진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

이 방법은 어떤 RNA 중합효소 소단위 또는 생물학적 과정이 전사의 충실도를 제어하는지와 같은 전사 돌연변이 유발 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 진핵생물의 전사체에서 내인성 전사 오류를 측정할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 프로토콜을 처음 접하는 개인은 분석의 길이와 복잡성 및 데이터 해석을 위한 고급 생물정보학의 필요성 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

프로토콜을 시작하려면 이전에 준비된 샘플 20마이크로리터를 섭씨 65도에서 1분 동안 열변성하여 RNA 단편을 순환시킵니다. 1분 후 즉시 샘플을 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 다음으로, 4마이크로리터의 10x T4 RNA 리가제 완충액, 4마이크로리터의 10밀리몰 ATP, 1마이크로리터의 RNase 억제제, 1마이크로리터의 뉴클레아제 자유수 및 8마이크로리터의 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 추가합니다.

그런 다음 와류로 샘플을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 T4 RNA 리가제 1의 마이크로리터당 10단위의 2마이크로리터를 추가합니다. 피펫팅으로 샘플을 다시 혼합하고 뚜껑 온도를 섭씨 30도로 설정한 열순환기에서 섭씨 25도에서 2시간 동안 배양합니다.

2시간 배양 후 10마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 검체에 첨가하고 올리고 세척 및 농축 키트로 검체를 세척합니다. 샘플을 20마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물로 용리합니다. 원형 RNA 분자를 역전사하려면 10 milliMolar dNTPs 4 마이크로리터, 마이크로리터 랜덤 헥사머당 50 나노그램 4 마이크로리터, 9 마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 9 마이크로리터의 RNA에 추가합니다.

피펫팅으로 철저히 혼합하고 섭씨 65도에서 1분 동안 샘플을 변성시킵니다. 샘플을 변성시킨 후 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 8마이크로리터의 5x 1차 가닥 합성 완충액, 2마이크로리터의 0.1 milliMolar DTT 및 마이크로리터당 200 단위의 4마이크로리터를 시료에 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다.

섭씨 25도에서 10분 동안 뚜껑을 배양 온도보다 섭씨 5도 높게 설정하여 샘플을 배양합니다. 그런 다음 뚜껑을 섭씨 47도로 설정하고 섭씨 42도에서 20분 동안 샘플을 배양합니다. 세척 및 농축기 키트로 세척한 후 42마이크로리터의 용리 용액으로 샘플을 용리합니다.

두 번째 strand synthesis kit를 사용하여 double-stranded cDNA library를 생성합니다. 샘플을 얼음 위에 놓고 샘플 38마이크로리터에 NF 물 30마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 8마이크로리터의 10x 2차 가닥 완충액과 4마이크로리터의 2차 가닥 효소를 추가하고 부드러운 피펫팅으로 샘플을 혼합한 후 섭씨 16도에서 2시간 30분 동안 배양합니다.

100마이크로리터 반응을 위해 Oligo clean up and concentration kit로 샘플을 세척하고 38마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물로 샘플을 용리합니다. 피펫팅으로 말단 복구 반응을 혼합하고 섭씨 20도에서 30분 동안 배양합니다. 섭씨 20도 배양 후 섭씨 65도에서 30분 배양합니다.

먼저, 차세대 염기서열분석을 위한 어댑터를 10 milliMolar tris HCl에서 10배 희석하여 최종 농도 1.5 microMolar로 만듭니다. 그런 다음 각 샘플에 2.5마이크로리터의 희석된 어댑터와 1마이크로리터의 결찰 강화제를 추가하고 볼텍싱으로 혼합합니다. 다음으로, 15마이크로리터의 블런트 TA 리가제 마스터 믹스를 추가합니다.

샘플을 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 섭씨 20도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 3마이크로리터의 우라실 특이적 절제 시약 효소를 첨가하고 샘플을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 접합이 완료된 후 13.5마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 샘플에 추가하여 총 부피 100마이크로리터를 만들고 크기 선택을 진행합니다.

