Name: 진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 진핵생물에서 전사 오류를 정밀 측정하는 C-seq 분석법을. RNA 원형화와 롤링 서클 역전사를 활용하여 전사 돌연변이 연구에 필수적인 바이오인포매틱스 기반 프로토콜을 익힙니다.

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이 간행물에 의해 되었습니다 (C. Fritsch) 그랜트 T32ES019851에서에서 자금, R01AG054641, 그리고 멀리 젊은 조사자 부여 (M. Vermulst).

<ol><li>Kireeva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reversal+of+RNA+polymerase+II+active+site+closing+controls+fidelity+of+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation.</a> Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).</li>
<li>Walmacq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rpb9+subunit+controls+transcription+fidelity+by+delaying+NTP+sequestration+in+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).</li>
<li>Strathern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fidelity+of+transcription%3A+RPB1+%28RPO21%29+mutations+that+increase+transcriptional+slippage+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).</li>
<li>Irvin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+assay+for+transcription+errors+reveals+multilayer+control+of+RNA+polymerase+II+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity.</a> PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).</li>
<li>Gout, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+transcription+errors+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The landscape of transcription errors in eukaryotic cells.</a> Science Advances. 3, e1701484(2017).</li>
<li>Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+detection+of+in+vivo+transcription+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Large-scale detection of in vivo transcription errors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).</li>
<li>Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+change+caused+by+transcriptional+bypass+of+uracil+in+nondividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells.</a> Science. 284, 159-162 (1999).</li>
<li>Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+induced+by+uracil+and+8-oxoguanine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli.</a> Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+encounters+with+DNA+damage%3A+transcription-coupled+repair+or+transcriptional+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis.</a> Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).</li>
<li>Vermulst, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+errors+induce+proteotoxic+stress+and+shorten+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan.</a> Nature Communications. 6, 8065(2015).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RNA%3A+a+first+example+of+molecular+misreading+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease.</a> Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutants+of+beta+amyloid+precursor+protein+and+ubiquitin-B+in+Alzheimer%27s+and+Down+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients.</a> Science. 279, 242-247 (1998).</li>
<li>Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+and+its+potential+roles+in+the+etiology+of+cancer+and+bacterial+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance.</a> Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).</li>
<li>Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+transcription+fidelity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of transcription fidelity mutants.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).</li>
<li>Acevedo, A., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+for+highly+accurate+population+sequencing+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses.</a> Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).</li>
<li>Traverse, C. C., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Spectra+of+Transcription+Insertions+and+Deletions+Reveal+That+Slippage+Depends+on+RNA%3ADNA+Hybrid+Complementarity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity.</a> mBio. 8, (2017).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAT--the+BLAST-like+alignment+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">BLAT--the BLAST-like alignment tool.</a> Genome Research. 12, 656-664 (2002).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14, R36(2013).</li>
<li>Zhou, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA+polymerase+rpoB+mutations+that+alter+transcription+slippage+during+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).</li>
<li>Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+RNA+consensus+sequencing+for+high-fidelity+detection+of+transcriptional+mutagenesis-induced+epimutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 꼬마 선 충, 초파리 melanogaster에 Saccharomyces cerevisiae전송 오류 검출을 위한 C-seq 라이브러리의 준비를 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 대체 기술 뿐만 아니라 기존 프로토콜을 통해 수많은 장점이 있습니다.
지난 15 년 동안 수많은 기자 시스템 개발 되었습니다 luciferase7,8 또는 Cre Lox 재결합3,4,15,21 전사 검색에 의존 하는 오류입니다. 이러한 기자 시스템 연구팀은 그들은 유전자, 대립, 그리고 직접 ...

