Name: 마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 신생 마우스에서 O4 양성 올리고덴드로사이트를 면역자기 분리하는 방법을 통해 신경과학 및 수초 형성 연구를 수행하세요. 이 기술은 80% 이상의 순도로 세포를 신속하게 분리하여 체외 실험에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 국가 다 발성 경화 증 사회 (RG4591A1/2)와 건강의 국가 학회 (R03NS06740402)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자는 실험실 공간, 장비 및 조언을 제공 하기 위한 박사 이반 에르난데스와 그의 연구실 회원을 감사 합니다.

이 연구에 사용 된 쥐 SUNY Downstate 의료 센터 부문의 실험실 동물 자원 (DLAR) 프로토콜 번호 15-10492의 지침에 따라 마음에 든다고 했다.
참고: 기본 oligodendrocytes 신생아 (P5-P7 야생-타입 C57Bl/6N)에서 고립 된 쥐. 이 단계에서 미 성숙한 OLs 셀룰러 고수익 보장 설치류 백색 물질의 80% 이상 구성 한다. 모든 버퍼 및 시 약 구성 재료의 테이블의끝에 사용할 수 있습니다.
1. Coverslips 준비
참고: 폴 리-D-리 (PDL) / 코팅 laminin coverslips OL 격리 전에 준비 되어야 한다.
<ol><li>장소 #1 독일 50 mL 원뿔 튜브에 coverslips 유리 및 추가 70%의 35 mL EtOH 그들을 청소.</li>
	<li>튜브, nutating 믹서에 닫고 락을 부드럽게 하는 동안 적어도 30 분 동안 실 온에서 품 어. Coverslips는 하룻밤 incubated 수 있습니다.</li>
	<li>70 %EtOH 삭제 합니다.</li>
	<li>Coverslips 이온을 제거 된 물으로 3 회 세척, 물 진공 포부와 함께 모든 시간을 제거 합니다.</li>
	<li>PDL 50 µ g/mL의 30-35 mL 50 mL 튜브, 충분히 커버는 coverslips에에서 coverslips를 추가 합니다.</li>
	<li>Nutating 믹서에 coverslips를 포함 하는 50 mL 튜브를 배치 하 고 적어도 30 분 동안 실내 온도에 온화 하 게 흔든 하는 동안 품 어.</li>
	<li>워시 3 번 물 진공 포부와 함께 모든 시간을 제거 하는 이온된 수로 coverslips.</li>
	<li>60 mm 접시 포함 하는 이온된 수로는 coverslips를 전송 합니다.</li>
	<li>P200 피 펫 팁을 사용 하 여 레이어를 페 트리 접시의 전체 표면을 커버는 coverslips를 정렬.</li>
	<li>조심 스럽게, 진공 포부와 함께 요리에서 물 제거.</li>
	<li>coverslips 주위에 물의 과잉을 제거 하 고 그들이 하룻밤 말리 면 뚜껑 열고와 후드에 자외선 아래. 참고: PDL 코팅 유리 coverslips 저장할 수 있습니다 멸 균 페 트리 디쉬에 4 ° C에서 최대 3 개월.</li>
	<li>장소 잘 당 하나 24-잘 접시로 coverslips 미세 집게를 사용 하 여.</li>
	<li>잘 확인 하 고 가장자리는 우물의 벽을 만지지 마십시오의 센터에 있는 coverslips를 이동 합니다.</li>
	<li>B27NBMA에 희석 10 µ g/mL laminin의 100 µ L를 추가 ( 테이블의 자료를 참조) 각 coverslip의 센터에서 시작 하 고 모든 영역을 커버 원형 패션 가장자리 쪽으로 이동. 참고: 이후 laminin OL 유지 관리에 참여 하 고 성숙한 OLs로 차별화를 추진 하 고, 생체 외에서 문화41,42,,4344한 중요 한 OL 생존 요소 이다.</li>
	<li>접시는 37 ° C 인큐베이터 5% CO2 는 OLs 도금에 대 한 준비가 될 때까지 또는 적어도 1 시간에에서 품 어.</li>
</ol>2. 마우스 뇌 피 질 분리
<ol><li>이전에 70% 에탄올에 청소 하는 위로 빠른 잘린 여 출생 후 5-7 일 오래 된 C57Bl/6N 마우스 새끼를 희생. 참고: 5-6 신생아 쥐 새끼에서 뇌성 외피가 각 준비를 위해 사용 되었다. 평균적으로, 한 쥐의 뇌 1-1.5 x 106 OLs 생성합니다.</li>
	<li>작은 해가 위로 중간 선 따라 두 피 피부를 잘라내어 노출 두개골을 철회.</li>
	<li>뇌의 손상을 방지 하려면가 위 들고 정면 지역으로 두개골 뒤쪽 오프닝에서 시작 하는 중간에 따라 신중 하 게 두개골을 잘라. 그런 다음, 두개골의 기지에 따라 각 눈 소켓으로 잘라 두개골 뒤쪽 열기를 사용 하 여.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여 부드럽게 애타게 하는 midbrain 멀리 외피가 고 B27NBMA의 7 mL를 포함 하는 60 m m 조직 문화 접시에 그들을 전송. 해 부 외피가 풀링 각 두뇌에 대 한 2.2 2.4 통해 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>외피가 분리 버퍼의 5 mL를 포함 하는 새로운 60 m m 조직 문화 접시에 전송 (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain, 그리고 2500 U DNase I).</li>
	<li>#15 메스 블레이드를 사용 하 여 약 1 m m3 의 작은 조각으로 된 외피가 주사위 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기에에서 20 분 동안 품 어.</li>
	<li>소 성장 혈 청 효소 반응을 중지 하 (BGS)의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>10 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브 외피가 분리 미디어 함께 전송.</li>
	<li>부드럽게 천천히를 pipetting으로 뇌 조직의 분열을 시작 하 고 6-8 시간 10 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 아래로 거품을 최소화 하기 위해 관리 사용 하 여.</li>
	<li>2-3 분 동안 정착 하 여 신선한 튜브는 상쾌한 전송 조직 덩어리를 허용 합니다.</li>
