Name: 와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 학습하세요 와일드형 블로킹 PCR과 직접 시퀀싱을 결합하여 골수 샘플에서 myd88 유전자의 저주파 체세포 돌연변이를 고감도로 검출하는 방법을. 이 기술은 정확하고 민감한 암 유전학 연구에 활용됩니다.

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윤리 성명서 : 인간의 모든 샘플 테스트는 임상 시험 심사위원회 (IRB)의 승인을 얻은 후 시행 하였다. 1. FFPE 조직에서 DNA 추출, 말초 혈액 및 골수 대기음 <ol><li> DNA FFPE 추출 키트 골수 FFPE 조직에 대한 <ol><li> 흠 슬라이드에서 FFPE 조직으로 시작 (5-5에서 10 절 - 10 μm의 두께). 참고 : 조직 부스러기 시작, 3 개를 사용하는 경우 - 5에서 6 섹션 - 10 μm의 두께와 1.1.6 단계로 건너 뜁니다. </li><li> 슬라이드 바구니 슬라이드 놓고 네 세척 저장소 (크실렌 두 100 % 알코올 개의)을 준비한다. 각 바스켓 용액을 600 mL의 최소 부피를 추가한다. </li><li> 제 트레이에 5 분 크실렌 세척을 수행하여 슬라이드 Deparaffinize. 추가로 5 분 동안 제 크실렌 세척 저장소에 슬라이드 이동. </li><li> 탈 파라핀 한 후, 5 분 동안 100 % 알코올로 슬라이드를 세척한다. 두 번째로 슬라이드를 이동추가로 5 분 동안 세척 알코올 저장조. </li><li> 슬라이드가 microcentrifuge 관에 면도날로 근근이 살아가고하기 전에 후드를 완전히 말리십시오. 참고 : 종양 지역과 H &amp; E 슬라이드가 표시된 경우 사용할 수 있으며, 슬라이드를 정렬 만 종양 영역을 긁어. </li><li> 키트에 포함 된 제조업체의 유인물의 지시로 진행합니다. </li></ol></li><li> BM 대기음 및 말초 혈액의 경우 <ol><li> 이러한 사양은 제조업체의 지침 유인물에 따라 압축을 풉니 다. 참고 : 많은 상용 키트와 FFPE 조직과 세포에서 DNA 추출 방법이 있습니다. 실질적으로 모두 사용할 수 있습니다. 실험실에서 확립 된 방법을 사용합니다. <ol><li> 200 μL 말초 혈액 (PB) 100 μL BM + 100 μL PBS를 사용합니다. </li><li> 4 μL의 RNase 주식 솔루션을 사용합니다. </li><li> 100 μL 용출 완충액으로 용출시켰다. </li></ol></li></ol></li><li> DNA의 정량화<ol><li> (순수한 DNA 위해) 약 1.8 260 ㎚ / 280 nm의 비율을 보장하는 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다. 비가 상당히 낮은 경우, 하류 어플리케이션을 방해 할 수있는 단백질, 페놀, 또는 다른 오염 물질의 존재를 나타낼 수있다. </li><li> 적합한 용출 완충액 100 NG / μL - 약 50 DNA의 농도를 조정. </li></ol></li></ol> PCR을 차단 2. 야생형 <ol><li> 프라이머 디자인 <ol><li> 이전에 따라 관심의 유전자 설계 및 취득 프라이머는 PCR 프라이머 디자인 (13)의 일반적인 가이드 라인을 설명했다. M13 감기를 포함하고 PCR 프라이머의 보편적 인 시퀀싱 프라이머를 역. 주 :에서 MyD88 세이에서 MyD88의 엑손 5를 증폭하기 위해 개발되었다 (G259 - N291) 5에 위치하고 있으며 110 개의 뉴클레오티드 &#39;프라이머 인트론 4. 