게놈 생명의 정확한 생물학 청사진을 제공합니다. 이 청사진을 제대로 구현 하기 좋은 정밀도로 변하게 하는 게놈에 대 한 중요 하다. 그러나, 전사 무료 오류일 가능성이 크다. 예를 들어 RNA polymerases 오류가 시험관에1,2, 하 긴 알려져 있다 그리고 최근에 그들은 오류에서 vivo에서 뿐만 아니라3,,56, 커밋 보였다 DNA에 직면 하는 경우에 특히7,8,,910손상. 함께 찍은, 이러한 관측은 필 사 오류가 발생 지속적으로 모든 살아있는 세포에서 그들은 돌연변이 단백질의 강력한 원천이 될 수 있는 제안 나타냅니다.
Transcriptional mutagenesis 되 나,이 과정에서 두 가지 방법으로 고전 mutagenesis 다릅니다. 첫째, 유전자 변이, 달리 전사 오류 영향을 mitotic 그리고 포스트 mitotic 세포로 DNA 복제에 의존 하지 않는. 전사의 품질에 영향을 주는 메커니즘을 공부 mitotic 그리고 포스트 mitotic 세포의 돌연변이 부하에 대 한 값진 통찰력 제공 따라서. 흥미롭게도, 전사 오류 최근 단백질 집계11,,1213 의 승진에 연루 되어 고 모두 발암10 에 기여할 가설과 항생제 저항 박테리아14의 개발.
둘째, 유전자 변이, 달리 필 사 오류는 자연에 과도. 그들의 임시 존재 하기 때문에 전송 오류 검출 하기 상당히 어려운 특히 도전 이다. 예를 들어 여러 실험실 transcriptional mutagenesis 연구에 대 한 귀중 한 기자가 분석 실험을 고안 했다, 하는 동안 이러한 분석 전사 오류 컨텍스트 및 모델 생물4,15의 한정된 된 수에서 측정 수만 있습니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 많은 연구 자들은 RNA 시퀀싱 기술 (RNA-seq), 이론적으로 모든 종의 transcriptome 걸쳐 기록 전사 오류를 수 있는 게 아닙니다. 그러나, 이러한 연구는 반전 녹음 방송 오류, PCR 증폭 오류 등 자체 시퀀싱의 오류가 자연 도서관 건축 유물에 의해 쉽게 혼동 된다. 예를 들어 역 transcriptases 커밋 약 한 오류 모든 ~ 20000 기지 동안 RNA polymerases (RNAPs) 하나의 실수 모든 300000 기지5,6것으로 예상 된다. 반전 녹음 방송 혼자의 오류율 난쟁이 셀 안에 RNA polymerases의 오류율, 때문에 그것은 전통적인 RNA-Seq 데이터 ( 라이브러리 준비로 인 한 유물에서 진정한 전사 오류를 구별 하는 것이 사실상 불가능 그림 1a).
이 문제를 해결 하려면 우리는 최적화 된 버전 원-시퀀싱 (Cirseq, 또는 C-seq 이제)의 분석 결과5,16을 개발 했다. 이 분석 결과 사용자를 transcriptome5전체 RNA에 전사 오류 및 다른 희소 한 이체를 감지 수 있습니다. 원형-시퀀싱 분석 결과이 분석 결과에 중요 한 단계 주위에 회귀 한다 RNA circularization 때문에이 이름을 수행 합니다. 일단 RNA 대상 circularized는, 그들은 역 같은 RNA 서식 파일의 여러 복사본을 포함 하는 선형 cDNA 분자를 생산 하는 롤링 원 패션에 복사할. 이러한 서식 파일 중 하나에 오류가 있었다면,이 오류 cDNA 분자 내에 포함 된 모든 단일 반복에 것도. 대조적으로, 반전 녹음 방송, PCR 확대, 또는 시퀀싱 오류 무작위로 발생 하는 경향이 하 고 따라서 단 하나 또는 두 개의 반복에 있을 것입니다. 따라서, 각 cDNA 분자에 대 한 합의 시퀀스를 생성 하 여 모든 반복에서 발생 하는 오류에서 임의의 오류를 구별 도서관 건축 유물 효과적으로 진정한 전사 오류 (그림 1b)에서 분리 수 있습니다.
C-seq 분석 결과 정확 하 게 어떤 종의 transcriptome 통해 RNA의 기본 대체, 삽입 및 삭제의 속도 감지를 사용할 수 있는 적절 하 게 사용 하는 경우 (예를 들어 트래버스 및 Ochman17참조). 예, 우리는 C-seq 분석 결과를 사용 단일 기본 해상도5 Saccharomyces cerevisiae, 초파리 melanogaster, 그리고 꼬마 선 충 에서 전사의 오류율의 게놈 넓은 측정을 제공 (관찰 되지 않은). 원래 정확 하 게 RNA 바이러스 인구의 시퀀싱 하는 데 사용, C-seq 분석 결과의 최적화 된 버전이 도서관 건축 유물을 라이브러리 준비 하는 동안 가혹한 조건을 최소화 하기 위해 간소화 되었습니다. 또한, 다양 한 상용 키트를 사용 하 여 분석 결과의 처리량은 크게 개선, 자사의 사용자 뿐만 아니라. 적절 하 게 사용 하는 경우이 분석 결과 정확 하 게 수천 복제, 이전 연구6에 그로 인하여 크게 개선 전송 오류를 검색할 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 transcriptional mutagenesis 연구 하는 강력한 도구 이며 사용자 생물의 넓은 범위에서 녹음의 품질을 제어 하는 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RiboPure RNA 정제 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1926</td><td>총 RNA 정제</td></tr><tr><td>Genelute mRNA 정제 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MRN70-1KT</td><td>mRNA 정제</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>용출 및 희석</td></tr><tr><td>Ambion RNase III</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2290</td><td>RNA 