기. 인덱스 2 주기 증가 사이클 읽기에 할당 된의 총 수에 있는 감소에 의해 보상 된다. 연구원은 12N Umi10,17를 사용 하기로 선택한 경우 인덱스 2의 12 주기를 설정은 변경 되어야 합니다.
이 우미 기반 시퀀싱 방법은 시퀀싱 오류 수정 최적화 됩니다. 모든 확대 기반 방법에 대 한 문제는 차선의 PCR jackpotting 처리에 남아 있습니다. 라운드 후 시퀀싱 및 게시물-생물 정보학 유효성 검사 ddPCR를 사용 하 여 수행 하 고 거의 PCR jackpotting 때문에 어떤 잘못 된 반응 감지. 그럼에도 불구 하 고, 연구원은 낮은 증폭 오류를 고화질 중 합 효소를 사용 하 여 실험을 실시 하는 것이 좋습니다.

우리가 나이, mutagens, 게놈, 그리고이에 체세포 착오의 축적에서 세포 분열 결과 중 확률 오류 노출에 기초가 악성 변화의 근본적인 병 인 신경 발달 질환, 소아 질환과 정상적인 노화1,2. 질병-운전 잠재력 체세포 돌연변이 조기 발견 및 위험 관리3,,45에 대 한 중요 한 진단 및 예 후 바이오 마커. 더 나은 physiologic clonogenesis 이해, 어떤 임상 통보 되며 결정, 정확한 정량화 및이 돌연변이의 특성화 연구 기본 중요성 이다. 차세대 시퀀싱 (NGS)은 현재 이기종 DNA 샘플; 클론 변이 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, NGS 식별에서 돌연변이로 제한 됩니다 > 0.02 변형 대립 유전자 분수 (VAF)-0.5-2.0의 고유한 오류 비율 때문 시퀀싱 플랫폼6,7,8%. 그 결과, 추적 진단 및 prognostically 중요 한 체세포 변종 낮은 VAF에 얻을 수 없다 표준 NGS를 사용 하 여.
최근, 다양 한 방법은 NGS8,9,,1011의 오류율을 회피 하기 위해 개발 되었습니다. 이러한 방법을 활용 분자 태그, 시퀀싱 후 오류 수정 가능 하 게 합니다. 각 분자 또는 시퀀싱 라이브러리에서 게놈 단편으로는 임의의 독특한 분자 식별자 (우미) 그 분자에 관련 된 태그입니다. Umi는 무작위 뉴클레오티드 (8-16 N)의 문자열의 순열에 의해 구성 됩니다. 두 번째 샘플 전용 바코드 또한 동일한 NGS 시퀀싱 실행에 여러 샘플을 멀티플렉싱 있도록 워크플로에 통합 된다. PCR 증폭 분자로 태그 라이브러리에서 수행 되 고 그 후 라이브러리 시퀀싱에 대 한 전송 됩니다. 라이브러리 준비 동안 PCR 증폭 및 시퀀싱8동안 오류 게놈 단편을 무작위로 소개 것 이다는 예상 된다. 임의의 연속 오류를 제거 하려면 원시 시퀀싱 읽기 우미에 따라 그룹화 됩니다. 시퀀싱에서 아티팩트 하지 진정한 variant를 충실 하 게 증폭 하 고 같은 바다를 공유 하는 모든 읽기에 시퀀싱 것 소개의 확률적 특성으로 인해 동일한 게놈 위치에 동일한 우미와 모든 읽기에 있을 예정 이다. 아티팩트는 제거 하는 bioinformatically. 여기, 우리가 설명 하는 세 가지 방법의 오류 수정 시퀀싱 (ECS) 단일 뉴클레오티드 변종 (SNVs) 및 작은 삽입-삭제 (Indels), 식별 하기 위해 dna 그리고 RNA 유전자 발현 아래의 정량화를 촉진 하기 위해 실험실에 최적화 된 NGS 오류 임계값입니다.
첫 번째 방법은 연구자에 의해 설계 된 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 희귀 체세포 이벤트에 대 한 보고 하는 방법을 설명 합니다. 라이브러리 준비, 이전 연구자 관심의 파편을 대상으로 프라이 머를 설계 해야 합니다. 우리가 사용 하는 웹 애플 리 케이 션 Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). 200-250 bp의 Amplicons 연쇄 반응 (PCR)에 대 한 이상적인 Umi 통합 되었습니다 일단이 것으로, 150 bp 쌍 간 읽기와 쌍 간 읽기 중복 생성. 사용 될 최적의 뇌관 디자인 조건: 최소 뇌관 크기 = 19; 최적의 뇌관 크기 = 25; 최대 뇌관 크기 = 30; 최소 Tm = 64 ° C; 최적의 Tm = 70 ° C; 최대 Tm = 74 ° C; 최대 Tm 차이 = 5 ° C; 최소 GC 내용 = 45; 최대 GC 내용 = 80; 반환 번호 = 20; 최대 3' 끝 안정성 = 100.