순방향의 접합 부위와 부품을 커버하고 리버스 인트론 영역은 5 설계된&#39; -M13 시퀀스 (M13 포워드 : TGT ACG AAA GCC ACG AGT; M13 역 : CAG GAA ACA GCT ATG ACC)는 (재료 표 참조) 상보 시퀀싱 프라이머 어닐링을 허용한다. </li></ol></li><li> 잠금 핵산 올리고 뉴클레오티드 디자인 <ol><li> 돌연변이 보충이 요구되는 WT 템플릿 길이가 15 염기와 상보 - 약 10로 차단 된 올리고 뉴클레오티드를 설계한다. 주 : 짧은 올리고는 불일치 차별을 향상시킬 수 있습니다. 높은 목표 특이성을 달성하기 위해,이 매우 &quot;끈끈한&quot;올리고 뉴클레오타이드가 발생할 수 있기 때문에 너무 많이 차단 뉴클레오티드를 사용하지 않는 것이 중요합니다. 콘텐츠와 길이 및 염기 차단 차단해야하는 특정 염기에 따라 최적화 될하도록해야한다. 이는 이차 구조를 손상 자기 상보성 위험없이 높은 결합 특이성을 달성하기 위해 중요하다. </li><li> 확장 temperat 위 15 °의 C - T 자에 10 m를 갖는 차단 올리고 설계열 순환 동안 URE. G 또는 C 염기 차단 - (4- 염기 3) 추가하거나 차단 염기를 제거하거나 긴 스트레치를 회피하면서 블로킹 DNA 염기 치환하여 T의 m을 조정한다. <ol><li> 올리고 도구 웹 사이트로 이동 (재료의 표 참조)하고 &quot;올리고 Tm은 예측 차단&quot;도구를 선택합니다. </li><li> 은 &quot;올리고 시퀀스&quot;박스에 차단하고자하는 WT 템플릿의 서열을 붙이기. 차단 기지를 나타 내기 위해 기지 앞에 &quot;+&quot;추가합니다. </li><li> DNA의 차단제 하이브리드 대략 T의 m을 결정하기 위해 &quot;계산&quot;버튼을 선택한다. </li></ol></li><li> 이차 구조의 형성 또는 자체 이량 체를 피하기 위해 차단 올리고을 디자인합니다. <ol><li> 올리고 도구 웹 사이트로 이동 (재료의 표를 참조) &quot;올리고 최적화를 차단&quot;도구를 선택합니다. </li><li> 상자에 차단하고자하는 WT 템플릿의 서열을 붙이기. 기지를 차단 나타 내기 위해 기지 앞에 &quot;+&quot;추가합니다. </li><li> &quot;차 구조&quot;와 &quot;오직 자기&quot;의 두 상자를 선택합니다. 문제를 일으킬 차 구조 또는 자체 이량 체의 올리고를 검토 할 수있는 분석 버튼을 누릅니다. 참고 : 점수는 T m의 이차 구조와 자기 이량 체의 매우 거친 견적을 나타냅니다. 낮은 점수 따라서 최적이며 차단제 차단제 쌍을 제한함으로써 달성 될 수있다. 아미노산 Q262-I266 다루도록 설계 및 기능 된 3&#39;-가 반전에서 MyD88 [(TCAGA + AG + C +는 G +는 + C T + G + A + T + CC / invdT가 / +) MYD88blocker]의 차단 올리고 DT는 3&#39;- 엑소 뉴 클레아 제에 의한 DNA 중합 효소에 의해 열화를 모두 확장을 억제한다. 이러한 특정 차단 올리고는 &quot;+ N&quot;으로 표시되어 열 개 차단 염기와 17mer이다. 나머지 7 개 염기는 일반적인 DNA 뉴클레오티드이다. </li></ol></li></ol></li><li> WTB-PCR 설정 및 열 순환 <ol><li> WTB-PCR 마스터 마일 준비X / 20 mM의 승의 MgCl 2, 250 개 μM의 dNTP를 0.2 μM 정방향 2.5 μL PCR 반응 완충액 10 배하여 (MMX) 및 역방향 프라이머, 1.2 μM MYD88blocker와 DNase를, RNAse가없는, 고순도의 H 2 O 최종를 만들 반응 당 21.75 μL 용액의 부피. 주 : 작업 농도 (DNA 템플릿과 폴리머의 첨가 후) 25 μL의 최종 반응 부피위한 것이다. 종래의 PCR MMX 단순히 차단의 추가를 생략하여 제조된다. 모든 프로토콜 단계는 WTB 기존 PCR 모두 동일하게 유지됩니다. 