	<li>10%를 포함 하는 B27NBMA의 3 mL를 추가 BGS/2500 U DNase I 조직에 작은.</li>
	<li>5 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 위아래로 pipetting 동안 두뇌 조직 해리 번 6-8. 거품을 최소화 하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
	<li>2-3 분 동안 정착 조직 덩어리를 허용 합니다.</li>
	<li>신선한 튜브는 상쾌한 전송. 10%를 포함 하는 B27NBMA의 3 mL를 추가 BGS/DNase I 조직에 작은.</li>
	<li>부드럽게 P1000 피펫으로 팁을 사용 하 여 미디어의 믹스를 pipetting 뇌 조직의 해리와 뇌 조직 위와 아래로. 반복 단계 2.13, 2.14 조직의 더 큰 덩어리 유지 될 때까지 또는 B27NBMA까지 10% 포함 된 BGS/DNase I는 소진, 둘 중 먼저 온다. 거품을 최소화 하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
	<li>풀 세포 현 탁 액 이전 supernatants와.</li>
	<li>50 mL 튜브에서 70 µ m 셀 여과기를 놓습니다. 10 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 전달 풀링된 세포 현 탁 액 부드럽게 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해.</li>
	<li>10%를 포함 하는 B27NBMA의 1 mL을 추가 하 여 셀 여과기를 세척 BGS/DNase I.</li>
	<li>셀 스 트레이너를 삭제 합니다. 30-mL와 함께 B27NBMA 10%를 포함 하는 볼륨가지고 BGS/DNase I.</li>
	<li>두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 셀 서 스 펜 션 200 x g에서 10 분 원심</li>
	<li>상쾌한 공기에 노출 하는 셀을 떠나지 않고 제거 합니다. 상쾌한 세포 파편으로 인해 흐린 될 것입니다. 10%를 포함 하는 B27NBMA의 3 mL를 추가 BGS 펠 릿을.</li>
	<li>조심 스럽게 P1000 피펫으로 사용 하 여 셀 펠 릿 해리. 10%를 포함 하는 B27NBMA와 15 mL에 볼륨을가지고 BGS.</li>
	<li>신선한 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 전달 합니다.</li>
	<li>10%를 포함 하는 B27NBMA의 1 mL을 추가 하 여 셀 여과기를 세척 BGS. 셀 스 트레이너를 삭제 합니다.</li>
	<li>10%를 포함 하는 B27NBMA와 30 mL에 볼륨을가지고 BGS.</li>
	<li>2 x 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 셀 서 스 펜 션 200 x g에서 10 분 원심</li>
	<li>공기에 노출 하는 셀을 떠나지 않고는 상쾌한의 대부분을 제거 합니다. 얼음 차가운 자기 셀 정렬 (MCS) 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
</ol>3입니다. 세포 수 그리고 생존의 결정
<ol><li>100 µ L 세포 현 탁 액의 0.4% (w/v)에 1:5 희석을 달성 하기 위해 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 Trypan 블루 솔루션의 400 µ L로 희석.</li>
	<li>커버 유리 hemocytometer 챔버 및 채우기 셀 희석 P10 피 펫을 사용 하 고 피하의 10 µ L로 두 챔버 연극 센터. 솔루션은 모 세관 작용에 의해 커버 유리 아래에 전달 합니다.</li>
	<li>현미경 단계에는 hemocytometer를 놓고 40 X 확대를 사용 하 여 초점을 조정 합니다. 참고: 셀 카운트 5 사각형 (4 모서리와 한 센터)의 각각에서 휴대용 카운터를 사용 하 여 기록 됩니다. 비-가능한 셀만 염료를 흡수 하 고 블루, 라이브 하는 동안 표시 그리고 건강 한 세포 라운드 및 굴절 밀리 리터 당 실용적이 고 전체 셀의 수의 결심에 대 한 수 있도록 블루 색 염료를 흡수 하지 않습니다.</li>
</ol>4. 절연 O4의+ Oligodendrocytes
<ol><li>셀 서 스 펜 션 10 분 200 x g에서 원심</li>
	<li>신중 하 게 셀의 공기에 노출을 피하고 진공 포부를 사용 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>1 x 107 총 셀 안티-O4 구슬 1 x 107 셀 당 10 µ L의 추가 의해 따라 당 MCS 버퍼의 90 µ L에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>부드럽게 터치 손가락 15 mL 원뿔 튜브 4-5 배 하 여 세포 현 탁 액 및 비즈 믹스.</li>
	<li>터치는 손가락으로 15 mL 원뿔 튜브 4-5 timesevery 4 ° C에서 15 분 동안 혼합 품 어 5 분.</li>
	<li>부드럽게 튜브를 1 x 107 셀 당 MCS 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 여 믹스를 씻어. 10 분 동안 200 x g에서 혼합 원심</li>
	<li>상쾌한 신중 하 게 셀의 공기에 노출을 피하고 진공 포부를 사용 하 여 삭제 합니다. 모든 1 x 107 셀에 대 한 MCS 버퍼의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>마그네틱 구분 기호 자석 분리기 스탠드에 연결 합니다. 자석 분리기를 선택 열을 연결 하 고 열 위에 40 µ m 셀 여과기를 놓습니다. 두 개의 15 mL 또는 수집을 통해 흐름을 분리 열 아래 한 50 mL 원뿔 튜브를 배치 합니다.</li>
	<li>미리 40 µ m 셀 스 트레이너 및 분리 열 MCS 버퍼의 3 mL을 헹 구 고 버퍼 없이 건조 시키는 열 통해 실행 하자.</li>
	<li>셀 스 트레이너를 선택 열에 세포 현 탁 액 및 구슬의 믹스를 추가 합니다.</li>
	<li>MCS 버퍼의 1 mL와 함께 40 µ m 셀 여과기를 세척.</li>