방법 2에서 우리가 ECS DNA 프로토콜 클론 SNVs 및 작은 Indels 희귀 0.0001 VAF amplicons의 수백을 포함 하는 상업적으로 이용 가능한 유전자 패널을 사용 하 여 조사를 Illumina 화학 결합 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 우리의 실험에 대 한 TruSight 골수성 시퀀싱 패널 (Illumina)를 사용 하 고 소아 골수성 질환에 대 한 관심의 추가 유전자를 포함 하는 확장 된 패널을 설계. 이러한 패널 팬 들은 그래서 우리 자신의 어댑터 전략이이 패널에 추가 했습니다 오류 정정을 촉진 것이 독특한 분자 식별자 (Umi)의 정보를 제공 하지는. ECS 작동 한다 다른 질병와 관련 된 유전자에 대 한 풍부 하 게 설계 된 다른 패널의 동등 하 게 잘. DNA 분리 및 조직 또는 관심의 샘플에서 후속 정량화, 다음 것이 좋습니다 적어도 500 재고 DNA 견본 당 ng. 우리는 정기적으로 250를 사용 하 여 단일 시퀀싱 라이브러리 확인 중복 및 VAF 계산으로 가능한 한 많은 독특한 게놈 단편으로 하류 캡처하기 위해 DNA의 ng 읽습니다. 선택적 복제 시퀀싱 라이브러리 나머지 250으로 만들어질 수 있다 DNA의 ng. 우리는 항상 표본, 당 2 개의 복제 라이브러리 만들고 참 긍정으로 둘 다 복제에 독립적으로 검색 하는 이벤트에만 생각. 우리는 또한4,13전화 이체의 정확도를 높이 genomic 위치 특정 이항 오류 모델 구현.
마지막으로,는 상용 QIAseq 대상 RNA 패널 (Qiagen)를 사용 하 여 사본 정량화에 대 한 RNA 시퀀싱에 ECS를 연결 하는 방법에 설명 합니다. 중복에는 Umi 필요한 오류 수정 키트에 통합 되었습니다 및 연구원은 제조 업체의 권장 사항에 따라 라이브러리를 만들 수 있습니다. Bioinformatically, 연구자는 ECS-DNA, 프로토콜 섹션에서 자세히 설명 될 것 이다를 위한 파이프라인을 따를 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Q5 고충실도 핫 스타트 마스터 믹스</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 안전 DNA 겔 스테인</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq 맞춤형 앰플리콘 인덱스 키트</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>UMI i5 어댑터 시퀀스</td><td>통합 DNA 기술</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing 모듈</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II 결찰 모듈</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 액적 생성 오일 EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 액적 디지털 PCR 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-웰 플레이트</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>QX200/QX100 액적 발생기용 DG8 카트리지</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>QX200/QX100 액적 발생기용 DG8 개스킷</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight 골수성 염기서열분석 패널</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td>Johns Hopkins</td> <td>University-Customized</td><td></td></tr> <tr><td>QIAseq Targeted RNA Panel</td><td>Qiagen-Rneasy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

