드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

이 방법은 전암성 클론 검출, 치료 후 백혈병 환자의 예후 평가, 골수 기증자의 잠재적 병원성 돌연변이 식별과 같은 다양한 연구 분야에서 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저와 함께 이 절차를 시연할 사람은 실험실의 기술자인 Spencer입니다. 이 비디오는 오류 수정 염기서열분석 프로토콜과 Illumina 화학 및 상용 유전자 패널을 결합하여 10,000분의 1의 감도로 클론 단일 뉴클레오티드 변이체와 작은 indel을 검출하는 방법을 설명합니다.

필요한 고유 분자 식별자를 통합하기 위해 맞춤형 16N i5 및 i7 어댑터는 PCR을 사용합니다. 먼저, 시판되는 대안보다 충실도가 높은 중합효소를 사용하는 Q5 마스터 믹스를 준비합니다. 그런 다음 각 반응에 대해 37.5마이크로리터의 Q5 마스터 믹스, 6마이크로리터의 고유한 분자 식별자인 5마이크로몰 16N i5 어댑터 및 6마이크로리터의 i7 어댑터를 결합합니다.

목표가 멀티플렉싱인 경우 별도의 샘플에서 다른 i7 어댑터를 사용합니다. 지금, 뒤에 오는 모수를 사용하여 PCR를 실행하십시오: 98 섭씨 온도에 30 초, 98 섭씨 온도에 10 초, 66 섭씨 온도에 30 초, 및 72 섭씨 온도에 30 초의 4-6 주기가 뒤따릅니다. 섭씨 72도에서 2분 연장으로 반응을 마치고 섭씨 4도에서 유지합니다.

그런 다음 당신이 그들에 대해 해야 하는 두 PCR 주기는 당신이 사용하는 유전자 패널의 크기에 따라 가장 가능성이 높습니다, 우리의 경험에 비추어 볼 때, 유전자 패널이 유전자 특이적 올리고의 약 1500개의 다른 경로를 가지고 있는 경우, 4개의 주기 PCR로 충분합니다, 반면 약 5-600쌍의 올리고가 있는 패널은 PCR의 약 6개의 사이클을 필요로 합니다. 다음으로, 마그네틱 비드를 사용하여 PCR 반응을 세척하고, 각 75 마이크로리터 PCR 산물에 56.25 마이크로리터의 마그네틱 비드 용액을 첨가한 다음, 각 반응을 별도의 1.5 밀리리터 저결합 튜브로 옮기고, 최소 10회 이상 위아래로 피펫팅하여 혼합하고, 5분 동안 기다립니다. 다음으로, 혼합물을 마그네틱 홀더로 옮기고 상층액을 2분 동안 제거합니다.

그런 다음 상층액을 제거하고 버립니다. 다음으로 200 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 넣고 30 초 동안 기다린 다음 에탄올을 제거합니다. 이 에탄올 세척 단계를 한 번 반복한 다음 비드를 5분 동안 자연 건조시킵니다.

마지막으로, 비드에서 변형된 라이브러리를 20마이크로리터의 이중 증류수에 용리합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 올려 놓고 용리액에서 마그네틱 비드를 분리합니다. 먼저, 이전 단계에서 ECS 라이브러리를 PCR 스트립에서 1,000개당 1개까지 10배 연속 희석합니다.

다음으로, 1.5ml 튜브에 마스터 믹스를 준비합니다. 각 반응에 대해 ddPCR EvaGreen Mix 10마이크로리터, P5 프라이머 0.2마이크로리터, P7 프라이머 0.2마이크로리터 및 이중 증류수 4.6마이크로리터를 결합합니다. 그런 다음 EvaGreen Master Mix 15마이크로리터를 새 튜브 세트에 피펫팅하고 마지막으로 1 대 1, 000 ECS 세척 제품 5마이크로리터를 Master Mix에 추가합니다.

다음으로, 액적 발생기를 사용하여 PCR 액적을 만듭니다. 먼저, 카세트를 로드하고, 70마이크로리터의 액적 생성 오일을 라벨링된 오일을 라벨이 붙은 카세트의 웰에 피펫하고, 20마이크로리터의 ddPCR 반응 혼합물을 웰 라벨링된 샘플에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 카세트를 고무 개스킷으로 덮고 액적 발생기에 로드하고 모든 액적 생성을 진행합니다.

