와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

Wild-type blocking PCR에 이어 직접 염기서열분석(direct sequencing)은 다양한 샘플 유형에서 저주파 체세포 돌연변이를 매우 민감하게 검출할 수 있는 방법을 제공합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 샘플 유형에서 저주파 체세포 돌연변이를 검출하는 것입니다. 이 방법론은 매우 낮은 빈도의 돌연변이를 쉽게 검출할 수 있도록 하여 체세포 돌연변이 검사의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 골수 샘플에서 myd88 유전자의 돌연변이를 찾아보겠습니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 종양 세포가 거의 없는 경우에도 체세포 돌연변이의 존재에 대한 매우 정확하고 민감한 정보를 제공한다는 것입니다. 이 야생형 차단 PCR 기반 염기서열분석 분석법은 myd88 유전자에서 엑손 5의 일부를 증폭하여 L265 핫스팟의 적용 범위를 보장하기 위해 개발되었습니다. 정방향 및 역방향 프라이머는 무료 염기서열분석 프라이머를 무릎 꿇을 수 있도록 5개의 프라임 M13 시퀀스로 설계되었습니다.

차단 올리고뉴클레오티드를 약 10-15 염기 길이로 설계하고 돌연변이 농축이 필요한 야생형 주형을 보완합니다. 더 짧은 올리고는 불일치 차별을 개선합니다. 높은 표적 특이성을 달성하려면 차단 뉴클레오티드를 너무 많이 사용하지 않는 것이 중요한데, 이는 매우 끈적한 올리고뉴클레오티드를 생성하므로 발생합니다.

차단 올리고뉴클레오타이드를 설계하려면 먼저 Oligo Tools 웹 사이트로 이동합니다. Oligo TM 예측 도구를 선택합니다. 새 창이 열립니다.

차단할 야생형 템플릿의 염기서열을 올리고 염기서열 상자에 붙여넣습니다. 블로커 베이스 앞에 더하기 기호를 추가하여 표시합니다. 계산 버튼을 클릭하여 DNA 차단제 하이브리드의 대략적인 TM을 확인하십시오.

계산된 용융 온도가 아래 상자에 나타납니다. 블로킹 올리고는 열순환 시 확장 온도보다 섭씨 10-15도 높은 용융 온도를 갖도록 설계합니다. 여기서 확장 온도는 섭씨 72도입니다.

용융 온도를 조정하려면 차단 염기를 추가, 제거 또는 대체하십시오. 3-4개의 C 또는 G 염기를 길게 막는 것을 피하십시오. 다음으로, 2차 구조 형성 또는 자체 이합체화를 방지하기 위해 Oligo Tools 웹 사이트 홈 화면으로 돌아가서 Oligo Optimizer 도구를 선택합니다.

새 창이 열립니다. 차단할 와일드 타입 템플릿의 시퀀스를 상자에 붙여넣습니다. 블로킹 베이스를 나타내기 위해 더하기 기호를 추가합니다.

secondary structure 및 self only에 대한 두 개의 상자를 선택하고 분석 버튼을 눌러 hybridization 및 secondary structure에 대한 점수를 확인합니다. 이 점수는 각각 자체 이량체와 2차 구조의 용융 온도에 대한 매우 대략적인 추정치를 나타냅니다. 낮은 점수는 최적이며 블로커 블로커 페어링을 제한하여 달성할 수 있습니다.

더 낮은 점수를 얻기 위해 블로킹 뉴클레오티드를 제거하거나 재배치하십시오. 여기에 표시된 myd88에 대한 최적화된 차단 올리고 뉴클레오타이드는 DNA 차단제 하이브리드 용융 온도와 충분히 낮은 혼성화 및 2차 구조 점수 사이의 균형을 유지합니다. 아미노산 Q262에서 I266을 커버하도록 설계되었으며, DNA 중합효소에 의한 확장과 3 프라임 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 모두 억제하는 3 프라임 반전 DT를 특징으로 합니다.

프라이머가 설계되면 야생형 차단 PCR을 설정하고 동봉된 문서에 설명된 대로 열순환을 수행합니다. 섭씨 4도의 보관 장소에서 마그네틱 비드를 제거하고 실온으로 가져옵니다. PCR 산물 10마이크로리터를 새 PCR 플레이트에 옮깁니다.

자성 비드를 격렬하게 소용돌이쳐 자성 입자를 완전히 재현탁시킨 다음 새 플레이트의 각 웰에 18마이크로리터의 자성 비드를 추가합니다. 피펫을 위아래로 10회 반복하여 혼합합니다. 그런 다음 접시를 실온에서 5분 동안 배양합니다.

배양 후 PCR 플레이트를 측면 스커트 자석 플레이트에 2분 동안 올려 놓고 용액에서 비드를 분리합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 상층액을 흡입합니다. 비드 펠릿을 피하도록 주의하십시오.

다음으로, 150마이크로리터의 70% 에탄올을 각 웰에 분배하고 최소 30초 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 멀티채널 피펫으로 에탄올을 흡인하고 팁을 버립니다. 이 세척 절차를 한 번 더 반복합니다.