	<li>셀 스 트레이너를 삭제 하 고 셀, 구슬 및 버퍼 없이 건조 시키는 열을 통해 실행의 혼합.</li>
	<li>MCS 버퍼의 3 mL와 함께 3 번 분리 열 및 OL 확산 미디어와 1 시간 세척.</li>
	<li>자석 분리기에서 분리 열을 제거 하 고 신속 하 게 15 mL 원뿔 튜브에 배치 즉시 OL 확산 미디어의 5 mL을 추가.</li>
	<li>열과 단단히 15 mL 원뿔 튜브로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시를 위에 플런저 장소.</li>
	<li>세포 수 및 섹션 3에에서 표시 된 대로 Trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 생존 능력 결정에 세포 현 탁 액의 100 µ L을 제거 합니다. 참고: 80% 이상의 세포 생존 능력의 OLs, 문화 계속 허용 것으로 간주 됩니다 하지만 가능성 90% 이상 최적입니다.</li>
</ol>5. 격리 O4 도금+ Oligodendrocytes
<ol><li>밀도 (coverslip 당 5 x 105 셀)을 도금 하는 욕망에 세포 현 탁 액 희석 OL 확산 미디어를 사용 하 여. 참고: OL 시드 밀도 이므로 매우 중요 한 진행 하기 전에 조직 문화 현미경을 사용 하 여 적절 한 세포 밀도 확인 해야 합니다. 10, 000 셀/coverslips 아래 밀도 시드 가난한 세포 생존을 이어질 수 있습니다. 10, 000에 25000, OL에서 밀도 도금 형태학 차별화 느린45입니다. 우리는 세포 생존을 위해 적어도 50, 000 셀/coverslips의 시드 밀도에 OLs 플레이트.</li>
	<li>포함 하는 조직 문화 후드에 인큐베이터에서 laminin 코팅 coverslips 24-잘 접시를 이동 합니다.</li>
	<li>각 coverslip에서 laminin를 제거 하 고 이런 서 스 펜 션의 100 µ L로 대체.</li>
	<li>홍보는 coverslips에 OL 접착 45 분의 최대 37 °C/5% CO2 배양 기에서 OLs를 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 인큐베이터에서 24-잘 접시를 제거 합니다. 각 홍수 OL 확산 미디어의 500 µ L로 24-잘 접시의 잘.</li>
	<li>추가 24 h에 대 한 37 °C/5% CO2 배양 기에 다시는 OLs를 놓습니다.</li>
	<li>OLs, 도금 후 24 h 확산 미디어를 제거 하 고 차별화를 유도 하기 위해 이런 차별화 미디어와 대체.</li>
	<li>인큐베이터에는 OLs를 놓고 셀 고정을 위한 준비가 될 때까지 제거 하지 마십시오. 참고: ph에서 변화 OLs에 대 한 저해는 세포 생존 능력을 감소, 따라서 OLs 문화 인큐베이터에서의 불필요 한 제거는 피해 야 한다.</li>
</ol>6. 면역 형광 염색
<ol><li>셀의 검출에 대 한 표면 마커 (NG2, o 1와 O4) 우물에서 미디어를 제거합니다.</li>
	<li>O 1 (undiluted)13 과 O4 (undiluted)13 에 대 한 1 차 항 체를 포함 하는 마우스 hybridoma supernatants의 250 µ L을 추가 하 고 NG2 상대로 polyclonal 토끼 (1:150 B27NBMA에 희석). 참고: 상용 안티-o 1와 안티-O4 항 체 사용할 수 있다면, 그것은 제조 업체에서 제안 하는 희석을 활용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>37 °C/5% CO2 배양 기에서 최대 45 분에 대 한 1 차적인 항 체와 세포를 품 어.</li>
	<li>트윈-20/1 X PBS 0.05%로 두 번 세척. 4 %paraformaldehyde 셀을 수정 (4 %PFA) 실 온에서 10 분.</li>
	<li>트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.</li>
	<li>알 렉 사 488 활용 된 염소 반대로 마우스 IgM 또는 안티-토끼 IgG 이차 항 체 (1:400) B27NBMA에 희석.</li>
	<li>coverslips에서 0.05% 트윈-20/1 X PBS를 제거 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체와 세포를 품 어.</li>
	<li>트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.</li>
	<li>이중 내부 마커 (GFAP)의 검출에 대 한 얼룩, 0.05% 트윈-20/1 X PBS와 블록/permeabilize 셀 블록/permeabilization 버퍼 실 온에서 15 분을 제거 합니다. 그렇지 않으면 6.17 단계로 진행 합니다.</li>
	<li>블록/permeabilization 버퍼를 제거 하 고 250 µ L 닭 안티-GFAP (1: 100) 블록/permeabilization 버퍼에 희석을 추가.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 대 한 안티-GFAP와 셀을 품 어. 트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.</li>
	<li>알 렉 사 594 활용 된 염소 항 치킨 IgG 이차 항 체 (1:400) B27NBMA에 희석.</li>
	<li>coverslips에서 0.05% 트윈-20/1 X PBS를 제거 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체와 세포를 품 어.</li>
	<li>트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.</li>
	<li>4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 counterstain 하 고 antifade DAPI 포함 된 미디어 설치 된 셀을 탑재.</li>
	<li>coverslips 하룻밤 실 온에서 어두운에서 치료 하자.</li>
	<li>Epifluorescence 현미경으로 얼룩진된 셀을 이미지. 참고:이 프로토콜에 셀은 몇 군데 균일 한 노출 시간을 사용 하 여 40 X 확대.</li>
</ol>

저자 아무 공개 있다.