이제 멀티 채널 피펫을 사용하여 5초에 걸쳐 천천히 각 카세트 웰에서 채취한 45마이크로리터의 방울을 새 PCR 플레이트에 로드합니다. 그런 다음 PCR 플레이트를 알루미늄 호일로 밀봉합니다. 지금, 뒤에 오는 조건을 사용하여 작은 물방울에 있는 신호를 증폭하십시오: 95 섭씨 온도에 5 분, 95 섭씨 온도에 30 초의 40 주기, 그리고 63 섭씨 온도에 1 분, 그 후에, 5 분 동안 90 섭씨 온도에 올리기 전에 5 분 동안 4 섭씨 온도에 반응을 냉각하십시오, 그런 다음 섭씨 4도에서 유지합니다.

다음으로, ddPCR 템플릿 액적 판독기 기계를 준비합니다. 절대 정량화를 위한 파라미터를 선택하고 QX200 ddPCR EvaGreen Supermix를 사용합니다. 그런 다음 액적 판독기를 통해 반응을 실행합니다.

ddPCR 분석이 완료되면 각 샘플에 동일한 분할 임계값을 적용합니다. 그런 다음 각 라이브러리를 원하는 분자 수로 정규화합니다. 25마이크로리터의 Q5 마스터 믹스, 2마이크로리터의 1마이크로몰 P5 프라이머, 2마이크로리터의 1마이크로몰 P7 프라이머, 21마이크로리터의 정규화된 DNA 라이브러리로 구성된 50마이크로리터 반응을 만드는 것으로 시작합니다.

다음으로, 뒤에 오는 모수를 사용하여 PCR를 실행하십시오: 98 섭씨 온도에 30 초, 98 섭씨 온도에 10 초, 66 섭씨 온도에 30 초, 및 72 섭씨 온도에 30 초의 16 주기, 그 후에 72 섭씨 온도에 2 분, 그리고 4 섭씨 온도에 보전됩니다. 다음으로, 라이브러리의 DNA 농도를 정량화하고 염기서열분석을 위해 동일한 어금니로 라이브러리를 풀링하고 대략 4나노몰을 표적으로 합니다. 이제 Illumina 염기서열분석 플랫폼을 사용하여 다음과 같은 염기서열분석 설정으로 풀링된 ECS 라이브러리를 염기서열분석합니다: 2회 144 paired-end read, 인덱스 1의 8 사이클, 인덱스 2의 16 사이클

GATA1에 돌연변이가 있는 환자의 DNA를 원래 VAF 0.19로 상용 게놈 DNA에 희석했습니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 ECS는 단일 뉴클레오티드 변이체에 대해 1에서 10, 000 수준까지 정량적인 것으로 입증되었습니다. 다음으로, 20명의 건강한 개인으로부터 채취한 버피 털 샘플을 568개의 앰플리콘으로 구성된 상용 염기서열분석 패널을 사용하여 분석했습니다.

요약하면, 109개의 클론 체세포 돌연변이가 적어도 하나의 수집 시점의 두 복제에 존재했으며, 변이 대립유전자 분획이 0.0003에서 0.1451.21 사이인 것으로 알려진 우주 표현을 가진 돌연변이를 선택하고 각각을 디지털 액적 PCR을 사용하여 검증했습니다. 프로토콜의 오류 수정 발현 수준을 입증하기 위해 다양한 암과 관련이 있는 것으로 알려진 415개의 유전자로 구성된 맞춤형 유전자 패널을 사용하여 각 유전자에서 가장 일반적으로 발현되는 엑손에서 구축된 라이브러리를 생성했습니다. 저농도 전사체의 발현 수준은 반복 실험 간에 재현성이 높았습니다.

그런 다음 디지털 액적 PCR을 사용하여 다양한 발현을 가진 6개의 선택된 유전자를 검증했습니다. 비교를 통해 유전자의 발현 수준이 정규화 없이 ECS 프로토콜에 의해 올바르게 포착되었음을 보여줍니다. 이 기술을 마스터하면 이 기술을 하루 반 만에 편안하게 수행할 수 있습니다.

대부분의 시간은 배양이며, 수동 처리는 연구원이 동시에 처리하는 샘플의 수에 따라 필요한 총 시간의 약 30-40%를 차지합니다. 이 절차를 시도하는 동안 동일한 샘플에 대한 복제 염기서열분석 라이브러리를 보유하는 것이 매우 중요합니다. 이렇게 하면 저빈도 돌연변이 자체가 두 복제에서 독립적으로 핵심인 경우 저빈도 돌연변이가 참 긍정이라는 더 많은 확신을 얻을

이 절차에 따라 저농도 전사체 또는 융합 전사체의 검출과 같은 질문에 답하기 위해 ECS RNA와 같은 다른 문제를 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 주로 혈액 악성 종양 분야의 연구자들을 위한 길을 열었으며, 우리는 이 기술을 사용하여 건강한 개인의 백혈병 전 클론을 탐색하고 차도를 보이는 백혈병 환자의 최소 잔류 질환을 검출합니다.