자기 구슬을 실온에 적응시킵니다. 30 마이크로리터의 순응 및 재현탁 마그네틱 비드를 각 샘플에 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 샘플을 1.5ml 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다.

샘플을 마그네틱 스탠드에 5분 동안 올려 놓고 상층액에서 비드를 분리합니다. 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮기고 마그네틱 비드를 폐기합니다. 각 샘플에 15마이크로리터의 마그네틱 비드의 새로운 분취액을 추가합니다.

피펫팅으로 철저히 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 마그네틱 랙에 놓고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 비드를 방해하지 않도록 조심스럽게 상층액을 제거하고 폐기합니다.

펠릿 자성 비드를 방해하지 않고 각 샘플에 80% 갓 준비한 에탄올 200마이크로리터를 추가하고 30초 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플에서 에탄올 흔적을 완전히 제거하고 비드를 5분 동안 자연 건조하되 비드를 과도하게 건조하지 않도록 주의하십시오. 비드에서 샘플을 용리하려면 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거합니다.

19마이크로리터의 10 millimolar tris HCl을 추가합니다. 혼합물을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 비드를 재현탁시키고 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 샘플을 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 5분 동안 배양하여 상층액에서 비드를 분리합니다.

튜브에서 정제되고 크기가 선택된 cDNA 라이브러리가 들어 있는 상등액 15마이크로리터를 조심스럽게 제거하고 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 5마이크로리터의 범용 프라이머와 5마이크로리터의 고유한 인덱스 프라이머를 각 정제된 cDNA 라이브러리에 추가하고 피펫팅으로 완전히 혼합합니다. 중합효소 마스터 믹스에 결정 및 기타 침전물이 있는지 주의 깊게 확인하고 침전물이 용해될 때까지 마스터 믹스를 손으로 따뜻하게 합니다.

25마이크로리터의 중합효소 마스터 믹스를 샘플에 추가합니다. 피펫팅으로 샘플을 혼합하고 PCR 증폭을 위해 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 나열된 사이클링 조건을 따릅니다. 45마이크로리터의 재현탁 마그네틱 비드를 PCR 반응에 직접 추가하여 최종 라이브러리를 정리합니다.

피펫팅으로 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 1.5ml 튜브로 옮기고 마그네틱 스탠드에 5분 동안 놓습니다. 배양 후 상등액을 버리고 갓 준비한 80% 에탄올로 30초 동안 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후 샘플에서 에탄올을 완전히 제거하고 비드 펠릿을 5분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 35μl의 0.1x TE로 용리합니다. 파이펫팅하여 비드를 다시 현탁시키고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 5분 동안 올려 놓은 후 30마이크로리터의 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

도서관은 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. RNA를 분리한 후 전기영동에서 두 개의 뚜렷한 rRNA 피크를 볼 수 있습니다. RNA의 단편화는 50-70개의 염기쌍 RNA 단편을 생성합니다.

롤링 서클 역전사(Rolling circle reverse transcription)는 원형 RNA 주형의 최소 3개의 탠덤 반복으로 구성된 cDNA 분자를 생성하는 데 사용되었습니다. 마그네틱 비드를 사용한 크기 선택을 통해 적절한 크기의 라이브러리를 정제할 수 있습니다. 단일 C-seq 라이브러리의 염기서열분석 정보는 대부분의 반복이 길이가 45 - 80 염기인 경향이 있음을 보여줍니다.

염기서열분석된 염기의 약 50%가 이러한 반복의 일부입니다. 이러한 염기의 대부분은 3회 이상의 반복을 포함하는 비율로 존재하기 때문에, 서열화되는 고유한 염기의 수는 염기서열분석된 총 염기 수의 약 1/3입니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 2-3일 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 작업을 방해할 수 있는 RNAs가 없는 멸균 작업 환경을 항상 유지하는 것이 중요합니다. 절차 중에 실수가 발생하지 않도록 각 단계를 주의 깊게 따르는 것도 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 C-seq assay를 사용하여 진핵생물의 전사 오류를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.