Name: 선택 하는 람다 cII 돌연변이 탐지 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 학습하세요 Lambda Select cII 돌연변이 분석법을 통해 화학적 및 물리적 물질의 돌연변이 유발성을 평가하는 방법을 배우세요. 이 기술은 포유류 세포에서 염색체 통합 리포터 유전자를 활용하여 다양한 시험 화합물의 유전독성을 정밀하게 분석합니다.

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우리는 모든 동료의 기여 금 및 그 결과에 추천 된이 원고 (예시)에 대 한 우리의 원래 연구에 공동 작업자를 인정 하 고 싶습니다. 작가 작품은 AB (California Tobacco-Related 질병 연구 프로그램의 대학 및 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구는 건강의 국가 학회 (1R01DE026043) ab의 교부 금에 의해 지원 TRDRP-26IR-0015)와 세인트 (TRDRP-25IP-0001). 연구의 스폰서 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 데이터 해석, 보고서의 작성 또는 게시를 위해 제출 하는 결정에 있는 역할을 했다.

1. 게놈 DNA 절연 마우스 미 발달 섬유 아 세포에서
참고: 기본 마우스 미 발달 섬유 아 세포는53게시 된 프로토콜 따라 BB 유전자 변형 마우스 C57BL/6 유전 배경에서 파생 된 배아에서 격리 됩니다. 1 x 107 배아 섬유 아 세포 세포 제어 복합 대 테스트와 치료 1 x 106 이 프로토콜에 대 한 시작 물자에 의하여 이루어져 있다. 참조10,,5455는 수확 하 고 표준 방법을 사용 하 여 이러한 셀의 계산을 참조 하십시오.
<ol><li>준비는 (0.3 M 자당, 60 m m KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5 m m spermidine, 0.15 m m spermine와 2 mM EDTA) 버퍼, 버퍼 B (150 m m NaCl 및 5 m m EDTA, pH 7.8), 및 C (20 mM Tris HCl, pH 8.0 버퍼 20 mM NaCl, 20 mM EDTA, 그리고 1 %SDS) 미리, 및 최대 1 년54,55실 온 (RT)에서 보존.</li>
	<li>넓은 사용 하 여 위아래로 pipetting 반복 하 여 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 내경 1000 µ L 피 펫 팁 2-4 mL 버퍼에 셀 resuspend</li>
	<li>한 볼륨 (2-4 mL) 버퍼 A 포함 1 %octylphenoxypolyethoxyethanol (예를 들어, Nonidet P40) 추가 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여.</li>
	<li>5 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.</li>
	<li>1000 x g 실시간에 5 분 동안에 관을 원심</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 10-15 mL 버퍼 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하는 펠 릿을 세척.</li>
	<li>2-4 mL 버퍼 B. 펠 릿 resuspend</li>
	<li>한 볼륨 (2-4 mL)가 버퍼 C에 포함 600 µ g/mL 가수분해 K. 추가</li>
	<li>37 ° c.에 3 h에 대 한 튜브를 품 어</li>
	<li>100 µ g/mL의 최종 농도에 RNase A를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 추가 1 시간에 대 한 튜브를 품 어</li>
	<li>추가 한 볼륨 (2-4 mL) 페 놀 (0.1에서 포화 M Tris HCl, pH 8.0):chloroform:isoamyl 알코올 (25:24:1 vol/vol). 참고: 페 놀 심각한 건강 위험 포즈 수 있습니다 고 극단주의 함께 처리 되어야 합니다. 페 놀 피부에 높게 부식성 이며, 그것을 통해 쉽게 흡수 하 고 다른 효과 전시. 이중 gloving 사용 항상 페 놀, 처리, 보호 안경 착용 및 화학 증기 두건.</li>
	<li>튜브 회전에서 4 ° c.에 5 분 동안 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합</li>
	<li>1000 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 관을 원심</li>
	<li>수성 단계 (상위 계층) 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 새 튜브를 제거 합니다.</li>
	<li>수성 단계는 명확 하 고 인터페이스는 더 이상 탁 될 때까지 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 추출 1 ~ 3 회 반복 합니다.</li>
	<li>1/10 볼륨 (200-400 µ L) 3 M 아세트산 나트륨, pH 5.2 추가 합니다.</li>
	<li>(냉장) 2.5 볼륨 (5-10 mL) 100% 에탄올을 추가 하 고 2-3 분 위해 손으로 부드럽게 튜브를 반전.</li>
	<li>유리 걸이를 가진 DNA 스풀 및 70 %1-5 mL를 포함 하는 새로운 관에 전송 에탄올 철저 하 게 씻어. 또는, 고속 (3500 x g) 튜브 DNA를 작은 그것을 70 %1-5 mL을 철저 하 게 세척 하 4 ° C에서 원심 에탄올.</li>