단편화</td></tr><tr><td>T4 RNA 리가아제 1(ssRNA Ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td>RNA circularization</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td>RNase inhibitor</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>ThermoFisher</td><td>18080044</td><td>Rolling circle reverse transcription</td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>ThermoFisher</td><td>18427013</td><td>Rolling circle reverse transcription</td></tr><tr><td>Random hexamers (50 ng/&micro; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>N8080127</td><td>롤링 서클 역전사</td></tr><tr><td>NEB 두 번째 가닥 합성 모듈</td><td>New England Biolabs</td><td>E6111S</td><td>두 번째 가닥 합성</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA 라이브러리 준비 키트 Illumina New</td><td>England Biolabs</td><td>E7370S</td><td>cDNA 라이브러리 준비</td></tr><tr><td>NEB Next 인덱스 프라이머</td><td>NEB</td><td>E7335S</td><td>멀티플렉스 PCR 프라이머</td></tr><tr><td>올리고 클린 & Concentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>RNA 및 DNA 시료 정리</td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>마그네틱 비드 정제</td></tr><tr><td>AMPure XP 비드</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>마그네틱 비드 정제</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 마이크로 원심분리기</td><td>FisherScientific</td><td>05-403-93</td><td>원심분리</td></tr><tr><td>INCU-Shaker 10 L</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H1010</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>T100 열 순환기</td><td>BIO RAD</td><td>1861096</td><td>중고온에서 고온 순환 조건</td></tr><tr><td>PTC-200 열 순환기</td><td>GMI</td><td>8252-30-0001&nbsp;</td><td>저온 사이클링 조건</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular Bioproducts</td><td>700S-11</td><td>멸균</td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430290</td><td>뉴클레아제가 없는</td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>Nuclease-free</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Nuclease-free</td></tr><tr><td>4200 Tapestation System</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리를 위한 뉴클레오티드 분석 장비</td></tr><tr><td>고감도 RNA 스크린 테이프</td><td>애질런트</td><td>5067-5579</td><td>RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리</td></tr><tr><td>RNA ScreenTape 샘플 버퍼</td><td>애질런트</td><td>5067-5577</td><td>RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리</td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Ladder</td><td>Agilent</td><td>5067-5578</td><td>RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Double stranded DNA 품질 관리</td></tr><tr><td>고감도 DNA 키트</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>이중 가닥 cDNA 샘플에 대한 품질 관리</td></tr><tr>수<td>조</td><td>VWR</td><td>462-0244</td><td>배양</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000C 분광 광도계</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000C</td><td>RNA 농도 측정</td></tr></tbody></table>

