선택 하는 람다 cII 돌연변이 탐지 시스템

이 프로토콜의 전반적인 목표는 형질전환 설치류 또는 관심 화학 및 물리적 제제로 처리된 해당 동물의 배양된 세포에서 Lambda Select cII 돌연변이 분석과 관련된 단계별 절차를 시각화하는 것입니다. 이 테스트 방법은 다음과 같은 돌연변이 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그리고 만약 그렇다면, 그것은 얼마나 강력한 돌연변이 유발 물질입니까?

염기서열 특이적 돌연변이를 유도합니까? 이 기술의 주요 장점은 거의 모든 테스트 컴파운드에 최소한이라는 것입니다. 이 방법은 염색체로 통합된 리포터 유전자를 사용하여 포유류 세포의 돌연변이원성 검사에 사용할 수 있습니다.

단일 패키징 반응을 구성하기 위해 첫 번째 반응 혼합물을 포함하는 마이크로 원심분리 튜브에 5마이크로그램의 게놈 DNA를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 90분 동안 튜브를 배양합니다. 배양 후 두 번째 반응 혼합물 12마이크로리터를 튜브에 넣고 섭씨 30도에서 90분 더 그대로 둡니다.

90분 후 튜브에 1.1ml의 SM 완충액을 추가합니다. 그런 다음 포장된 DNA가 있는 튜브를 실온에서 약 10초 동안 격렬하게 와류시킵니다. 마이크로 원심분리기에서 빠르게 펄스 스핀을 제공합니다.

그런 다음 사용할 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 다음으로, 포장된 DNA의 각 밀리리터에 대해 50마이크로리터의 클로로포름을 추가합니다. 샘플이 당일에 처리되지 않으면 샘플을 부드럽게 소용돌이치고 섭씨 4도에서 최대 2주 동안 보관하십시오.

단일 포장된 DNA 검체를 위해 16개의 멸균 원형 바닥 튜브와 16개의 TB1 한천 플레이트를 준비합니다. 스크리닝에 10개의 튜브를 사용하고 적정에 6개의 튜브를 사용합니다. 그런 다음 각 둥근 바닥 튜브에 300 마이크로 리터의 G1250 도금 배양을 분주하십시오.

다음으로, 역가를 위해 10마이크로리터의 패키징된 DNA를 990마이크로리터의 SM 완충액에 첨가하고 1:100 희석합니다. 그런 다음 샘플을 와류로 만듭니다. 20 또는 100 마이크로리터의 1:100 DNA 용액을 3개의 titer 20 또는 titer 100 튜브 각각에 추가합니다.

스크리닝 목적으로 100마이크로리터의 희석되지 않은 패키징된 DNA 샘플을 10개의 스크리닝 튜브 각각에 추가합니다. 16개의 적정 및 스크리닝 튜브를 모두 처리합니다. 구성 요소를 혼합하기 위해 10초 동안 튜브를 소용돌이칩니다.

그런 다음 숙주 E.coli가 파지를 흡수할 수 있도록 실온에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. 다음으로, 2.5 밀리리터의 용융 TB1 상단 한천을 추가합니다. 적절한 적정 및 스크리닝 튜브까지 섭씨 55도를 유지하십시오.

첨가 후 즉시 튜브를 부드럽게 와류로 만듭니다. 이제 TB1 한천을 적절한 역가 또는 스크리닝 TB1 한천 플레이트에 붓습니다. 접시를 실온에서 15-30분 동안 그대로 두십시오.

한천이 응고되면 뒤집어서 10개의 스크리닝 플레이트를 모두 섭씨 24도의 고정식 인큐베이터에 46-48시간 동안 그대로 둡니다. 나머지 6개의 역가 플레이트는 섭씨 37도의 고정식 인큐베이터에 하룻밤 또는 하루 동안 그대로 두십시오. 섭씨 37도에서 배양한 후 3개의 titer 20 및 titer 100 플레이트에 모두 형성된 플라크의 수를 계산합니다.

섭씨 24도에서 배양 후 10 개의 스크리닝 플레이트에 형성된 플라크의 수를 계산합니다. 추정되는 돌연변이 플라크를 확인하려면 멸균 광경 피펫 팁으로 플라크를 코어링합니다. 그런 다음 플라크를 500마이크로리터의 멸균 SM 완충액으로 채워진 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 마이크로 원심분리 튜브를 실온에서 최소 2시간 동안 실온에서 배양합니다. 다음으로, 1마이크로리터의 코어드 파지 용액과 200마이크로리터의 G1250 도금 배양을 멸균된 원형 바닥 튜브에 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다.

30분 후, 코어가 있는 파지 용액을 2.5ml의 용융된 TB1 상단 한천에 플레이트를 만들고 섭씨 24도에서 46-48시간 동안 배양합니다. 2차 플라크가 보이면 피펫 팁을 사용하여 잘 분리된 Lambda cII 돌연변이 플라크 하나를 선택합니다. 플라크를 피펫에 25마이크로리터의 이중 증류수로 채워진 마이크로 원심분리 튜브로 여러 번 옮깁니다.

튜브를 끓는 물에 5분 동안 그대로 두십시오. 다음 18, 000 시간 G에 실내 온도에 3 분 동안 관을 원심 분리하십시오. 원심분리 직후, 10마이크로리터의 상등액을 40마이크로리터의 PCR 마스터 믹스를 함유한 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

PCR 증폭 후, PCR 정제 키트를 사용하여 cII 유전자 및 그 측면 영역이 통합된 432 염기 파라-증폭 산물을 정제합니다. 그런 다음 DNA 분석기를 사용하여 cII 전이유전자의 염기서열을 분석하여 돌연변이를 검출합니다. titer 20 및 titer 100 플레이트에서 얻은 플라크는 어두운 배경에 흰색 라이트 박스 옆에 놓으면 명확하게 볼 수 있습니다.

여기에서 막대 플롯은 테스트된 물리적 화합물에서 다양한 화학 물질의 돌연변이 유발 효능을 나타냅니다. 이것은 마우스 배아 섬유 모세포에서 분리된 상대적인 cII 돌연변이 빈도의 증가 정도를 분석하여 수행됩니다. 막대 플롯은 cII 돌연변이 빈도에서 통계적으로 유의미한 폴드 증가를 보여주는 이러한 모든 테스트 시약을 보여줍니다.

다음으로, UVB가 조사된 마우스 배아 섬유 모세포에서 cII 전이유전자의 돌연변이 스펙트럼을 입증합니다. 파이 차트는 대조군과 비교할 때 피리미딘 디뉴클레오티드에서 단일 또는 탠덤 시티딘에서 티미딘으로의 상대 빈도가 크게 증가했음을 보여줍니다. 일단 숙달되면 이 기술을 적절하게 수행하면 배양 시 박테리아 줄무늬 플레이트를 준비하는 시간을 제외하고 8시간에서 10시간 안에 완료할 수 있습니다.

DNA 염기서열분석에서, cII 돌연변이체를 채점한 후. 이 동영상을 시청한 후에는 체외 모델 시스템에서 테스트 화합물의 돌연변이 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.