이 통신에 우리는 높게 순화 된 미 숙 마우스 oligodendrocyte 문화의 효율적인 격리 하는 방법을 제시. 이전에 게시 프로토콜39,40에 비해,이 방법은 GFAP 양성 이다의 훨씬 더 낮은 수준 및 기타 비 특징 셀의 매우 낮은 비율 높은 순도 나왔고. 그것은 이들은 미 숙 OLs oligodendroglial 계보 이미 최선을 다하고 지적 하는 것이 중요입니다. 따라서,이 세포 분화의 초기 단계의 연구에 유용 하지 않을 것 이다.
Dincman 프로토콜40 에서 수정 중 하나 우리의 확산 미디어에서 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF) 제거 했다. 그것은 알려졌다 그 생체 외에서bFGF 강한 mitogenic 요소 역할 뿐만 아니라 차별화에서 OPCs를 억제 하지만 또한 프로세스<sup class...

Oligodendrocytes (OLs) 중앙 신경 시스템 (CNS)1의 myelinating 세포 이다. 분리와 밀접 하 게 환경에서 기본 oligodendrocytes의 문화는 oligodendroglia의 개발 뿐만 아니라 demyelinating 질병 다 발성 경화 증2의 생물학의 생체 외에서 연구를 위한 유용한 도구 . 이는 효율적이 고 강력한 oligodendrocyte 고립과 문화 방법3필요합니다. 이 연구에서 우리는 신속 하 고 구체적인 수정된 격리 기술을 구현 하는 독특한 oligodendrocyte 세포 표면 마커 표현의 활용을 했다.
Oligodendrocyte 성숙의 4 단계로 발견 되었습니다, 그리고 각 각 발달 단계 (그림 1)에 대 한 독특한 세포 표면 마커 표현의 특징. 이러한 세포 표면 마커 특정 항 체4,5에 의해 인식 될 수 있다 그리고 특정 단계에서 OLs를 격리 하는 데 사용할 수 있습니다. 첫 번째 단계에서 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs) 증식, 마이그레이션, 특히 혈소판 파생 된 성장 인자 수용 체 (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, proteoglycan NG27,8 표현 하 능력을가지고 , polysialic 산 신경 세포 접착 분자9 및 지방 산 묶는 단백질 7 (FABP7)10. OPCs는 신경 선구자 세포11의 특성은 세포 체의 반대 극에서 나오는 몇 가지 짧은 프로세스와 바이 폴라 형태가 있다.
<img alt="희소돌기아교세포 성숙도; 마커가 있는 단계: OPC, 전희소돌기아교세포, 미성숙, 성숙." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="희소돌기아교세포 성숙도; 마커가 있는 단계: OPC, 전희소돌기아교세포, 미성숙, 성숙."> 그림 1: 식 세포 표면 마커 마우스 oligodendrocyte 개발 중. OLs 세포 표면 마커 같은 A2B5, GalC (o 1), NG2, O4, 및 PDGF Rα 구체적으로 특정 항 체를 사용 하 여 특정 발달 단계에서 oligodendrocytes를 분리 사용할 수 있습니다.   <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
두 번째 단계에서 OPCs preoligodendrocytes 하 고 세포 막에 표현 OPC 표식, 뿐만 아니라 O4 항 체12,13, 그리고14GPR17 단백질 의해 인식 하는 sulfatide (sulfated galactolipid) 미 성숙한 oligodendrocyte (OL) 단계까지 지속합니다. 이 단계에서 preoligodendrocytes는 다중 짧은 프로세스를 확장합니다. Preoligodendrocytes에 있는 주요 OL 무대 출생 후 하루 2 (P2)에 미 숙 OLs15의 작은 인구와 가진 쥐와 쥐의 대뇌 백 질.
세 번째 단계에서 미 숙 OLs O4 표현, 표현의 A2B5 및 NG2 마커를 잃고과 galactocerebroside C16을 표현 하기 시작 계속. 이 단계에서 OLs oligodendroglial 계보에 최선을 다하고 있습니다 그리고 긴 없는 분기17,18와 포스트 mitotic 세포가. 미 숙 OL P7에 설치류 백색 물질의 80% 이상 구성 하 고이 이번에 첫 번째 MBP+ 셀15,19,,2021관찰 된다. 따라서, P7에 OLs의 격리 수 셀룰러 고수익을 확인 하십시오.
OL 개발의 최종적이 고 4 단계에서 성숙 OLs 익스프레스 myelinating 단백질 (myelin 기본적인 단백질 (MBP), proteolipid 단백질 (PLP), 수 초 관련 된 당단백질 (MAG) 및 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)22,23 ,,2425,26. 이 단계에서 성숙 OLs 확장 막 투과성 축 삭 주위 sheaths 그 양식 컴팩트 하 고 미 수 있습니다. 이 쥐와 쥐 두뇌에 MBP+ 세포 P1419,,2021에서 점점 더 풍부한가 관찰과 일치 한다.