이 검증에 사용할 수 있으며, 결정 농축는 차단제의 첨가에 의해 달성했다. <ol><li> MMX의 양을 산출 할 때 (오염 확인 양성 및 음성 대조군과 비 템플릿 제어) 및 피펫의 오류에 대하여 적어도 하나의 추가의 반응 3 개 추가의 반응을 고려하여 확인 제조 하였다. </li></ol></li><li> 철저하게 소용돌이 MMX. MMX는 불안하기까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다귀. </li><li> MMX에 반응 당 0.25 μL의 Taq DNA 중합 효소를 추가하고 혼합하는 반전. 중합 효소는 MMX에 추가되면, 얼음에 보관하십시오. </li><li> 각 웰에 효소 반응과 냉각 판과 피펫에 MMX 22 μL을 새로운 96 웰 PCR 플레이트를 넣어. </li><li> 폴리머와 MMX를 함유하는 각각의 웰에 100 NG / μL - 3 μL 게놈 DNA (50 추가. </li><li> 용액을 각 웰의 바닥에 닿을 수 있도록 플레이트 및 원심 간단히 인감. </li><li> 열 순환기에 PCR 플레이트를로드합니다. <ol><li> 다음과 같이 WTB-PCR 반응을위한 열 순환 조건을 설정 : 초기 변성을 6 분 동안 95 ℃로; 1 분 20 초 동안 72 ° C에서 30 초 동안 56 ° C에서 30 초, 프라이머의 어닐링, 95 ℃에서 변성, 및 연장 40 사이클; 10 분 동안 72 ℃에서 최종 연장. 참고 : 모범 사례는 amplicon의 오염을 방지하기 위해 물리적으로 분리 된 지역에 프로토콜의 나머지 부분을 완성 포함 전n은 미래 설정. </li></ol></li></ol></li><li> WTB-PCR의 성공 여부를 결정하는과 비 템플릿 컨트롤의 증폭의 부족을 확인하기 위해 이전에 설명한 프로토콜 (14)에 따라 겔 전기 영동을 수행합니다. </li><li> 자석 구슬에 의한 PCR 제품의 정제 <ol><li> 4 ° C에서 자기 구슬을 제거하고 실온에 가져다. </li><li> 새로운 PCR 플레이트에 10 μL PCR 제품을 전송합니다. </li><li> 소용돌이는 자기 구슬 적극적 완전히 자기 입자를 재현 탁합니다. </li><li> 새로운 플레이트에 각 웰에 18 μL에게 자기 구슬을 추가합니다. 피펫 10 배를 섞는다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 용액으로부터 분리 된 비드 2 분간 사이드 스커트 자석판 위에 PCR 플레이트를 놓는다. </li><li> 비드 펠렛을 피하고, 다중 채널 피펫으로 상층 액을 흡인. </li><li> 각 150 μL에 70 % 에탄올을 잘 분배하고, 실온 FO 부화적어도 30의 R. 멀티 채널 피펫과 에탄올을 대기음 및 팁을 폐기합니다. 다시 한번이 세척 절차를 반복합니다. </li><li> 20 μL 멀티 채널 피펫 잘 각각의 나머지 에탄올을 대기음 및 팁을 폐기하여. </li><li> 우물 (~ 10 분) 건조되면, 15 시간 또는 소용돌이 부드럽게를 자석 플레이트에서 제거하고 각 웰 피펫 믹스 40 μL에게 뉴 클레아없는 물을 추가합니다. </li><li> 2 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 용액으로부터 분리 된 비드 1 분 동안 자석 플레이트 상 PCR 플레이트를 놓는다. </li><li> 새로운 PCR 플레이트로 정제 된 생성물의 양도 35 μL. 이 정제 된 PCR 제품은 이제 양방향 시퀀싱을 진행 할 준비가 또는 필요할 때까지 -20 ° C에서 저장 될 수있다. 참고 : 새로운 분석을 개발할 때, 정제 된 PCR 산물의 정량화가 요구 될 수있다. 1 - NG / μL의 DNA 앰플 리콘 양방향 시퀀싱에 적합하다. 