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

정확한 전사는 유전 정보의 충실 한 식에 대 한 필요 합니다. 놀랍게도 하지만, 약간 녹음의 품질을 제어 하는 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 과학적 지식에이 격차를 채우기 위해 우리는 최근 Saccharomyces cerevisiae, 초파리 melanogaster, 및 꼬마 transcriptome 걸쳐 전사 오류를 감지 하 원-시퀀싱 분석 결과 최적화 선 충. 이 프로토콜은 전사 오류 진 핵 세포에서의 전사의 품질을 제어 하는 메커니즘 전례 없는 자세히 해명 될 수 있도록 지도 하는 강력한 새로운 도구와 연구를 제공할 것입니다.

모든 대규모 병렬 시퀀싱 방법 처럼 각 C-seq 실험 다루기, 큰 데이터 집합을 생성합니다. 처음 사용자를 위해 어려울 수 있습니다; 이러한 데이터 세트를 처리 하기 위해 따라서, 모든 사용자는 실험 전에 경험된 바이오-informatician 문의 하는 것이 좋습니다. 평균, 기대는 사용자 대부분 대규모 병렬 시퀀싱 플랫폼에서 실행 당의 55-70 기가 기지 (Gbases) 약을 생성 합니다. 이 프로토콜에 대 한 일반적으로 12-30 샘플 했다 다중화 실행 당 각 샘플에 대 한 약 2-6 Gbases 인수 했다 그래야. 어댑터 시퀀스와이 데이터 집합에서 낮은 품질 기본 호출 (&lt; 20) 트리밍, 후 ~ 70% 초기 데이터 크기의 남아 있었다.
이 기지는 다음 생성 된 반복의 크기를 결정 하 여 RNA 조각화 및 circularization의 효율성 조사...

이 프로토콜 여러 모델 생물에서 녹음의 품질을 모니터링 하는 새로운 도구와 연구를 제공 합니다.