드문 이벤트 감지 오류 수정 dna와 rna 시퀀싱을 사용 하 여

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

기존의 차세대 시퀀싱 기술 (NGS) 10 년 이상에 대 한 거 대 한 게놈 특성에 대 한 수 있다. 특히, NGS 악성에 클론 돌연변이의 스펙트럼을 분석 하 사용 되었습니다. 비록 전통적인 Sanger 방법, 식별 하는 ~0.5–2.0 %의 그것의 높은 에러율으로 인해 드문 클론와 subclonal 돌연변이와 NGS 투쟁 보다 훨씬 더 효율적. 따라서, 표준 NGS는 돌연변이 대 한 검색의 제한이 > 0.02 변형 대립 유전자 분수 (VAF). 이 환자에서 희소 한 돌연변이 대 한 임상 중요성 동안 알려진된 질병 불분명, 남아 없이 백혈병 치료 하는 환자 크게 향상 결과 잔여 질병 때 < 0.0001 cytometry에 의해. NGS의이 artefactual 배경, 완화 하기 위해 수많은 방법이 개발 되었습니다. 여기 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱 (ECS), 개별 분자 임의의 인덱스 오류 수정에 대 한 혈압의 16와 다중화 8 혈압 환자 특정 인덱스를 태그를 포함 하는 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 감지 하 고 변형 대립 유전자 분수 (VAFs) 두 배나 NGS의 검출 한계 보다 낮은 희귀 0.0001 VAF에 클론 변이 추적할 수 있습니다.

Targeted Error-Corrected dna 시퀀싱, 함께 우리는 돌연변이 환자 상업 genomic DNA에 DNA를 diluting 원리 실험의 증거를 수행 했습니다. 환자 GATA1 돌연변이 했다 (chrX:48650264, C &gt; G) 0.19의 원래 VAF와. ECS 단일 뉴클레오티드 변종 1:10,000의 수준으로 양적은 그림 1 에서 설명 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> 그림 1: GATA1 SNV 보여주는 ECS 1:10,000의 수준으로 양적은 희석 시리즈. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
우리는 또한 ECS DNA 안정적으로 성인 급성 골수성 백혈병 (AML) 건강 한 노인 개인4에 recurrently 유전자에 드문 클론 변이 감지 하는지 보여준다. 우리는 간호사의 건강 연구 틀 약 떨어져 ~ 10 년에서에서 20 건강 한 개인에서 버 피 코트 샘플을 얻었다. 우리는이 샘플에 ECS-DNA 패널 프로토콜을 적용. 이 실험에 대 한 우리 Illumina TruSight 골수성 시퀀싱 패널 568 amplicons (자세한 내용은 https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html에 유전자 목록에) 구성 된 적응 및 시퀀싱 20 개인에서 80 라이브러리 (다른 시간 지점에서 2 컬렉션, 시간 당 개인 당 2 복제 지점) 47.7 백만 쌍 간 읽기의 평균 및 오류를 수정 하는 3.4 백만의 평균을 생성 Illumina NextSeq 플랫폼을 사용 하 여 도서관4당 합의 시퀀스입니다. 라이브러리 당 평균 뉴클레오티드 커버리지 (3.4 수백만 568로 나눈 값) x 6000 대략 이었다. 각 샘플에 대 한 우리는 동일한 샘플에서 되지 않은 시퀀스 된 라이브러리를 사용 하 여 위치 특정 오류 프로필을 건설 한다. 우리는 하나 이상의 컬렉션 시간 지점의 두 복제에 109 클론 체세포 돌연변이 발견. 이러한 돌연변이 VAF 0.0003-0.1451에서 배열 있다. 우리가 알려진된 우주 표현으로 21 돌연변이 선택 하 고 하나 또는 두 개의 컬렉션 시간 포인트 ddPCR를 사용 하 여 모든 21 돌연변이 확인 (n = 34, 그림 2, 젊은 외. 20164에서 적응).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> 그림 2: ECS로 식별 하는 돌연변이 매우 조화 된 VAFs와 ddPCR를 통해 확인 했다. (n = 34, 젊은 외. 20164수정). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
ECS RNA 프로토콜을 사용 하 여 오류 수정 식 수준에 관하여 우리 다양 한 암 (QIAseq 인간의 암 Transcriptome 패널에서 적응), 그리고 우리와 관련 된 것으로 알려진 416 유전자의 구성 된 QIAseq 화학을 사용 하 여 유전자 패널 사용자 정의 ( 보충 자료1에서 유전자 목록) 주어진된 유전자의 가장 일반적으로 표현한 exon 증폭. 우리 쌍 간 형식 라이브러리, 당 8.3 백만 읽기의 평균을 준 Illumina MiSeq 플랫폼을 사용 하 여 라이브러리를 시퀀싱 그리고 우리 0.417 백만 오류 수정 합의 시퀀스의 평균을 잡으려고 관리. 우리 식 수준 낮은 풍부한 사본 보여주었다 (&lt; 50에서 1000 사본 수 총 RNA의 ng) 복제 사이 높은 재현성은 (데이터 요소 n = 300, 그림 3). DdPCR (식의 다양 한 정도의 6 선택 된 유전자)에 의해 유효성 검사 유전자의 식 수준 올바르게 정규화에 대 한 필요 없이 ECS 프로토콜에 의해 점령 되었습니다 했다 설명 했다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> 그림 3: 상단, 대 본의 상관 관계 계산 ECS RNA에 의해 동일한 샘플의 복제 사이 (n = 300). 하단, ECS로 식별 하는 건의 했다 ddPCR에 의해 확인 하는 사본 (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 (~0.5–2.0%)의 높은 오류 속도 의해 제한 되는 genomic 특성 분석을 위한 강력한 도구입니다. NGS 오류율을 제거 하 고 변형 대립 유전자 분수 0.0001 희귀에서 변이 감지 수 있는 오류 수정 시퀀싱의 우리의 방법을 설명 합니다.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