	<li>RT에 고속 (3500 x g) 튜브 원심, 상쾌한, 제거 하 고 10-15 분에 대 한 DNA를 건조.</li>
	<li>10-100 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), DNA를 녹이 고 또는 (더 긴 저장 기간) 동안-20 ° C에서 4 ° C (최대 1 개월의 짧은 스토리지)에 저장. Λ 선택 cII 분석 결과 대 한 DNA에 대 한 최적 농도 0.5-1.0 µ g / µ L (에 테 버퍼)56.</li>
</ol>2. 포장 반응 생체 외에서
<ol><li>1 개 포장 반응 당 ~ 5 µ g 게놈 DNA를 추가 (최종 볼륨: 8-12 µ L, genomic DNA에서 마우스 미 발달 섬유 아 세포 치료 생체 외에서 시험 화합물 이나 컨트롤 섹션 1 에 분리 되었습니다) 첫 번째를 포함 하는 microcentrifuge 튜브를 반응 혼합 (~ 10 µ L)입니다. 참고: 자체 준비 또는 상용 λ 포장 추출 다른 실험실에 사용 됩니다. 상업 포장에 추출 키트 사용 여기56 ( 테이블의 자료를 참조), 빨간 튜브 포함 된 첫 번째 반응 혼합 (~ 10 µ L) 및 파란색 튜브 포함 된 두 번째 반응 혼합 (적어도 5 반응 ~ 70 µ L).</li>
	<li>30 ° c.에 90 분에 대 한 튜브를 품 어</li>
	<li>튜브를 두 번째 반응 혼합의 필요한 볼륨 (~ 12 µ L)를 추가 합니다.</li>
	<li>30 ° c.에 추가 90 분에 대 한 튜브를 품 어</li>
	<li>
튜브를 SM 버퍼의 1.1 mL를 추가 합니다. 참고:이 솔루션 (즉, 포장 반응 혼합물)의 1 mL 사용 됩니다 λ cII심사-돌연변이. 나머지 titering 사용 될 것입니다.<ol>
<li>5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4.7H2O, 50 mL를 혼합 하 여 SM 버퍼 를 준비 1 M Tris HCl (pH 7.5), 그리고 5 mL 2% (w/v) 젤라틴. DH2O 1 리터, 최대 1 년 동안 실 온에서 30 분이 게에 대 한 고압의 최종 볼륨을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>와 10에 대 한 패키지 DNA 샘플을 포함 하는 관 동 RT (활기찬 vortexing)에 s.</li>
	<li>펄스를 사용할 준비가 될 때까지 microcentrifuge에 게 얼음에 튜브를 회전 합니다. 샘플 포장의 같은 날에 내에서 사용 하려고 하지 않습니다, 경우 추가 포장된 DNA의 mL 당 클로 프롬의 50 µ L 샘플, 소용돌이 부드럽게, 그리고 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장.</li>
</ol>3. 준비 대장균 G1250 세균성 문화
<ol><li>
최소 2 일 전에 도금, TB1-대 한 천 배지에서 대장균 (대장균) G1250에서 몇 가지 세균성 줄무늬 접시를 확인 합니다.
	<ol>
<li>TB1-대 한 천 배지를 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl, 10.0 g 카 세 인 펩, 그리고 12.0 g 한 천. 800 mL dH2오 추가 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염을 추가 합니다. NaOH와 HCl 추가 7.0에 pH를 조정 dH2O 1 리터의 최종 볼륨을.</li>
		<li>믹스 잘와 30 분 55 ° c에 냉각 하는 허용에 대 한 오토 클레이 브 대 50.0 mg을 추가 하 고 혼합. 살 균 100 mm 페 트리 접시 (접시 당 20-25 mL)에 부 어. 2 주 동안 4 ° C에서 접시를 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적어도 24 h에 대 한 고정 30 ° C 배양 기에서 세균성 줄무늬 접시를 품 어.</li>
	<li>
도금, 전에 1 일 TB1 액체 매체의 10 mL를 100 µ L 살 균 50 mL 스크류 캡 원뿔 관에서 20% (w/v) 맥 아당 1 M MgSO4 솔루션의 결합.
	<ol>
<li>TB1 액체 매체를 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl 및 10.0 g 카 세 인 펩, 800 mL dH2O, 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염을 추가 하 고 NaOH와 HCl 7.0에 pH를 조정. 다음 1 리터의 최종 볼륨을 dH2O를 추가, 최대 3 개월까지 잘하고 압력솥 30 분 저장소 RT에서 매체에 대 한 믹스.</li>
		<li>20% (w/v) 맥 아당 1 M MgSO4 를 다음과 같이 준비 합니다. 20.0 g 맥 아당과 24.6 g MgSO4혼합. 7 H2O, dH2O 100 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다. 필터를 소독 하 고 최대 6 개월까지 4 ° C에서 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 inoculating 루프56를 사용 하 여 세균성 줄무늬 접시에서 여러 식민지와 액체 매체 접종</li>
	<li>활기찬 동요 (250-300 rpm)으로 인큐베이터를 떨고 30 ° C에서 하룻밤 액체 문화를 품 어.</li>