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

이 방법은 어떤 RNA 중합효소 소단위 또는 생물학적 과정이 전사의 충실도를 제어하는지와 같은 전사 돌연변이 유발 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 진핵생물의 전사체에서 내인성 전사 오류를 측정할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 프로토콜을 처음 접하는 개인은 분석의 길이와 복잡성 및 데이터 해석을 위한 고급 생물정보학의 필요성 때문에 어려움을 겪을 것입니다.프로토콜을 시작하려면 이전에 준비된 샘플 20마이크로리터를 섭씨 65도에서 1분 동안 열변성하여 RNA 단편을 순환시킵니다. 1분 후 즉시 샘플을 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 다음으로, 4마이크로리터의 10x T4 RNA 리가제 완충액, 4마이크로리터의 10밀리몰 ATP, 1마이크로리터의 RNase 억제제, 1마이크로리터의 뉴클레아제 자유수 및 8마이크로리터의 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 추가합니다.그런 다음 와류로 샘플을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 T4 RNA 리가제 1의 마이크로리터당 10단위의 2마이크로리터를 추가합니다. 피펫팅으로 샘플을 다시 혼합하고 뚜껑 온도를 섭씨 30도로 설정한 열순환기에서 섭씨 25도에서 2시간 동안 배양합니다.2시간 배양 후 10마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 검체에 첨가하고 올리고 세척 및 농축 키트로 검체를 세척합니다. 샘플을 20마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물로 용리합니다. 원형 RNA 분자를 역전사하려면 10 milliMolar dNTPs 4 마이크로리터, 마이크로리터 랜덤 헥사머당 50 나노그램 4 마이크로리터, 9 마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 9 마이크로리터의 RNA에 추가합니다.피펫팅으로 철저히 혼합하고 섭씨 65도에서 1분 동안 샘플을 변성시킵니다. 샘플을 변성시킨 후 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 8마이크로리터의 5x 1차 가닥 합성 완충액, 2마이크로리터의 0.1 milliMolar DTT 및 마이크로리터당 200 단위의 4마이크로리터를 시료에 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다.섭씨 25도에서 10분 동안 뚜껑을 배양 온도보다 섭씨 5도 높게 설정하여 샘플을 배양합니다. 그런 다음 뚜껑을 섭씨 47도로 설정하고 섭씨 42도에서 20분 동안 샘플을 배양합니다. 세척 및 농축기 키트로 세척한 후 42마이크로리터의 용리 용액으로 샘플을 용리합니다.두 번째 strand synthesis kit를 사용하여 double-stranded cDNA library를 생성합니다. 샘플을 얼음 위에 놓고 샘플 38마이크로리터에 NF 물 30마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 8마이크로리터의 10x 2차 가닥 완충액과 4마이크로리터의 2차 가닥 효소를 추가하고 부드러운 피펫팅으로 샘플을 혼합한 후 섭씨 16도에서 2시간 30분 동안 배양합니다.100마이크로리터 반응을 위해 Oligo clean up and concentration kit로 샘플을 세척하고 38마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물로 샘플을 용리합니다. 피펫팅으로 말단 복구 반응을 혼합하고 섭씨 20도에서 30분 동안 배양합니다. 섭씨 20도 배양 후 섭씨 65도에서 30분 배양합니다.먼저, 차세대 염기서열분석을 위한 어댑터를 10 milliMolar tris HCl에서 10배 희석하여 최종 농도 1.5 microMolar로 만듭니다. 그런 다음 각 샘플에 2.5마이크로리터의 희석된 어댑터와 1마이크로리터의 결찰 강화제를 추가하고 볼텍싱으로 혼합합니다. 다음으로, 15마이크로리터의 블런트 TA 리가제 마스터 믹스를 추가합니다.샘플을 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 섭씨 20도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 3마이크로리터의 우라실 특이적 절제 시약 효소를 첨가하고 샘플을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 접합이 완료된 후 13.5마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 샘플에 추가하여 총 부피 100마이크로리터를 만들고 크기 선택을 진행합니다.자기 구슬을 실온에 적응시킵니다. 30 마이크로리터의 순응 및 재현탁 마그네틱 비드를 각 샘플에 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 샘플을 1.5ml 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다.샘플을 마그네틱 스탠드에 5분 동안 올려 놓고 상층액에서 비드를 분리합니다. 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮기고 마그네틱 비드를 폐기합니다. 각 샘플에 15마이크로리터의 마그네틱 비드의 새로운 분취액을 추가합니다.피펫팅으로 철저히 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 마그네틱 랙에 놓고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 비드를 방해하지 않도록 조심스럽게 상층액을 제거하고 폐기합니다.펠릿 자성 비드를 방해하지 않고 각 샘플에 80% 갓 준비한 에탄올 200마이크로리터를 추가하고 30초 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플에서 에탄올 흔적을 완전히 제거하고 비드를 5분 동안 자연 건조하되 비드를 과도하게 건조하지 않도록 주의하십시오. 비드에서 샘플을 용리하려면 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거합니다.19마이크로리터의 10 millimolar tris HCl을 추가합니다. 혼합물을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 비드를 재현탁시키고 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 샘플을 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 5분 동안 배양하여 상층액에서 비드를 분리합니다.튜브에서 정제되고 크기가 선택된 cDNA 라이브러리가 들어 있는 상등액 15마이크로리터를 조심스럽게 제거하고 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 5마이크로리터의 범용 프라이머와 5마이크로리터의 고유한 인덱스 프라이머를 각 정제된 cDNA 라이브러리에 추가하고 피펫팅으로 완전히 혼합합니다. 중합효소 마스터 믹스에 결정 및 기타 침전물이 있는지 주의 깊게 확인하고 침전물이 용해될 때까지 마스터 믹스를 손으로 따뜻하게 합니다.25마이크로리터의 중합효소 마스터 믹스를 샘플에 추가합니다. 피펫팅으로 샘플을 혼합하고 PCR 증폭을 위해 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 나열된 사이클링 조건을 따릅니다. 45마이크로리터의 재현탁 마그네틱 비드를 PCR 반응에 직접 추가하여 최종 라이브러리를 정리합니다.피펫팅으로 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 1.5ml 튜브로 옮기고 마그네틱 스탠드에 5분 동안 놓습니다. 배양 후 상등액을 버리고 갓 준비한 80% 에탄올로 30초 동안 두 번 세척합니다.두 번째 세척 후 샘플에서 에탄올을 완전히 제거하고 비드 펠릿을 5분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 35μl의 0.1x TE로 용리합니다. 파이펫팅하여 비드를 다시 현탁시키고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 5분 동안 올려 놓은 후 30마이크로리터의 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다.도서관은 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. RNA를 분리한 후 전기영동에서 두 개의 뚜렷한 rRNA 피크를 볼 수 있습니다. RNA의 단편화는 50-70개의 염기쌍 RNA 단편을 생성합니다.롤링 서클 역전사(Rolling circle reverse transcription)는 원형 RNA 주형의 최소 3개의 탠덤 반복으로 구성된 cDNA 분자를 생성하는 데 사용되었습니다. 마그네틱 비드를 사용한 크기 선택을 통해 적절한 크기의 라이브러리를 정제할 수 있습니다. 단일 C-seq 라이브러리의 염기서열분석 정보는 대부분의 반복이 길이가 45 - 80 염기인 경향이 있음을 보여줍니다.염기서열분석된 염기의 약 50%가 이러한 반복의 일부입니다. 이러한 염기의 대부분은 3회 이상의 반복을 포함하는 비율로 존재하기 때문에, 서열화되는 고유한 염기의 수는 염기서열분석된 총 염기 수의 약 1/3입니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 2-3일 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 작업을 방해할 수 있는 RNAs가 없는 멸균 작업 환경을 항상 유지하는 것이 중요합니다. 절차 중에 실수가 발생하지 않도록 각 단계를 주의 깊게 따르는 것도 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 C-seq assay를 사용하여 진핵생물의 전사 오류를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