농도가 지속적으로 낮은 경우, PCR 제품 및 자기 구슬을 증가 proportionally (1 : 1.8). 농도가 지속적으로 높은 경우, 물을 더 큰 볼륨으로 용출. </li></ol></li></ol> WTB-PCR 제품의 3 연속 <ol><li> 양방향 시퀀싱 참고 : 다음 프로토콜은 적은 시약을 사용하여 최적화 된 제조업체의 지침의 수정 된 형태이다. <ol><li> 순방향 준비 및 역방향 시퀀싱 반응은 최종 용액을 만들기 위해 추가의 DNase, RNAse가없는, 고순도의 H 2 O 0.25 μL 레디 반응 혼합물 1.88 μL 시퀀싱 버퍼, 1.78 μM M13-F 또는 M13-R 시퀀싱 프라이머와 함께 혼합 반응 당 9 μL 부피. 이 염기 서열 반응 믹스 년까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 순방향 시퀀싱 반응을위한 새로운 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 순방향 시퀀싱 반응 혼합물의 9 μL 피펫. 역방향 시퀀싱 반응을위한 별도의 플레이트상에서 반복한다. </li><li> 정제 된 WTB-PCR 제품 t의 1 μL를 추가O 각 웰에 순방향 및 역방향 모두 판. </li><li> 용액을 각 웰의 바닥에 닿을 수 있도록 플레이트 및 원심 간단히 인감. </li><li> 열 순환기에 PCR 플레이트를로드합니다. <ol><li> 다음 시퀀싱 반응을위한 열 순환 조건을 설정 : 1 분 동안 96 ° C 단계; 10 초 동안 96 ℃에서 30 사이클, 5 초 동안 50 ℃, 4 분 동안 60 ° C; 정제를위한 준비가 될 때까지 4 ° C에서 개최. </li></ol></li></ol></li><li> 시퀀싱 제품을 정화 <ol><li> 3M 아세트산 나트륨 (pH5.2), 100 % 에탄올의 신선한 1시 25분 용액을 준비한다. </li><li> 신선한 70 % 에탄올 용액을 준비합니다. </li><li> 아세트산 나트륨의 30 μL 서열 플레이트 피펫 믹스 5 배 순방향 및 역방향의 각 웰 / 100 % 에탄올 용액을 추가한다. </li><li> 플레이트를 봉인하고 20 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 배양한다. </li><li> 15 분 동안 2,250 XG에 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 플레이트의 봉인을 제거하고 폐기물을 통해 반전컨테이너. 참고 : 반전 한 번만 또는 펠렛이 잘 바닥에서 느슨해 질 수 있습니다. </li><li> 1 분 동안 150 XG에 깨끗한 종이 타월 및 원심 분리기의 반전 플레이트를 놓는다. </li><li> 각 웰에 150 μL 70 % 에탄올을 추가합니다. </li><li> 5 분 2,250 XG에서 플레이트 스핀을 다시 봉인. </li><li> 반복 3.2.6와 3.2.7 단계를 반복합니다. </li><li> 우물이 완전히 건조하지 않은 경우, 실온에서 건조 공기로 할 수 있습니다. 건조하면서 샘플을 빛으로부터 보호되어 있는지 확인합니다. </li><li> 각 웰 피펫 믹스에 10 배를 10 μL 포름 아미드를 추가합니다. 플레이트를 다시 봉인. </li><li> 5 분 동안 39 ° C이어서 3 분 동안 95 ℃의 열 순환기에 변성. </li><li> 변성 후, 제조업체의 지침 15에 따라 시퀀싱 플랫폼에서 격막 및 순서와 함께 접시 실러를 교체합니다. </li></ol></li></ol> 시퀀싱 결과 4. 분석 <ol><li> 시퀀싱 DAT를 사용하여 시퀀싱 흔적을 시각화제조업체의 지침 (16)과 각각의 기준 서열 정렬에 따른 분석 소프트웨어. NCBI 참조 서열 &quot;NM_002468&quot;에서 MyD88에 정렬. </li></ol>