이 방법은 전암성 클론 검출, 치료 후 백혈병 환자의 예후 평가, 골수 기증자의 잠재적 병원성 돌연변이 식별과 같은 다양한 연구 분야에서 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저와 함께 이 절차를 시연할 사람은 실험실의 기술자인 Spencer입니다. 이 비디오는 오류 수정 염기서열분석 프로토콜과 Illumina 화학 및 상용 유전자 패널을 결합하여 10,000분의 1의 감도로 클론 단일 뉴클레오티드 변이체와 작은 indel을 검출하는 방법을 설명합니다.필요한 고유 분자 식별자를 통합하기 위해 맞춤형 16N i5 및 i7 어댑터는 PCR을 사용합니다. 먼저, 시판되는 대안보다 충실도가 높은 중합효소를 사용하는 Q5 마스터 믹스를 준비합니다. 그런 다음 각 반응에 대해 37.5마이크로리터의 Q5 마스터 믹스, 6마이크로리터의 고유한 분자 식별자인 5마이크로몰 16N i5 어댑터 및 6마이크로리터의 i7 어댑터를 결합합니다.목표가 멀티플렉싱인 경우 별도의 샘플에서 다른 i7 어댑터를 사용합니다. 지금, 뒤에 오는 모수를 사용하여 PCR를 실행하십시오: 98 섭씨 온도에 30 초, 98 섭씨 온도에 10 초, 66 섭씨 온도에 30 초, 및 72 섭씨 온도에 30 초의 4-6 주기가 뒤따릅니다. 섭씨 72도에서 2분 연장으로 반응을 마치고 섭씨 4도에서 유지합니다.그런 다음 당신이 그들에 대해 해야 하는 두 PCR 주기는 당신이 사용하는 유전자 패널의 크기에 따라 가장 가능성이 높습니다, 우리의 경험에 비추어 볼 때, 유전자 패널이 유전자 특이적 올리고의 약 1500개의 다른 경로를 가지고 있는 경우, 4개의 주기 PCR로 충분합니다, 반면 약 5-600쌍의 올리고가 있는 패널은 PCR의 약 6개의 사이클을 필요로 합니다. 다음으로, 마그네틱 비드를 사용하여 PCR 반응을 세척하고, 각 75 마이크로리터 PCR 산물에 56.25 마이크로리터의 마그네틱 비드 용액을 첨가한 다음, 각 반응을 별도의 1.5 밀리리터 저결합 튜브로 옮기고, 최소 10회 이상 위아래로 피펫팅하여 혼합하고, 5분 동안 기다립니다. 다음으로, 혼합물을 마그네틱 홀더로 옮기고 상층액을 2분 동안 제거합니다.그런 다음 상층액을 제거하고 버립니다. 다음으로 200 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 넣고 30 초 동안 기다린 다음 에탄올을 제거합니다. 이 에탄올 세척 단계를 한 번 반복한 다음 비드를 5분 동안 자연 건조시킵니다.마지막으로, 비드에서 변형된 라이브러리를 20마이크로리터의 이중 증류수에 용리합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 올려 놓고 용리액에서 마그네틱 비드를 분리합니다. 먼저, 이전 단계에서 ECS 라이브러리를 PCR 스트립에서 1,000개당 1개까지 10배 연속 희석합니다.다음으로, 1.5ml 튜브에 마스터 믹스를 준비합니다. 각 반응에 대해 ddPCR EvaGreen Mix 10마이크로리터, P5 프라이머 0.2마이크로리터, P7 프라이머 0.2마이크로리터 및 이중 증류수 4.6마이크로리터를 결합합니다. 그런 다음 EvaGreen Master Mix 15마이크로리터를 새 튜브 세트에 피펫팅하고 마지막으로 1 대 1, 000 ECS 세척 제품 5마이크로리터를 Master Mix에 추가합니다.다음으로, 액적 발생기를 사용하여 PCR 액적을 만듭니다. 먼저, 카세트를 로드하고, 70마이크로리터의 액적 생성 오일을 라벨링된 오일을 라벨이 붙은 카세트의 웰에 피펫하고, 20마이크로리터의 ddPCR 반응 혼합물을 웰 라벨링된 샘플에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 카세트를 고무 개스킷으로 덮고 액적 발생기에 로드하고 모든 액적 생성을 진행합니다.이제 멀티 채널 피펫을 사용하여 5초에 걸쳐 천천히 각 카세트 웰에서 채취한 45마이크로리터의 방울을 새 PCR 플레이트에 로드합니다. 그런 다음 PCR 플레이트를 알루미늄 호일로 밀봉합니다. 