genome-wide-surveillance-transcription-errors-eukaryotic

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

여기에서는 단백질-DNA 상호 작용의 염기쌍에 가까운 해상도를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이는 염색질 면역침전(ChIP-exo)으로 선택적으로 농축된 DNA 단편의 엑소뉴클레아제 처리에 이어 고처리량 염기서열분석(high throughput sequencing)을 통해 얻을 수 있습니다.

칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인

우리는 발아 효모에서 가닥 특이적 전사 런온(TRO) 접근법에 의해 BrUTP를 사용하여 생체 내에서 RNA 중합효소 II에 의한 전사 종료를 분석하기 위한 기본 실험적 접근 방식을 설명합니다. 이 프로토콜은 효모와 고등 진핵생물 모두에서 다른 RNA 중합효소에 의한 전사 종결을 연구하도록 확장될 수 있습니다.

BrUTP 가닥 특정 전사 런타임에 (TRO) 접근 방식을 사용하여 전사의 종료의 분석

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 (~0.5–2.0%)의 높은 오류 속도 의해 제한 되는 genomic 특성 분석을 위한 강력한 도구입니다. NGS 오류율을 제거 하 고 변형 대립 유전자 분수 0.0001 희귀에서 변이 감지 수 있는 오류 수정 시퀀싱의 우리의 방법을 설명 합니다.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

당사는 네이티브 γH2A.X 염색질 면역침전(ChIP)을 통해 일반적인 취약 부위 파괴를 검출하는 빠르고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근법은 기존 γH2A.X ChIP 분석과 관련된 시간과 노동력을 크게 줄이면서 결과의 높은 재현성과 신뢰성을 유지합니다.

네이티브 γH2A에 의한 일반적인 취약한 부위 파손 캡처. X 치프

삽입 돌연변이 유발은 기능적 게놈 요소를 식별하기 위한 순 유전학의 필수 도구입니다. 여기에서는 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리 내에서 렌티바이러스 통합 부위를 검출하는 방법인 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)에 대해 설명합니다.

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional mutagenesis cell library(삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 기능적으로 관련된 렌티바이러스 통합 부위 식별)

이 원고에서는 세균 전사를 표적으로 하는 항균제의 전사 및 억제 활성을 기능적으로 검사하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

배우세요 진핵생물에서 전사 오류를 정밀 측정하는 C-seq 분석법을. RNA 원형화와 롤링 서클 역전사를 활용하여 전사 돌연변이 연구에 필수적인 바이오인포매틱스 기반 프로토콜을 익힙니다.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

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