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여기에 설명 된 WTB-PCR 분석은 신장 (도 1) 동안 WT에 DNA의 증폭을 차단하기위한 차단 올리고 프라이머와 일반 세트를 사용한다. WTB-PCR 생성물은 돌연변이 염기 서열을 분석한다. WTB-PCR / 생어의 유틸리티는 단순, 높은 감도 및 높은 처리량에있다. 여기에 설명 된 지침을 사용하여, 대부분의 기존 생어 기반 분석은 단순히 크게 감도를 증가시키기 차단 올리고 뉴클레오티드의 추가를 통해 수정 될 수 있습니다. 여기에 제시된 실시 예 분석에서 PCR 단일 차단 올리고 뉴클레오티드의 첨가는 WTB-PCR 분석 3&gt; 0.5 %의 통상적 인 분석에 대한 WT의 배경에서 약 16 % 돌연변이 대립 유전자의 검출 한계를 증가. 효과는 임상 시험 3 본 위음성의 64 % 감소된다. 에서 MyD88 돌연변이의 존재를 확인하는 것은 중요한 진단 및 예후 IMPL있다ications; 거짓 전반적인 치료와 ...

생거 시퀀싱은 전통적으로 알려진 알 수없는 체세포 돌연변이 시험에서 황금 표준되었습니다. 생거 시퀀싱의 한계 중 하나는 검출 한계 인 (~ 10 - WT의 배경에 20 % 돌연변이 대립 유전자 1). 감도 수준은 몇 순환 종양 세포 또는 골수 (BM)이 고르지 때와 암성 조직 또는 환자 샘플에 존재할 수있는 낮은 수준의 체세포 돌연변이를 검출하기위한 부적절한. 이것은 또한 치료 후 잔여 질병을 평가 또는 혼자 두 기존의 염기 서열에 의해 어려운 치료 중에 새로운 저항 변이를 감지한다. 잠긴 핵산 (LNA)와 종래의 PCR 대체함으로써 생거 시퀀싱에 PCR (WTB-PCR)을 차단 야생형를 매개 성, WT의 배경 최대 0.1 % 돌연변이 대립 유전자의 감도는 2, 3, 4를 달성 할 수있다. 에서WT WT DNA의 DNA 증폭 방지하여 우선적으로 결합 - (NT 14 ~ 10) 차단 (LNA) 올리고 WTB-PCR은, 돌연변이 대립 유전자 농축 짧은의 첨가를 통해 달성된다. 돌연변이 풍부한 WTB-PCR 제품은 다음 순서가 될 수있다. WT DNA를 차단하기보다는 특정 돌연변이 선택 WTB-PCR은 분 세포 분획에 존재하는 알려진 알려지지 돌연변이 농축을 허용한다. 여러 방법이 현재 작은 세포 분획에 돌연변이를 검출하기 위해 사용된다. 이는 고성능 액체 크로마토 그래피 (DHPLC), 비드, 에멀젼, 증폭, 및 마그네틱들 (빛나는), 전계 유도 방출 측정 (EFIRM) 변성 대립 유전자 특이 적 PCR 증폭 불응 돌연변이 시스템 (ARMS), 높은 해상도를 포함 녹는 점 등이있다. 그러나, 이러한 방법의 대부분은 가양 만 분석은 4 설계된 하나의 돌연변이를 검출 할 수있는 능력에 의해 제한된다 </&gt; SUP. WTB-PCR은, 그러나, 여러 돌연변이 유형의 검출을 가능하게하고 유물 또는 탈 아미노 이벤트로 인한 오탐 (false positive)을 배제 도움이 될 수 시퀀싱 흔적을 시각화 할 수있게합니다. 차세대 시퀀싱 (NGS)이 기존의 시퀀싱에 적합한 대안을 제공 할 수 있습니다, 그러나, 실질적으로 더 큰 비용, 복잡성, 긴 분석 시간은 그것을 몇 가지 서로 다른 분자 마커 많은 질병 유형 또는 부상에 대한 치료를 환자 모니터링을위한 불필요한 옵션을 렌더링 저항 돌연변이. 5 % 미만의 변이 대립 유전자 빈도와 또 높은 탐지율이 검출 변이체 6 앰플 리콘 기반 NGS 5 문제를 제기 할 수있다. 여기에서는 Albitar 등에 의해 기술 된 바와 같이 골수 분화 인자 88 유전자의 돌연변이에 대해 스크리닝 WTB-PCR에 의해 달성 감도의 증가를 보여준다. 3에서 MyD88의 mutatioNS는 발덴 스트롬 마크로 글로불린 혈증 (WM) 알 수없는 의미 (IgM의-MGUS)의, IgM의 단일 클론 감마 병증, 비장 한계 영역 림프종 (SMZL)에서 중요한 진단 및 예후 인자, 그리고 큰 B 세포 림프종 (DLBCL)을 확산. 에서 MyD88 돌연변이는 WM의 거의 모든 경우와 면역 글로불린 M (IgM의) MGUS를 -secreting 환자의 약 50 %에서 발견된다. 이에 대해서,에서 MyD88 돌연변이는 SMZL 환자의 0 내지 6 %에서 발견 다발성 골수종 7, 8 결석된다. 겹치는 형태 학적, immunophenotypic, 염색체 및 WM 및 SMZL 또는 종종 감별 진단을 복잡하게 할 수-IgM의 다발성 골수종 사이의 임상 적 특성 때문에하는 돌연변이에서 MyD88의 존재하에 유용한 식별 9 인자로서 작용할 수있다. 에서 MyD88 돌연변이 또한, 치료 (7) 다음 DLBCL와 가난한 전체 생존 환자에서 더 큰 질병 부담과 관련이있다 </SUP&gt; 10. 또한에서 MyD88 돌연변이가 자주보다 활성화 된 B 세포 형 (ABC) DLBCL에서 발견되기 때문에 B가 셀 형상 (GCB) DLBCL 또는 기본 종격동 B 세포 림프종 (PMBL)에서 MyD88 돌연변이 상태가로서 작용할 수 배 중심 ABC 방송의 아형 (11), (12)에 대한 대리 마커. 여기에 제공된 상세한 프로토콜은 새로운 분석법이 개발 될 수 있거나 대부분의 기존 서열 분석을 용이하게 정확하게 다양한 샘플 종류 저주파 돌연변이를 검출하도록 구성 될 수있는 주형으로 작용한다. 이 접근법은 또한 모니터링하거나 종양 환자가 치료 표적 항생제로 처리되는 동안 생길 수 심지어 박테리아 개발할 수 내성 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수있다. 또한, 주소, 특히 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 조직에 돌연변이 농축과 관련된 많은 문제 구제.