	<li>도금의 날, 작은 세균 세포를 실시간에 10 분 동안 1500 x g 에서 G1250 액체 문화를 포함 하는 원뿔 튜브 원심.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 10mm MgSO410 mL에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>1시 10분의 흡 광도 측정 파장 600 nm 대 일 분 광 광도 계 (예를 들어, 100 µ L 세포 현 탁 액 + 900 µ L 10 m m MgSO4)56를 사용 하 여 세포 현 탁 액의 희석.</li>
	<li>10mm MgSO4로 0.5의 최종 세600 세포 현 탁 액을 희석. OD600 와 G1250 대장균 의 준비 정지 = 0.5 'G1250 도금 문화' 라고 합니다.</li>
	<li>얼음에 G1250 도금 문화를 저장 하 고 1-2 시간 이내에 사용.</li>
</ol>4. 도금 패키지 DNA 샘플
<ol><li>
한 패키지 DNA 샘플 당 16 살 균 14 x 100 m m2 라운드-하단 튜브와 16 TB1 한 천 배지를 준비 합니다. 각 세트에서 10 개 심사 및 6 titering (Titer 20 3) 및 Titer 100 세에 대 한 사용 됩니다.
	<ol>
<li>TB1 한 천 배지를 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl, 10.0 g 카 세 인 펩, 12.0 g 한 천, 다음 추가 800 mL dH2O, 그리고 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염. NaOH와 HCl, 7.0에 pH를 조정 하 고 추가 dH2O l. 1의 최종 볼륨을</li>
		<li>잘 혼합 하 고 30 분에 대 한 고압 수 55 ° C에 냉각 후 살 균 100 mm 페 트리 접시 (접시 당 20-25 mL)에 부 어 혼합. 2 주 동안 4 ° C에서 접시를 저장. 참고: TB1 한 천 배지 적어도 24 h 사용 하기 전에 준비 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 200 µ L의 각 라운드 하단 튜브에 G1250 도금 문화.</li>
	<li>
Titering에 대 한, 포장된 DNA 샘플의 1: 100 희석 만들고 vortexing (즉, 10 µ L 포장 DNA 샘플 + 990 µ L SM 버퍼)에 의해 잘 혼합.</li>
	<li>각 3 Titer 20 튜브의 1: 100 희석의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>각 3 Titer 100 튜브의 1: 100 희석의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>
심사에 대 한, 100 µ L의 추가 'undiluted' 10 심사 관의 각 포장된 DNA 샘플.</li>
	<li>모든 titering 및 심사 관 처리 (2 x 3 + 10 = 16 관), 다음과 같이: 대략 10에 대 한 vortexing에 의해 잘 섞어 s, 그리고 다음 호스트는 페이지 adsorb 대장균 수 있도록 30 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
	<li>
Microwaved 녹은 TB1 (55 ° C에 냉각) 한 천 각 titer 위쪽 또는 심사 관, 혼합 즉시 vortexing (부드럽게), 2.5 mL를 추가 하 고 적절 한 titer에 붓는 또는 TB1 한 천 배지를 심사.
	<ol>
<li>TB1 최고 천 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl, 10.0 g 카 세 인 펩, 및 7.0 g 한 천, 800 mL dH2오 추가 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염, 추가 다음 NaOH와 HCl 7.0에 pH를 조정 합니다. 마지막으로, 1 리터의 최종 볼륨을 dH2O를 추가 합니다.</li>
		<li>최대 3 개월까지 잘하고 압력솥 실 온에서 20-25 분 저장소에 대 한 믹스.</li>
		<li>사용 전에 전자 레인지에 준비 TB1 최고 한 천 녹, 잘, 혼합 하 고 물 욕조에 55 ° C에 냉각 허용. 참고: 용융 냉각된 TB1 가기 각 titer 또는 심사 관의 내용에 추가 되 고 혼합 후, 적절 한 titer 또는 심사 TB1 한 접시에 부 어 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>접시 뚜껑 열려 응축을 방지 하기 위해 실 온에서 15-30 분 동안 서 보자.</li>
	<li>번호판을 반전 및 10 심사 플레이트 고정 24 ° C 인큐베이터에 배치 및 46-48 h (즉, 선택적 조건) 및 6 titer 플레이트 고정 37 ° C 배양 기에서 품 어와 24 h에 대 한 품 어 / (즉, 하룻밤 선택적 비 조건)입니다. 참고: 품질 보증 및 결과의 표준화, 상용 컨트롤 페이지 솔루션 알려진 돌연변이 주파수 wildtype 돌연변이 cII 의 혼합물을 포함 하는 패키지 DNA 샘플 함께 도금 및 모두에 포함 분석 결과56을실행합니다.</li>
</ol>5. 검사 Titer 상영 판 cII 돌연변이 주파수를 결정 하
<ol><li>37 ° C에서 24 h/하룻밤 인큐베이션, 다음 수 패의 수 각각 3 Titer 20 접시 및 Titer 100 판 형성. 플 라크를 쉽게 식별 하려면 잡고 접시와 어두운 배경 흰색 빛 상자 옆 뚜껑 ( 그림 2참조) 제거.</li>