지금, 뒤에 오는 조건을 사용하여 작은 물방울에 있는 신호를 증폭하십시오: 95 섭씨 온도에 5 분, 95 섭씨 온도에 30 초의 40 주기, 그리고 63 섭씨 온도에 1 분, 그 후에, 5 분 동안 90 섭씨 온도에 올리기 전에 5 분 동안 4 섭씨 온도에 반응을 냉각하십시오, 그런 다음 섭씨 4도에서 유지합니다.다음으로, ddPCR 템플릿 액적 판독기 기계를 준비합니다. 절대 정량화를 위한 파라미터를 선택하고 QX200 ddPCR EvaGreen Supermix를 사용합니다. 그런 다음 액적 판독기를 통해 반응을 실행합니다.ddPCR 분석이 완료되면 각 샘플에 동일한 분할 임계값을 적용합니다. 그런 다음 각 라이브러리를 원하는 분자 수로 정규화합니다. 25마이크로리터의 Q5 마스터 믹스, 2마이크로리터의 1마이크로몰 P5 프라이머, 2마이크로리터의 1마이크로몰 P7 프라이머, 21마이크로리터의 정규화된 DNA 라이브러리로 구성된 50마이크로리터 반응을 만드는 것으로 시작합니다.다음으로, 뒤에 오는 모수를 사용하여 PCR를 실행하십시오: 98 섭씨 온도에 30 초, 98 섭씨 온도에 10 초, 66 섭씨 온도에 30 초, 및 72 섭씨 온도에 30 초의 16 주기, 그 후에 72 섭씨 온도에 2 분, 그리고 4 섭씨 온도에 보전됩니다. 다음으로, 라이브러리의 DNA 농도를 정량화하고 염기서열분석을 위해 동일한 어금니로 라이브러리를 풀링하고 대략 4나노몰을 표적으로 합니다. 이제 Illumina 염기서열분석 플랫폼을 사용하여 다음과 같은 염기서열분석 설정으로 풀링된 ECS 라이브러리를 염기서열분석합니다: 2회 144 paired-end read, 인덱스 1의 8 사이클, 인덱스 2의 16 사이클.GATA1에 돌연변이가 있는 환자의 DNA를 원래 VAF 0.19로 상용 게놈 DNA에 희석했습니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 ECS는 단일 뉴클레오티드 변이체에 대해 1에서 10, 000 수준까지 정량적인 것으로 입증되었습니다. 다음으로, 20명의 건강한 개인으로부터 채취한 버피 털 샘플을 568개의 앰플리콘으로 구성된 상용 염기서열분석 패널을 사용하여 분석했습니다.요약하면, 109개의 클론 체세포 돌연변이가 적어도 하나의 수집 시점의 두 복제에 존재했으며, 변이 대립유전자 분획이 0.0003에서 0.1451.21 사이인 것으로 알려진 우주 표현을 가진 돌연변이를 선택하고 각각을 디지털 액적 PCR을 사용하여 검증했습니다. 프로토콜의 오류 수정 발현 수준을 입증하기 위해 다양한 암과 관련이 있는 것으로 알려진 415개의 유전자로 구성된 맞춤형 유전자 패널을 사용하여 각 유전자에서 가장 일반적으로 발현되는 엑손에서 구축된 라이브러리를 생성했습니다. 저농도 전사체의 발현 수준은 반복 실험 간에 재현성이 높았습니다.그런 다음 디지털 액적 PCR을 사용하여 다양한 발현을 가진 6개의 선택된 유전자를 검증했습니다. 비교를 통해 유전자의 발현 수준이 정규화 없이 ECS 프로토콜에 의해 올바르게 포착되었음을 보여줍니다. 이 기술을 마스터하면 이 기술을 하루 반 만에 편안하게 수행할 수 있습니다.대부분의 시간은 배양이며, 수동 처리는 연구원이 동시에 처리하는 샘플의 수에 따라 필요한 총 시간의 약 30-40%를 차지합니다. 이 절차를 시도하는 동안 동일한 샘플에 대한 복제 염기서열분석 라이브러리를 보유하는 것이 매우 중요합니다. 이렇게 하면 저빈도 돌연변이 자체가 두 복제에서 독립적으로 핵심인 경우 저빈도 돌연변이가 참 긍정이라는 더 많은 확신을 얻을 수 있습니다.이 절차에 따라 저농도 전사체 또는 융합 전사체의 검출과 같은 질문에 답하기 위해 ECS RNA와 같은 다른 문제를 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 주로 혈액 악성 종양 분야의 연구자들을 위한 길을 열었으며, 우리는 이 기술을 사용하여 건강한 개인의 백혈병 전 클론을 탐색하고 차도를 보이는 백혈병 환자의 최소 잔류 질환을 검출합니다.