<table><tbody><tr><td>1.5 또는 2 mL Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>100% 알코올</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>조직학 등급; 91.5% 에탄올, 5% 이소프로필 알코올, 4.5% 메틸 알코올</td></tr><tr><td>3730XL 시퀀서</td><td>ABI</td><td></td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>마그네틱 비드 PCR 정제용</td></tr><tr><td>알루미늄 밀봉 포일</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>PCR 및 냉장 보관용</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 주기 염기서열분석 키트</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>양방향 염기서열분석용. 5x Sequencing Buffer</td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 시리즈</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>A-2-DWP 로터(PCR 플레이트용)</td></tr><tr><td>96웰 플레이트용 냉각판</td><td>Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>DNAse, RNAse-free, 초순수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 사이드 스커트 자석</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>PCR 정제에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 proof, 분자생물학</td></tr><tr><td>Exiqon 웹사이트 Oligo Tools</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA polymerase (5 U/&micro; L)</td><td>Roche</td><td>12032937001</td><td>With10x 집중 PCR 반응 버퍼, 20 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Gel 전기영동 장치</td><td></td><td></td><td>2% 아가로스 젤</td></tr><tr><td>GeneRead DNA FFPE 추출 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>180134</td> 염기<td>서열분석 아티팩트를 줄이는 데 필요한 우라실 DNA 글리코실라아제를 함유</td></tr>하고 있으며, <tr><td>Hi-Di 포름아미드</td><td>ABI</td><td>4311320</td><td>염기서열분석을 위해 사용됩니다.</td></tr><tr><td>LNA 올리고뉴클레오티드</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA 염기)</td></tr><tr><td>M13-F 염기서열분석 프라이머</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt</td></tr><tr><td>M13-R 염기서열분석 프라이머</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc</td></tr><tr><td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Model 5430</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FA-45-30-11 rotor (1.5/2 mL microcentrifuge tubes용)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 분광광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 포워드 프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td></tr><tr><td>PCR 리버스 프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR plates</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>피펫터</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1,000 &마이크로; L</td></tr><tr><td>플레이트 격막, 96 웰</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>BM 흡인 및 말초 혈액용</td></tr><tr><td>SeqScape Sortware v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>염기서열 분석</td></tr><tr><td>슬라이드 바구니</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 (3 M, pH 5.2)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>멸균 여과 피펫 팁</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1,000 &마이크로; L</td></tr><tr><td>써모믹서 C&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>세척 reservoir</td><td></td><td></td><td>~ 1,000 mL</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>조직학 등급</td></tr></tbody></table>