	<li>확인 플 라크의 숫자의 평균 (평균) Titer 20 접시와 Titer 100 플레이트의 각 집합에서 계산 (triplicate, 각각).</li>
	<li>접시 세트 당 50-200 플 라크의 범위에 가장 가까운 폭포 titer 격판덮개의 세트에서 평균을 선택 합니다.</li>
	<li>다음과 같이 10 상영 판에서 상영 하는 플 라크의 총 수를 계산. 상영 패 총 (titer 접시 ÷ µ L 희석의 수가 선택한 titer 접시 당 사용의 선택한 세트에서 플 라크의 평균 수) = 희석 요인 x x 판 [100 µ L/접시] 심사 당 포장된 DNA 샘플의 µ L의 수 접시 [10] 상영의 x 숫자. 참고: 예를 들어 Titer 20 접시 세트에서 접시 당 패의 평균 수는 128와 Titer 100 격판덮개의 세트에 상응 하는 숫자는 478, 번호 128 사용 됩니다 상영 하는 플 라크의 총 수의 계산 다음과 같이: (128 ÷ 20) x 100 [희석 요소] x 100 [µ L/판] x 10 [플레이트] 640,000 = 이것은 평균 수 기반 이면 Titer 20 또는 Titer 100 판에서 각각 5000 또는 1, 000, 플 라크의 평균 수를 곱한 것과 같습니다.</li>
	<li>46-48 h 24 ° C에 외피, 다음 10 심사 접시 (섹션 5.1에서 제공 하는 지침에 따라)에 형성 된 플 라크의 총 수를 계산 합니다. 참고: cII 돌연변이 주파수 상영 하는 플 라크의 총 수로 심사 격판덮개에 형성 된 플 라크의 총 수를 나누어 계산 됩니다. 112는 플 라크의 총 수 10 심사 접시에 계산 하는 경우에 위의 예제를 사용 하 여,이 DNA 샘플 cII 돌연변이 주파수 112 ÷ 640,000 = 17.5 x 10-5.</li>
</ol>6. Putative λ cII 돌연변이의 확인, PCR 확대, 및 DNA 시퀀싱
<ol><li>코어에 살 균, 넓은 구멍 피펫으로 팁과 질문에 플 라크와 살 균 SM 버퍼의 500 µ L을 포함 살 균 microcentrifuge 관으로 (아래로 pipetting)에 의해 추방.</li>
	<li>실 온에서 2 h 이상 incubate 또는 4 ° c 하룻밤, 살 균 소 입자는 agar에서 elute를 허용 하도록 연결 합니다.</li>
	<li>살 균 14 x 100 m m2 라운드-하단 튜브에서 코드 페이지 솔루션의 1 µ L 200 µ L G1250 도금 문화의 혼합 하 고 실시간에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>55 ° C 용융 TB1 최고 agar의 2.5 mL를 사용 하 여 샘플 접시 하 고 섹션 4.8-4.10에 설명 된 대로 46-48 h (선택 조건), 24 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>일단 보조 플 라크 형성, 피 펫 팁을 사용 하 여 단일 잘 격리 된 검증된 λ cII를 신중 하 게 선택-돌연변이 패 (낮은 agar를 만지지 마십시오). 참고: 두 가지 목적을 제공 Replating putative cII 돌연변이 패: (i) 유물을 도금 수 있습니다 가끔 오인 될 소형 패; 그리고 (ii) 검열 판에서 가져온 agarose 코어 비 돌연변이 phage(s) 돌연변이 살 균 소에 함께 포함 될 수 있습니다. 저밀도 replating에서 2 차 패 PCR 및 후속 DNA 순서 분석에 대 한 오염된 돌연변이 서식 파일을 제공 합니다.</li>
	<li>아래로 pipetting으로 25 µ L 이중 증 류 물을 포함 하는 microcentrifuge 튜브에 플 라크를 전송.</li>
	<li>끓는 5 분 동안 물에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>최대 속도 (18000 x g)에 실시간에 3 분간 원심</li>
	<li>시 약의 최종 농도 1 x Taq PCR 버퍼, 10 pmol 각 정방향 및 역방향 뇌관의 각 dNTP의 12.5 nmol PCR mastermix의 40 µ L을 포함 하는 새로운 microcentrifuge 관에는 상쾌한의 10 µ L를 즉시 전송 및 2.5 U Taq DNA 중 합 효소의. 참고: 정방향 및 역방향 뇌관은 다음과 같습니다: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' ( cII 기준-50-68 시작 codon 위치) 및 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (위치 cII 시작 codon 기준으로 365 +345), 각각.</li>
	<li>다음 자전거 매개 변수를 사용 하 여 템플릿을 증폭: 95 ° C에서 3 분 변성 30 30 사이클 뒤에 s 95 ° C, 60 ° C에서 1 분에 72 ° c.에서 10 분의 최종 확장명이 72 ° C에서 1 분</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 cII 유전자를 포함 하 고 상업적으로 이용 가능한 PCR 정화 키트를 사용 하 여 영역을 노릴 432 bp PCR 제품을 정화.</li>
	<li>적절 한 시퀀싱 플랫폼을 사용 하 여 DNA 시퀀싱을 수행 하 고 cII transgene의 돌연변이 검색 결과 DNA 시퀀스 분석 (아래 참고 참조). 참고:이 최고의 T 커피 시퀀스 정렬 웹 기반 서버 소프트웨어를 사용 하 여 참조 cII 시퀀스와 정렬에 의해 달성 된다. 프로그램을 사용 하는 방법에 대 한, 방문: <a href="http://tcoffee.crg.cat/">http://tcoffee.crg.cat/</a>
</li>
</ol>