Fewster와 동료 196727oligodendrocyte의 첫 번째 분리 이후 설치류 CNS에서에서 OLs의 격리를 위해 여러 가지 방법은 immunopanning28,,2930를 포함 하 여 구현 되었습니다. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 세포 표면의 특정 항 원28,31, 차동 그라데이션 원심32,,3334,35 이용 및 다른 CNS 명과36,37의 차동 준수에 따라 떨고 방법. 그러나, 기존의 문화 방법 특히 순도, 수율 및38의 절차 수행 하는 데 필요한 시간 측면에서 한계를가지고. 따라서, oligodendrocytes에 대 한 보다 효율적인 절연 방법이 제시해 주셔야 합니다.
이 문서에서는 간단한 소개 및 immunomagnetic 격리에 대 한 효율적인 선택 방법을 단계 3 O4+ preoligodendrocytes 세포에서 신생아 쥐 새끼. 이 방법은 기술에 머리 외 에 의해 보고 수정 39 그리고 Dincman 외. 40 약 4 h에서 80% 이상이 oligodendrocyte 준비 순수성을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>10ml 혈청학 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>10ml 주사기 Luer-Loc 팁</td><td>BD, Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원추형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24웰 조직 배양 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>40&micro; m 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>22368547</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>5ml 혈청학 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>60mm 조직 배양 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70&micro; m 세포 여과기</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 488 염소, 항-마우스 IgG (H+L), 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 488 염소, 항-토끼 IgM (H+L), 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A21042</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 488 염소 anti-rabbit IgM (H+L), 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 안티 닭 IgG (H + L) 2 차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-543</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin human</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1101</td><td></td></tr><tr><td>Autofil complete bottle top filter 어셈블리, 0.22um 필터, 250ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1102</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Sigma</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>소 성장 세럼(BGS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-50</td><td></td></tr><tr><td>d-Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuclease I (DNAse I)</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera</td><td>Olympus</td><td>Bx51</td><td></td></tr><tr><td>Feather 일회용 메스</td><td>Andwin Scientific</td><td>EF7281C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>독일 유리 커버 슬립, # 1 두께, 직경 12mm 원형</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 항체</td><td>Aves</td><td>GFAP</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Invitrogen</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>자기 분리기 스탠드 - MACS 멀티스탠드</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>자기 분리기-MiniMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex PES 0.22&micro; m 필터 유닛</td><td>Millipore</td><td>SLG033RS</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디어- Prolong Gold with DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-cysteine (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Natural mouse laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrophin-3 (NT-3)</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>NG2 항체</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ 및 Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selection column-LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Trace elements B</td><td>코닝</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>트리요오드티로닌(T3)</td><td>시그마</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>트리톤-X</td><td>시그마</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션</td><td>코닝</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>B27NBMA</td><td></td><td></td><td>487.75 mL 신경기저 배지 A; 10mL B27 보충제; 1mL 프리모신; 1.25mL 글루타맥스; 필터는 살균하고 4°C에서 보관합니다. C를 사용할 때까지.</td></tr><tr><td>B27NBMA + 10% BGS</td><td></td><td></td><td>27 mL B27NBMA; 3 mL 소 성장 혈청</td></tr><tr><td>CNTF 용액 스톡(10 &micro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Peprotech에서 주문(450-50). 제조사에 따라 0.1-1 mg/ml로 메이크업 s 명령어(로트마다 다를 수 있음)를 버퍼(예: DPBS + 0.2% BSA)에 넣습니다. -80 &deg;C. 저장 작업 솔루션(10 &마이크로; g/ml, 1000X) 1. DPBS 용액에 0.2% BSA(Fisher scientific BP-1600-100)를 넣고 살균합니다. 2. 마스터 스톡 부분 표본을 10&micro로 희석합니다. 멸균, 냉각 0.2% BSA/DPBS. 의 g/ml 3. 부분 표본 (20&micro; l/tube) 및 액체 nitrogen. 에 있는 스냅 동결 4. 부분 표본은 -80 &deg;C에서 저장합니다.</td></tr><tr><td>d-비오틴 원액(50 &micro; g/ml; 5000X)</td><td></td><td></td><td>d-Biotin (Sigma-B4639)을 50 &micro에서 이중 증류 H2O에 재현탁; g/ml(예: ddH2O 50ml에 2.5mg). 재부유는 상당한 양의 교반/소용돌이 또는 37°C에서 잠시 가벼운 온난화가 필요할 수 있습니다. d-비오틴이 여전히 용해되지 않으면 덜 농축된 것을 구성하는 것이 좋습니다(예: 10&micro; g/ml)을 사용하여 B27NBMA에 더 높은 부피(1/5000) 대신 1/5000)을 추가합니다. 