와일드 형은 pcr은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

정확한 탐지 및 저주파 돌연변이의 식별은 치료 중 내성 돌연변이 신흥 심사, 치료 후 잔여 질병을 평가할 때 문제가 될, 또는 수의 환자가 몇 순환 종양 세포가있을 때. 서열 분석 하였다 PCR 차단 야생형 이러한 저주파 변이를 검출하는 방법으로 고감도, 유연성 및 단순성을 제공한다. 신설하거나 이전에 종래의 PCR 계 서열 분석에 핵산 올리고 뉴클레오티드 로크 설계 정의를 첨가함으로써, 1000 WT 대립 유전자의 배경에서 약 1 돌연변이 대립 유전자의 민감도 (1,000 1)를 실현할 수있다. 탈 아미 노화 이벤트와 연관된 시퀀싱 아티팩트 일반적 부분적 추출 단계 동안 우라실 DNA 글리코의 사용에 의해 해결 될 수 포르말린 고정 파라핀 조직에서 발견. 최적화 된 프로토콜은 여기에서 MyD88 돌연변이를 검출하기위한 특정이지만, 어떤을 설계하는 템플릿 역할을 할 수 있습니다WTB-PCR 분석. PCR 및 실시간 정량 PCR 가양 적게 발생, 유연성 및 구현의 용이성을 포함 특정 대립 유전자를 포함하여 낮은 주파수 변이의 검출에 대한 기타 일반적으로 사용되는 분석을 통해 WTB-PCR 분석의 장점, 둘 다 알려진 감지 할 수있는 능력 알 수없는 돌연변이.

확장시 WTB-PCR의 개념적 개관도 1에 제시된다. 블로커-DNA 하이브리드의 단일 염기 미스 매치가 크게의 용융 온도 감소하므로 (ΔT의 m = 20 - 30 °의 C)에서, WT 대립 유전자의 증폭을 돌연변이 주형 DNA는 확장자 (17)을 완료 할 수없는 상태에서 차단된다. WT 선형 DNA 증폭 동안 이러한 방식으로, 돌연변이 DNA를 기하 급수적으로 증폭된다. WTB-PCR에 의해 달성 돌연변이 농축 시연은도 2에 제시된다. 와 돌연변이가없는 환자의 게놈 DNA를 테스트했다 재래식 WTB-PCR 후 WTB-PCR에 의해 달성 전형적인 농축 및 WT DNA에 잘못된 반응의 부족을 보여 염기 서열. WTB MMX-PCR에 사용 된 ...

Wild-type blocking PCR에 이어 직접 염기서열분석(direct sequencing)은 다양한 샘플 유형에서 저주파 체세포 돌연변이를 매우 민감하게 검출할 수 있는 방법을 제공합니다.