모든 저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

Λ 선택 cII 분석 결과 BB 설치류3의 장기/조직에서 파생 된 세포의 게놈 DNA에서 복구 cII transgene에 변이의 탐지를 위해 사용 됩니다. 이러한 유전자 변형 동물의 게놈 cII 운반 하는 chromosomally 통합된 λLIZ 셔틀 벡터의 여러 탠덤 복사본이 포함 (294 bp)와 lacI (1080 bp) transgenes mutational 리포터 유전자1, 2 , 25. λ 선택 cII 분석 결과 세포/조직 구조 벡터의 포장 뒤에 적절 한 호스트를 감염 시킬 수 있는 λ 살 균 소 머리에 유전자 변형 동물의 게놈 DNA에서 λLIZ 셔틀 벡터의 검색에 따라 E. 콜라 이입니다. 감염 된 박테리아 점수...

다양 한 유전자 변형 동물 모델 및 돌연변이 탐지 시스템 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위해 개발 되었습니다. 이들의 유전자 변형 (라고도 BB) 빅 블루 마우스 및 돌연변이 탐지 시스템 λ 선택 cII 있다 변이 실험에 의해 고용 되었다이 그룹 및 많은 다른 연구 그룹 전세계1,2, 3,,45,6,7,,89. 지난 16 년 동안, 우리가이 유전자 변형 동물을 사용 하 여 다양 한 화학 및 물리적 에이전트의 변이 원 성 영향 조사 또는 자신의 해당 미 발달 섬유 아 세포 세포 배양 시험 화합물으로 치료 하 고 이후에 분석은 표현 형 및 λ 선택 cII 분석 결과와 DNA 시퀀싱, 각각10,,1112,,1314 cII transgene의 유전자 형 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. 유전자 변형 동물의 게놈 다중 복사 머리-투-꼬리 concatemer1,,2254 염색체에 통합 된 살 균 소 λ 셔틀 벡터 (λLIZ) 포함 되어 있습니다. ΛLIZ 셔틀 벡터 운반 두 mutational 리포터 유전자, 즉 lacI 및 cII transgenes1,2,25,,2627, 28,29,30,31,32,33,,3435,36, 37,38,39,40,41,42,43,,4445 , 46 , 47. λ 선택 cII 분석 결과 유전자 변형 동물1,2,25의 기관/조직에서 파생 된 세포의 게놈 DNA에서 λLIZ 셔틀 벡터의 회복에 따라 . 복구 된 λLIZ 셔틀 벡터 다음 λ 살 균 소 머리 표시기 호스트 대장균감염의 수에 포장 됩니다. 그 후, 감염 된 박테리아는 점수 및 cII transgene1,3에 있는 돌연변이의 분석에 대 한 수 있도록 선택적 조건 하에서 성장 된다.
여기, 우리가 치료 하는 유전자 변형 동물에 체 외에서의 셀/기관에서 게놈 DNA의 분리를 이루어져 있는 λ 선택 cII 분석 결과 대 한 자세한 프로토콜 설명 /vivo에 는 λLIZ의 시험 화합물, 검색으로 셔틀 벡터 genomic DNA에서 전염 성 λ 페이지, 살 균 소, cII의 id와 호스트 대장균 의 감염에는 벡터의 포장- cII 돌연변이 주파수를 결정 하는 선택적 조건 돌연변이 및 CII 돌연변이 스펙트럼을 설정할 DNA 순서 분석. 프로토콜 유전자 변형 마우스/쥐 셀 문화 치료 체 외에 관심, 화학/물리 에이전트에 적용할 수 또는 해당 동물의 조직/장기에서 치료 vivo에서 테스트 화학/에이전트1, 2,4,48,49,50,,5152. Λ 선택 cII 분석 결과의 프레 젠 테이 션이 회로도 그림 1에 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>한천</td><td>MO 바이오 연구소, Inc.</td><td>12112-05</td><td>세균 등급</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 주기 염기서열 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>없음</td></tr><tr><td>카제인 펩톤</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26557</td><td>없음</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td>분말</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>없음</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 9724-500</td><td>없음</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 PCR 정제 반응</td></tr><tr><td>아세테이트 나트륨 Trihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-15756</td><td>None</td></tr><tr><td>Taq5000 DNA 중합효소&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>없음</td></tr><tr><td>티아민 염산염</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2722-57</td><td>없음</td></tr><tr><td>트랜스팩 포장 추출물</td><td>Stratagene Corp., BioReliance에 인수 | 시그마-알드리치 주식회사</td><td>200223</td><td>50 패키징 반응</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>없음</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>생명과학</td><td>RC-110</td><td>없음</td></tr></tbody></table>