4&deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>DNase I 재고 용액</td><td></td><td></td><td>1. 12,500U Deoxyribonuclease I/ml에서 얼음에 식힌 HBSS에 용해합니다. 2. 필터는 ice 에서 살균합니다 3. 200 &마이크로에서 부분 표본; l 하룻밤 동안 -20&deg;C. 에서 동결 4. 부분 표본은 -20에서 -30&deg;C에 저장합니다.</td></tr><tr><td>둘베코' s 인산염 완충 식염수(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)</td><td></td><td></td><td>파우치를 물 1리터에 녹여 배지 1리터당 분말 9.6g을 생성합니다. 2-8 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>포스콜린 원액(4.2mg/ml, 1000X)</td><td></td><td></td><td>병(Sigma-F6886)에 50mg 포스콜린에 멸균 DMSO 1ml를 첨가하고 재현탁될 때까지 피펫팅합니다. 15 ml 원심분리기 튜브로 옮기고 11 ml의 멸균 DMSO를 추가하여 4.2 mg/ml를 만듭니다. 분취량(예: 20 &micro; l)에서 -20°C로 저장합니다.</td></tr><tr><td>행크' s 평형 염 (HBSS) (시그마</td><td></td><td></td><td>1. 물 900ml를 측정합니다(온도 15-20 &deg; C) 실린더에 넣고 부드럽게 저어줍니다. 2. 힘을 넣고 녹을 때까지 저어줍니다. 3. 소량의 물로 원래 패키지를 헹구어 분말의 모든 흔적을 제거하십시오. 4. 2. 5단계에서 솔루션에 추가합니다. 최종 부피 1리터당 0.35gr의 중탄산나트륨(7.5% w/v)을 추가합니다. 6. 녹을 때까지 계속 저어줍니다. 7. 여과 중에 상승할 수 있으므로 pH= 7.4 미만의 0.1-0.3 단위로 교반하는 동안 버퍼의 pH를 조정합니다. pH. 8을 조정하려면 1N HCl 또는 1N NaOH를 사용하는 것이 좋습니다. 물을 더 추가하여 최종 부피를 1L. 9로 가져옵니다. 다공성이 0.22 미크론인 멤브레인을 사용하여 여과하여 살균합니다. 10. 2-8 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>인슐린 원액(4000 &micro; g/ml)병</td><td></td><td></td><td>을 해동하고 부분 표본 25 &micro; 마이크로 원심 분리기 튜브 당 l 및 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>라미닌 용액</td><td></td><td></td><td>추위에서 라미닌을 천천히 해동합니다(2&deg; C에서 8&deg; C) 젤 대형을 피하기 위하여. 그런 다음 폴리프로필렌 튜브로 분취합니다. 5°C에 저장; C에서 -20&deg; 부분 표본의 C(예: 20 &micro; l) 반복적으로 얼거나 해동하지 마십시오. 라미닌은 이 온도에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>자기 세포 분류(MCS) 완충액</td><td></td><td></td> 인<td>산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2 및 0.5% 소 혈청 알부민(BSA), 0.5mM EDTA, 5&micro를 포함하는 용액을 준비합니다. g/ml 인슐린, 1g/L 포도당. 살균하고 여과에 의하여 가스를 제거하십시오 완충액은 0.22 &micro를 통해서 통과해서 주십시오; m 밀렉스 필터. 버퍼를 4&deg에 저장합니다. </td></tr><tr><td>N-아세틸-L-시스테인(NAC) 원액(5mg/ml, 1000X)</td><td></td><td></td><td>을 사용할 때까지 N-아세틸-L-시스테인(Sigma-A8199)을 DMEM(예: 10ml B27NBMA 중 50mg NAC)에 5mg/ml로 용해합니다. 여과기는 살균하고 분취합니다 (예: 20 &micro; 엘). -20&deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>NT3 원액(1 &micro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td> <td>마스터 재고 : Peprotech (450-03)에서 주문. 제조사에 따라 0.1-1 mg/ml로 메이크업 s 명령어(로트마다 다를 수 있음), 버퍼(예: DPBS + 0.2% BSA). -80&deg;C. 에서 보관 작업 재고(1&마이크로; g/ml; 1000X): 1. DPBS 용액에 0.2% BSA를 넣고 sterilize. 필터를 만듭니다 2. 마스터 스톡 부분 표본을 1 &micro로 희석합니다. 멸균, 냉각 0.2% BSA/DPBS. 의 g/ml 3. 부분 표본(예: 20&micro; l/tube) 및 액체 nitrogen. 에 있는 스냅 동결 4. 부분 표본은 -80&deg;C에서 저장합니다.</td></tr><tr><td>PDGF 원액(10 &micro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td> <td>마스터 재고 : Peprotech (100-13A)에서 주문. 제조사에 따라 0.1-1 mg/ml로 메이크업 s 명령어 (로트마다 다를 수 있음)를 버퍼(예: DPBS) + 0.2% BSA)에 넣습니다. -80&deg;C. 에서 보관 작업 재고(1&마이크로; g/ml; 1000X): 1. DPBS 용액에 0.2% BSA를 넣고 sterilize. 필터를 만듭니다 2. 마스터 스톡 부분 표본을 1&micro로 희석합니다. 멸균, 냉각 0.2% BSA/DPBS. 의 g/ml 3. 부분 표본(예: 20&micro; l/tube) 및 액체 nitrogen. 에 있는 스냅 동결 4. 부분 표본은 -80&deg;C에서 저장합니다.</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X)</td><td></td><td></td><td>0.15M 붕산 pH 8.4에서 0.5mg/ml로 poly-D-lysine, 분자량 70-150 kD(Sigma P6407)를 재현탁합니다(예: 50ml 붕산염 완충액 내 50mg). 여과기는 살균하고 분취합니다 (예를들면 100&micro; l/튜브). -20°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 100X 재고(1mg/ml)를 50°마이크로로 희석하십시오. 멸균 된 물에 g / ml.</td></tr><tr><td>희소돌기아교세포 증식 배지</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx" 참조>보충 표 1</a></td></tr><tr><td>희소돌기아교세포 분화 배지</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx" 참조>보충 표 1</a></td></tr><tr><td>Sato 보충 (100X)</td><td></td><td></td><td>참조 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">보충 표 1</a></td></tr><tr><td>참고문헌: 시약 및 레시피 목록은 이전에 Emery et al. 2013(Emery, B. & Dugas, J. C. 면역 판닝에 의한 마우스 피질에서 희소돌기아교세포 계통 세포의 정제. 콜드 스프링 Harb 프로토콜 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) 및 Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. 피질 마우스 희소돌기아교세포 전구 세포의 분리. J Neurosci 방법. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 기본 oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 immunomagnetic 절연

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

효율적이 고 강력한 격리와 기본 oligodendrocytes (OLs)의 문화는 oligodendroglia의 개발 뿐만 아니라 demyelinating 다 발성 경화 증과 같은 질병의 생물학의 생체 외에서 연구에 대 한 유용한 도구와 Pelizaeus-Merzbacher-같은 질병 (PMLD). 여기, 우리 간단 하 게 제시 하 고의 immunomagnetic 절연에 대 한 효율적인 선택 방법을 단계 3 O4+ preoligodendrocytes 세포에서 신생아 쥐 새끼. 미 숙 OL 80% 이상 설치류 뇌 백색 질 출생 후 제 7 일에의 (P7)이 격리 방법 뿐만 아니라 셀룰러 고수익을 보장 뿐만 아니라 이미 oligodendroglial 계보 최선을 다하고 OLs의 특정 격리 구성, 이후 감소 하는 이다 등 오염 셀과 다른 셀 쥐의 뇌에서 분리 가능성. 이 방법은 기술 이전, 보고의 이며 약 4 시간에 80% 이상 oligodendrocyte 준비 순수성을 제공 합니다.