20마이크로리터 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 남은 에탄올을 흡입하고 팁을 버립니다. 플레이트의 웰이 마를 때까지 약 10분 정도 기다린 후 자석에서 플레이트를 제거하고 각 웰에 40마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 추가합니다. 피펫을 위아래로 15회 반복하여 혼합합니다.

그런 다음 실온에서 2분 동안 배양합니다. 배양 후 PCR 플레이트를 자석 플레이트에 1분 동안 다시 올려 용액에서 비드를 분리합니다. 35마이크로리터의 정제된 산물을 새 PCR 플레이트로 옮기고 첨부 문서에 설명된 대로 양방향 염기서열분석을 수행합니다.

정제를 위해 양방향 염기서열분석을 수행한 후 염기서열분석 산물을 PH 5.2 및 100% 에탄올에서 3몰 아세트산나트륨 25개 용액에 새로운 용액을 준비합니다. 또한 70 % 에탄올의 새로운 용액을 준비하십시오. 정방향 및 역방향 시퀀싱 플레이트의 각 웰에 30마이크로리터의 아세트산나트륨을 100% 에탄올과 피펫으로 5회 위아래로 넣어 혼합합니다.

그런 다음 플레이트를 다시 밀봉하고 실온에서 20분 동안 암막 속에서 배양합니다. 20분이 지나면 250분 동안 G를 2, 15회 원심분리합니다. 탈수 후 플레이트 실러를 제거하고 폐기물 용기 위로 플레이트를 한 번 뒤집습니다.

플레이트를 여러 번 뒤집으면 펠릿이 웰 바닥에서 헐거워질 수 있습니다. 깨끗한 종이 타월에 거꾸로 된 플레이트를 놓고 150회 G에서 1분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 각 웰에 150마이크로리터의 70% 에탄올을 추가하고 플레이트를 다시 밀봉합니다.

2에서 5분 동안 G를 250회 회전합니다. 그런 다음 플레이트 씰러를 제거하고 플레이트를 뒤집는 과정을 반복합니다. 우물이 완전히 건조되지 않은 경우 실온에서 자연 건조시키십시오.

샘플이 빛으로부터 보호되는지 확인하십시오. 웰이 완전히 건조되면 각 웰에 10마이크로리터의 포름아미드를 넣고 피펫을 위아래로 10회 넣어 혼합합니다. 플레이트를 다시 밀봉합니다.

온도 순환기를 사용하여 섭씨 95도에서 3분 동안 변성시킨 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 변성시킵니다. 변성 후, 플레이트 씰러를 격막으로 교체하고 제조업체의 지침에 따라 염기서열분석 플랫폼에서 염기서열분석을 수행합니다. 염기서열 분석 소프트웨어를 사용하여 트레이스를 시각화하고 염기서열을 적절한 참조 염기서열에 정렬합니다.

myd88을 NCBI 참조 시퀀스 NM002468에 정렬합니다. 돌연변이가 있거나 없는 환자의 게놈 DNA는 기존 및 야생형 차단 PCR을 모두 거쳤고 그 결과 생성된 PCR 산물을 염기서열분석했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 야생형 차단 PCR이 수행되었을 때 돌연변이 대립유전자가 풍부해졌고, 야생형 DNA에서는 위양성이 나타나지 않았습니다.

여기에 나타난 바와 같이 신호 강도의 특징적인 감소는 너무 높은 농도의 차단제를 사용하거나 PCR 후 정제가 양방향 염기서열분석 전에 차단제를 제거하지 못한 경우 종종 나타납니다. 이는 마그네틱 비드 정제 대신 효소 정제를 수행할 때 발생합니다. 돌연변이 대립유전자를 농축하는 모든 PCR 기반 분석은 저주파 인공물을 검출합니다.

이러한 미량은 시토신 또는 메틸화된 시토신이 각각 우라실 또는 티아민에 대한 공식 고정을 통해 탈아민화될 때 FFPE 조직의 TA 인공물에 비해 CG 염기서열분석 인공물의 증가를 보여줍니다. Uracil DNA glycosylase 또는 UDG는 야생형 차단 PCR 전에 우라실을 절제할 수 있어 염기서열분석 아티팩트를 줄이는 데 도움이 됩니다. 그러나 CPG 섬에서 자주 발생하는 탈aminated five methyl cytosine으로 인한 티아민은 UDG로 절제할 수 없습니다.

야생형 차단 PCR에 사용되는 차단제의 농도를 낮추면 UDG 처리로 해결되지 않는 염기서열분석 아티팩트의 발생을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 야생형 차단 기술을 사용하여 높은 수준의 정확도와 민감도로 체세포 돌연변이를 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술의 원리는 세포의 작은 하위 집단에서 돌연변이를 감지하는 데 적용될 수 있습니다.

따라서 최소 잔류 질환을 감지하고, 환자를 모니터링하고, 다양한 신생물을 가진 환자의 조기 재발을 예측하는 데 유용