선택 하는 람다 cii 돌연변이 탐지 시스템

The Lambda Select cII Mutation Detection System

유전자 변형 동물 모델 및 돌연변이 탐지 시스템의 수 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위해 개발 되었습니다. 이들의 유전자 변형 생쥐와 돌연변이 탐지 시스템 람다 (λ) 선택 cII 되었습니다 고용 했다 변이 실험에 대 한 전 세계 많은 연구 그룹에 의해. 여기, 우리가 선택 하는 람다 cII 돌연변이 분석 결과, 유전자 변형 쥐/쥐의 배양된 세포에 적용 될 수 있는 대 한 자세한 프로토콜 설명 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트와 치료. 프로토콜은 다음 단계로 구성 됩니다: 세포에서 게놈 DNA의 (1) 절연 또는 유전자 변형 동물의 기관/조직 치료 생체 외에서 또는 vivo에서각각, 시험 화합물; (2) 게놈 DNA;에서 mutational 리포터 유전자 (즉, cII transgene) 들고 람다 셔틀 벡터의 복구 (3) 포장 구조 벡터의 전염 성 살 균 소;에 (4) 호스트 박테리아를 감염 하 고 유도 cII 돌연변이;의 전파 수 있도록 선택적 조건 하에서 배양 그리고 (5) 득점 cII-돌연변이 DNA 순서 분석을 cII 돌연변이 주파수 및 돌연변이 스펙트럼, 각각.

데이터 배포에 따라 패라메트릭 또는 비-파라 메 트릭 테스트 치료 및 제어 그룹 (즉, 자연 스러운 돌연변이 주파수 대 유도) cII 돌연변이 주파수 차이의 중요성을 결정 하기 위해 사용 됩니다. . 다른 치료 그룹 유도 cII 돌연변이 주파수의 비교에 의해 이루어집니다 다양 한 (인덱스도) 적용으로 통계적 테스트. 주파수를 비교 하는 χ2 테스트 또는 분산 분석 (ANOVA), 같은 다른 테스트를 사용할 수 있습니다 있지만 아담스 및 Skopek의 초기 하 시험 전체 유도-그리고 자연 스러운 돌연변이 스펙트럼57, 비교 하 일반적으로 사용 (예를 들어, 전환, transversion, 삽입 또는 삭제) 돌연변이 유도 및 제어 돌연변이 스펙트럼 사이 또는 다른 화학 물질/대리인 또는 동일의 다양 한 복용량에 의해 유도 된 다양 한 돌연변이 스펙트...

우리는 유전자 변형 쥐의 배양된 세포에 람다 선택 cII 돌연변이 분석 결과 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트 처리에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 접근은 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위한 널리 사용 되었습니다.