이 연구의 목적은 O4에 대 한 향상 된 절연 방법을 확립 하는 것 이었다+ 대상 셀의 가능한 최소 조작 해야 하는 기본 마우스 oligodendrocytes. Coverslips 셀의 도금에 새끼의 안락사에서 전체 절차에 대 한 4 시간 걸립니다 그리고 여기에 표시 된 데이터 3 개의 독립적인 실험을 대표 한다. 조직 분리 후 4.3 ± 0.46 x 107 셀의 평균 각 독립적인 실험, 91% ± 5.6%의 생존 능력에 대 한 격리 했다. Immunomagnetic 절연 안티-O4를 사용 하 여 태그 자석 microbeads 후 평균 6.9 ± 0.38 x 106 의 OLs 가져온 (1-1.5 x 10 마우스 당6 )는 16.2% ± 1.6% 총 처음 해리; 생존은 96.3% ± 3.5%.
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우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

이 기술의 전반적인 목표는 면역자기 분리를 사용하여 체외 배양 분석을 위해 신생아 마우스 새끼에서 O4 양성 희소돌기아교구를 선택하는 것입니다. 이 방법은 수초와 수초화에 영향을 미치는 질병 연구와 관련된 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 약 한 시간 내에 80% 이상의 순도의 최종 희소돌기아교세포 배양을 용이하게 한다는 것입니다.먼저 작은 해부 가위를 사용하여 5-7일 생쥐의 두피 정중선을 따라 피부를 자릅니다. 피부 덮개를 집어넣어 두개골을 드러내고 뒤쪽 개구부에서 정면까지 정중선을 따라 두개골을 조심스럽게 자릅니다. 두개골 뒤쪽의 구멍에서 뼈 기저부를 따라 각 눈구멍 쪽으로 자르고 가는 집게를 사용하여 피질이 중뇌에서 멀어지도록 부드럽게 놀립니다.그런 다음 피질을 7ml의 B-27 Neurobasal A Medium이 들어 있는 60mm 조직 배양 접시로 옮깁니다. 모든 뇌를 채취한 후, 피질을 5밀리리터의 해리 완충액이 들어 있는 새로운 60밀리미터 조직 배양 접시에 옮기고, 15번 메스 날을 사용하여 피질을 1개의 세제곱밀리미터 조각으로 깍둑썰기한다. 섭씨 37도의 5%CO2 인큐베이터에서 20분 동안 뇌 조각을 배양합니다.그런 다음 소 성장 세럼 1ml를 첨가하여 효소 반응을 멈추십시오. 10 밀리리터 혈청 파이펫을 사용하여 조직 슬러리를 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 파이펫팅으로 뇌 조직을 6-8회 부드럽게 해리합니다. 해리된 조직 덩어리가 2-3분 동안 가라앉도록 합니다.그런 다음 상등액을 새 튜브에 옮깁니다. 다음으로, 소 성장 혈청과 DNase I이 보충된 Neurobasal A Medium 3ml를 조직에 첨가하고 5ml 피펫을 사용하여 더 많은 피펫팅으로 조직을 부드럽게 해리합니다. 보시다시피, 적절한 피펫팅 힘은 생존 가능한 세포의 높은 수율을 보장하는 데 중요합니다.파이펫팅이 너무 단단하면 생존력이 낮을 수 있습니다. 반면 피펫팅이 너무 완만하면 세포 수율이 낮을 수 있습니다. 조직 조각이 2-3분 더 가라앉을 때까지 기다립니다.그런 다음 상층액을 새 튜브에 옮기고 소 성장 혈청과 DNase I을 보충한 신선한 Neurobasal A 배지 3ml를 조직에 추가합니다. 큰 조직 덩어리가 남지 않을 때까지 P-1000 피펫 팁으로 뇌 조직을 부드럽게 해리하고 거품이 생기지 않도록 주의합니다. 10 밀리리터 피펫을 사용하여 70 미크론 세포 스트레이너를 통해 세포 용액을 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 여과하고, 소 성장 혈청 및 DNase I.Split으로 보충 된 새로운 Neurobasal A Medium으로 단일 세포 현탁액의 최종 부피를 30 밀리리터로 가져옵니다.세포 현탁액을 2 개의 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 분할합니다. 그리고 원심분리에 의해 신경 세포를 펠릿화합니다.마지막 5-10마이크로리터의 탁한 상층액을 제외한 모든 것을 제거하고 소 성장 세럼이 보충된 Neurobasal A Medium 3ml를 세포에 추가합니다. 세포 펠릿을 조심스럽게 다시 현탁시키고 10% 소 성장 혈청을 함유한 신선한 Neurobasal A 배지로 최종 부피를 최대 15ml까지 가져옵니다. 40미크론 세포 여과기를 통해 세포 용액을 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 여과하고 10% 소 성장 혈청을 함유한 새로운 Neurobasal A 배지로 최종 부피를 최대 30ml까지 가져옵니다.