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 샘플 유형에서 낮은 빈도의 체세포 돌연변이를 검출하는 것입니다. 이 방법론은 매우 낮은 빈도의 돌연변이 검출을 용이하게 함으로써 체세포 돌연변이 검사의 핵심적인 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 여기서는 골수 샘플 내 myd88 유전자의 돌연변이를 탐색하겠습니다.이 기술의 주요 장점은 매우 적은 수의 신생물 세포가 있는 경우에도 체세포 변이의 존재에 대한 매우 정확하고 민감한 정보를 제공한다는 것입니다. 이 야생형 차단 PCR 기반 시퀀싱 분석법은 L265 핫스팟의 커버리지를 보장하면서 myd88 유전자의 엑손 5 일부를 증폭하기 위해 개발되었습니다. 정방향 및 역방향 프라이머는 상보적 시퀀싱 프라이머의 어닐링이 가능하도록 5' 말단에 M13 서열을 포함하여 설계되었습니다.블로킹 올리고뉴클레오타이드를 돌연변이 농축이 필요한 야생형 템플릿에 상보적인 약 10에서 15개 염기 길이로 설계하십시오. 올리고 길이를 짧게 하면 미스매치 판별력이 향상됩니다. 높은 표적 특이성을 달성하려면 블로킹 뉴클레오타이드를 너무 많이 사용하지 않는 것이 중요한데, 과도하게 사용할 경우 올리고뉴클레오타이드의 결합력이 너무 강해지기 때문입니다.블로킹 올리고뉴클레오타이드를 설계하려면 먼저 Oligo Tools 웹사이트로 이동하십시오. Oligo TM 예측 도구를 선택하면 새 창이 열립니다.차단할 야생형 템플릿의 서열을 올리고 서열 상자에 붙여넣으십시오. 차단 염기 앞에 플러스(+) 기호를 추가하여 표시하십시오. 계산 버튼을 클릭하여 DNA 차단제 하이브리드의 대략적인 TM을 결정하십시오.계산된 용융 온도가 아래 상자에 표시됩니다. 블록킹 올리고(blocking oligo)의 용융 온도가 서모사이클링 중의 신장 온도보다 10~15°C 더 높게 설계하십시오. 여기서 신장 온도는 72°C입니다.융해 온도를 조정하려면 블로킹 염기를 추가, 제거 또는 교체하십시오. C 또는 G 블로킹 염기가 3~4개 연속으로 배치되는 것은 피하십시오. 다음으로, 이차 구조 형성이나 자기 이량체화를 방지하려면 Oligo Tools 웹사이트 홈 화면으로 돌아가 Oligo Optimizer 도구를 선택하십시오.새 창이 열립니다. 차단할 야생형 템플릿 서열을 상자에 붙여넣으십시오. 차단 염기를 표시하려면 더하기(+) 기호를 추가하십시오.secondary structure와 self 두 상자만 선택하고 analyze

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 체세포 돌연변이를 감지하는 야생형 차단 중합효소 연쇄 반응(WTB-PCR)에 대해 설명합니다. PCR 기반 기술은 고정 핵산(locked nucleic acid, LNA)을 사용하는데, 이는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)로서 상보적인 야생형 대립유전자에 결합하고 그 신장을 차단합니다. 차단은 선택적으로 샘플의 야생형 변이체에 대한 저수준 돌연변이 대립유전자의 증폭을 허용합니다.

저주파 체세포 돌연변이를 검출하기 위한 Wild-type Blocking PCR

우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

이 원고는 두 개의 차세대 염기서열분석 패널에 대한 임상 프로토콜을 설명합니다. 한 패널은 혈액학적 악성 종양을 조사하고 다른 패널은 고형 종양에서 일반적으로 돌연변이가 발생하는 유전자를 대상으로 합니다. 인간 악성 종양에서 드라이버 돌연변이의 분자 분류는 귀중한 예후 및 예측 정보를 제공합니다.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

이 비디오의 목적은 임상에서 드문 돌연변이를 검출하는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인과 디지털 방울 PCR (ddPCR) 분석 자동화 된 DNA 추출을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. FFPE 샘플에서 돌연변이를 검출하는 것은 FFPE 샘플에서 ddPCR의 임상 적 유용성을 보여줍니다.

디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용

종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.

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여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

이 문서에서는 주어진 환자에게서 다른 견본 중 클론 및 subclonal 변경을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 실험은 특정 종양 모형에 집중하더라도, 접근은 그밖 고형 종양에 광범위하게 적용가능하다.

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학습하세요 와일드형 블로킹 PCR과 직접 시퀀싱을 결합하여 골수 샘플에서 myd88 유전자의 저주파 체세포 돌연변이를 고감도로 검출하는 방법을. 이 기술은 정확하고 민감한 암 유전학 연구에 활용됩니다.

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

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