선택 하는 람다 cII 돌연변이 탐지 시스템

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 형질전환 설치류 또는 관심 화학 및 물리적 제제로 처리된 해당 동물의 배양된 세포에서 Lambda Select cII 돌연변이 분석과 관련된 단계별 절차를 시각화하는 것입니다. 이 테스트 방법은 다음과 같은 돌연변이 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그리고 만약 그렇다면, 그것은 얼마나 강력한 돌연변이 유발 물질입니까?염기서열 특이적 돌연변이를 유도합니까? 이 기술의 주요 장점은 거의 모든 테스트 컴파운드에 최소한이라는 것입니다. 이 방법은 염색체로 통합된 리포터 유전자를 사용하여 포유류 세포의 돌연변이원성 검사에 사용할 수 있습니다.단일 패키징 반응을 구성하기 위해 첫 번째 반응 혼합물을 포함하는 마이크로 원심분리 튜브에 5마이크로그램의 게놈 DNA를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 90분 동안 튜브를 배양합니다. 배양 후 두 번째 반응 혼합물 12마이크로리터를 튜브에 넣고 섭씨 30도에서 90분 더 그대로 둡니다.90분 후 튜브에 1.1ml의 SM 완충액을 추가합니다. 그런 다음 포장된 DNA가 있는 튜브를 실온에서 약 10초 동안 격렬하게 와류시킵니다. 마이크로 원심분리기에서 빠르게 펄스 스핀을 제공합니다.그런 다음 사용할 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 다음으로, 포장된 DNA의 각 밀리리터에 대해 50마이크로리터의 클로로포름을 추가합니다. 샘플이 당일에 처리되지 않으면 샘플을 부드럽게 소용돌이치고 섭씨 4도에서 최대 2주 동안 보관하십시오.단일 포장된 DNA 검체를 위해 16개의 멸균 원형 바닥 튜브와 16개의 TB1 한천 플레이트를 준비합니다. 스크리닝에 10개의 튜브를 사용하고 적정에 6개의 튜브를 사용합니다. 그런 다음 각 둥근 바닥 튜브에 300 마이크로 리터의 G1250 도금 배양을 분주하십시오.다음으로, 역가를 위해 10마이크로리터의 패키징된 DNA를 990마이크로리터의 SM 완충액에 첨가하고 1:100 희석합니다. 그런 다음 샘플을 와류로 만듭니다. 20 또는 100 마이크로리터의 1:100 DNA 용액을 3개의 titer 20 또는 titer 100 튜브 각각에 추가합니다.스크리닝 목적으로 100마이크로리터의 희석되지 않은 패키징된 DNA 샘플을 10개의 스크리닝 튜브 각각에 추가합니다. 16개의 적정 및 스크리닝 튜브를 모두 처리합니다. 구성 요소를 혼합하기 위해 10초 동안 튜브를 소용돌이칩니다.그런 다음 숙주 E.coli가 파지를 흡수할 수 있도록 실온에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. 다음으로, 2.5 밀리리터의 용융 TB1 상단 한천을 추가합니다. 적절한 적정 및 스크리닝 튜브까지 섭씨 55도를 유지하십시오.첨가 후 즉시 튜브를 부드럽게 와류로 만듭니다. 이제 TB1 한천을 적절한 역가 또는 스크리닝 TB1 한천 플레이트에 붓습니다. 접시를 실온에서 15-30분 동안 그대로 두십시오.한천이 응고되면 뒤집어서 10개의 스크리닝 플레이트를 모두 섭씨 24도의 고정식 인큐베이터에 46-48시간 동안 그대로 둡니다. 나머지 6개의 역가 플레이트는 섭씨 37도의 고정식 인큐베이터에 하룻밤 또는 하루 동안 그대로 두십시오. 섭씨 37도에서 배양한 후 3개의 titer 20 및 titer 100 플레이트에 모두 형성된 플라크의 수를 계산합니다.섭씨 24도에서 배양 후 10 개의 스크리닝 플레이트에 형성된 플라크의 수를 계산합니다. 추정되는 돌연변이 플라크를 확인하려면 멸균 광경 피펫 팁으로 플라크를 코어링합니다. 그런 다음 플라크를 500마이크로리터의 멸균 SM 완충액으로 채워진 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.그런 다음 마이크로 원심분리 튜브를 실온에서 최소 2시간 동안 실온에서 배양합니다. 다음으로, 1마이크로리터의 코어드 파지 용액과 200마이크로리터의 G1250 도금 배양을 멸균된 원형 바닥 튜브에 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다.30분 후, 코어가 있는 파지 용액을 2.5ml의 용융된 TB1 상단 한천에 플레이트를 만들고 섭씨 24도에서 46-48시간 동안 배양합니다. 2차 플라크가 보이면 피펫 팁을 사용하여 잘 분리된 Lambda cII 돌연변이 플라크 하나를 선택합니다. 플라크를 피펫에 25마이크로리터의 이중 증류수로 채워진 마이크로 원심분리 튜브로 여러 번 옮깁니다.튜브를 끓는 물에 5분 동안 그대로 두십시오. 다음 18, 000 시간 G에 실내 온도에 3 분 동안 관을 원심 분리하십시오. 원심분리 직후, 10마이크로리터의 상등액을 40마이크로리터의 PCR 마스터 믹스를 함유한 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.PCR 증폭 후, PCR 정제 키트를 사용하여 cII 유전자 및 그 측면 영역이 통합된 432 염기 파라-증폭 산물을 정제합니다. 그런 다음 DNA 분석기를 사용하여 cII 전이유전자의 염기서열을 분석하여 돌연변이를 검출합니다. titer 20 및 titer 100 플레이트에서 얻은 플라크는 어두운 배경에 흰색 라이트 박스 옆에 놓으면 명확하게 볼 수 있습니다.여기에서 막대 플롯은 테스트된 물리적 화합물에서 다양한 화학 물질의 돌연변이 유발 효능을 나타냅니다. 이것은 마우스 배아 섬유 모세포에서 분리된 상대적인 cII 돌연변이 빈도의 증가 정도를 분석하여 수행됩니다. 막대 플롯은 cII 돌연변이 빈도에서 통계적으로 유의미한 폴드 증가를 보여주는 이러한 모든 테스트 시약을 보여줍니다.다음으로, UVB가 조사된 마우스 배아 섬유 모세포에서 cII 전이유전자의 돌연변이 스펙트럼을 입증합니다. 파이 차트는 대조군과 비교할 때 피리미딘 디뉴클레오티드에서 단일 또는 탠덤 시티딘에서 티미딘으로의 상대 빈도가 크게 증가했음을 보여줍니다. 일단 숙달되면 이 기술을 적절하게 수행하면 배양 시 박테리아 줄무늬 플레이트를 준비하는 시간을 제외하고 8시간에서 10시간 안에 완료할 수 있습니다.DNA 염기서열분석에서, cII 돌연변이체를 채점한 후. 이 동영상을 시청한 후에는 체외 모델 시스템에서 테스트 화합물의 돌연변이 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