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

풀링된 유전자 시퀀싱은 큰 무리에서 복잡한 phenotypes와 관련된 희귀한 변종을 탐지하기위한 빠르고 비용 효율적인 전략이다. 여기 가시가 소프트웨어 패키지를 사용하여 32 암 관련 유전자의 풀링, 차세대 시퀀싱의 전산 분석을 설명합니다. 이 방식은 확장성, 그리고 관심의 표현형에 적용됩니다.

파편을 사용하여 풀링된 장면에서 드문 게놈 변종의 탐지

이 비디오는 희귀 전사체 변이체를 검출하는 데 유용한 디지털 PCR 기술의 변형인 칩 기반 디지털 PCR을 보여줍니다. PCR 반응은 나노유체 칩의 챔버로 분할되며, 각 챔버는 독립적인 반응으로 작용합니다. 증폭된 표적이 있는 챔버에서 형광 신호를 감지하면 샘플에 희귀한 전사체 변이체가 존재함을 확인할 수 있습니다.

나노유체 칩을 사용하여 희귀한 전사체 변이체를 검출하는 칩 기반 디지털 PCR

Wild-type blocking PCR에 이어 직접 염기서열분석(direct sequencing)은 다양한 샘플 유형에서 저주파 체세포 돌연변이를 매우 민감하게 검출할 수 있는 방법을 제공합니다.

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

여기, 선물이 RNA 샘플에 게놈 DNA (gDNA) 오염 추적에 대 한 프로토콜. 제시 방법 뇌관 특정 ribosomal DNA (rDNA) 유전자의 내부 베낀된 공백 지역 (ITS)을 활용합니다. 메서드는 대부분의 진핵생물과 원핵생물에서 DNA 오염의 안정적이 고 민감한 검출에 적합 합니다.

Ribosomal DNA에 따라 RNA 샘플에서 DNA 오염 평가

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

이 프로토콜 여러 모델 생물에서 녹음의 품질을 모니터링 하는 새로운 도구와 연구를 제공 합니다.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

게놈 규모에서 RNA 편집 이벤트의 신속한 탐지와 신뢰할 수 있는 정량화는 여전히 어려운 과제이며 현재 직접 RNA 시퀀싱 방법에 의존하고 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 RNA 편집을 감지하는 간단하고 빠르며 휴대용 방법으로 미세 온도 구배 겔 전기 영동 (μTGGE)을 사용합니다.

RNA 편집의 신속한 검출을 위한 비시퀀싱 접근법

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

단일 셀의 순서는 고해상도 게놈 변화를 해결하기위한 점점 인기 액세스 도구입니다. 우리는 하나의 셀에 복사 번호 변경을 식별하기 위해 단일 셀 시퀀싱을 사용하는 프로토콜을 제공합니다.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

학습하세요 오류 수정 DNA 및 RNA 시퀀싱 방법을 통해 희귀 돌연변이를 정확하게 검출하는 기술입니다. Illumina 플랫폼과 고유 분자 식별자를 활용하여 변이 대립유전자 비율 0.0001 수준의 민감한 검출이 가능합니다.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

더 많은 동영상 탐색