이 동영상은 DNA 샘플에서 indel 돌연변이를 식별하는 데 있어 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응의 역할을 보여줍니다. ddPCR의 높은 정밀도와 감도는 낮은 수준에서도 샘플에 존재하는 희귀 돌연변이를 정확하고 일관되게 검출할 수 있습니다. 게놈의 여러 영역에서 indel 돌연변이를 식별하고 정량화할 수 있으며, 이를 통해 돌연변이의 메커니즘과 이러한 돌연변이의 기능적 결과에 대한 귀중한 통찰력을 얻을  수 있습니다.

타겟 유전자의 Indel 돌연변이 검출을 위한 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 (~0.5–2.0%)의 높은 오류 속도 의해 제한 되는 genomic 특성 분석을 위한 강력한 도구입니다. NGS 오류율을 제거 하 고 변형 대립 유전자 분수 0.0001 희귀에서 변이 감지 수 있는 오류 수정 시퀀싱의 우리의 방법을 설명 합니다.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

여기, 우리 남부 럽 그리고/또한 PCR를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 발생 하는 동종 재결합 이벤트를 식별 하는 데 자세한 프로토콜 제시. 이 메서드는 nonmuscle myosin II 유전자 대체 마우스 모델 기술을 사용 하 여 전통적인 배아 줄기 세포 기반 동종 재결합 중재 대상의 세대에 의해 exemplified입니다.

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

양적 살인자 세포 수용 체 면역 글로불린 같이 (키 르) 반자동 입력 (qKAT) 인구와 질병 협회 연구에 그들의 응용 프로그램에 대 한 숫자 형식 키 르 유전자를 복사 하는 간단한, 높은 처리량 및 비용 효율적인 방법입니다.

qKAT: 킬러 세포 같은 면역 글로불린 수용 체 유전자의 양적 반자동 입력

이 기사에서는 혈관면역모세포 림프종에서 Sanger 염기서열분석을 기반으로 하는 저주파 검출 방법의 적용을 소개합니다. 이 방법을 다른 질병에 적용할 수 있는 근거를 제공합니다.

저빈도 체세포 돌연변이 검출을 위한 Sanger 염기서열분석과 결합된 야생형 차단 PCR

이 프로토콜은 전체 세포의 급속한 탐지 다음 토마토와 다른 신선한 농산물의 표면 샘플링을위한 간단한 접착제 테이프 기반의 접근 방식을...

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

우리는 처리 방법을 설명하고 화면의 필드 수집 베로 세포 배양 분석에 의해 바이러스의 다양성을 위해 모기. 이 기술을 채용함으로써, 우리는 코네티컷에서 수집한 모기 4 taxonomic 가정에서 9 가지 바이러스를 감지했습니다.

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

학습하세요 Lambda Select cII 돌연변이 분석법을 통해 화학적 및 물리적 물질의 돌연변이 유발성을 평가하는 방법을 배우세요. 이 기술은 포유류 세포에서 염색체 통합 리포터 유전자를 활용하여 다양한 시험 화합물의 유전독성을 정밀하게 분석합니다.

선택 하는 람다 cII 돌연변이 탐지 시스템

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