그런 다음 원심분리를 위해 여과된 세포 현탁액을 두 개의 15ml 원뿔형 튜브 사이에 분할합니다.세포를 풀링하기 전에 펠릿을 2.5ml의 얼음처럼 차가운 Magnetic Cell Sorting Buffer에 다시 현탁시킵니다. 계수 후, 세포를 다시 원심 분리하고, 7 개의 세포에 1 배 10 당 90 마이크로 리터의 새로운 자기 세포 분류 버퍼에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.다음으로, 7개의 세포에 1 곱하기 10당 10마이크로리터의 anti-04 beads를 첨가하고 세포 용액을 부드럽게 튕기면서 혼합합니다. 섭씨 4도에서 5분마다 가볍게 가볍게 튕기며 15분 후, 원심분리로 세척하기 위해 7개의 셀에 1 곱하기 10당 2ml의 Magnetic Cell Sorting Buffer를 부드럽게 첨가하고 조심스럽게 진공 흡입하여 상층액을 버립니다. 펠릿을 500마이크로리터의 새 Magnetic Cell Sorting Buffer에 7개의 셀에 10배마다 다시 현탁시키고 적절한 크기의 마그네틱 비드 분류 컬럼을 해당 자기 분리기에 놓습니다.40미크론 스트레이너를 컬럼에 놓고 3ml의 Magnetic Cell Sorting Buffer로 스트레이너를 미리 헹구어 컬럼이 건조되지 않고 버퍼가 컬럼을 통과하도록 합니다. 세포를 스트레이너에 추가한 다음 Magnetic Cell Sorting Buffer로 1ml를 세척합니다. 세척당 3ml의 Magnetic Cell Sorting Buffer로 컬럼을 3회 세척하고, 희소돌기아교세포 증식 배지(Oligodendrocyte Proliferation Medium)로 1회 세척합니다.그런 다음 컬럼을 15ml 튜브로 옮기고 플런저를 사용하여 컬럼을 통해 5ml의 새로운 희소돌기아교세포 증식 배지를 즉시 플러시합니다. 계수 후 세포를 적절한 도금 밀도로 희석하고 24웰 플레이트의 사전 코팅된 커버 슬립의 라미닌을 100마이크로리터의 희소돌기아교세포 증식 배지로 교체합니다. 희소돌기아교세포를 섭씨 37도 및 5%CO2에서 45분 이상 배양하지 않고 배양하여 커버 슬립에 희소돌기아교세포 부착을 촉진합니다.그런 다음 24 웰 플레이트의 각 웰에 500 마이크로 리터의 희소 돌기아 교구 증식 배지를 24 시간 배양합니다. 다음 날, 상층액을 희소돌기아교세포 분화 배지(Oligodendrocyte Differentiation Medium)로 교체하고 고정할 준비가 될 때까지 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 도금 후 24시간이 지나면 세포는 위상차 현미경(Phase Contrast Microscopy)에서 이중 또는 삼극성으로 나타나며, 이는 초기 단계 증식 희소돌기아교세포의 특징입니다.면역형광 염색은 도금 후 24시간이 지나면 이러한 전치돌기아교세포의 대다수가 NG2 및 O4 라벨링도 나타내는 반면, GFAP 및 항-01 항체를 사용한 라벨링은 훨씬 덜 일반적임을 보여주며, 이는 이 단계에 있는 대부분의 세포가 미성숙 또는 성숙한 희소돌기아교세포가 거의 없는 전희소돌기아교세포임을 시사합니다. 72시간에는 희소돌기아교세포 형태가 24시간보다 더 복잡한 것으로 보이며, 초기 희소돌기아교세포 마커인 NG2에 대해 양성인 세포의 빈도가 훨씬 낮습니다. 또한 대부분의 세포는 O4 표지를 나타내며, 이 단계에서 세포의 거의 절반이 01 항체로 염색되어 세포가 더 성숙한 표현형으로 분화하고 있음을 시사합니다.특히 성상세포의 존재는 매우 낮습니다. 이러한 결과는 시간이 지남에 따라 면역자기적으로 분리된 희소돌기아교세포가 성상세포와 같은 다른 세포 유형의 오염이 거의 없이 체외에서 성숙 3단계로 분화할 수 있음을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 면역자기 분리를 사용하여 신생아 쥐 새끼에서 1차 희소돌기아교세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운을 빕니다.

rapid-specific-immunomagnetic-isolation-mouse-primary

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 쥐 새끼 뇌에서 미세아교세포를 포함한 CD11b 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 뇌 조직을 균질화하여 단세포 현탁액을 얻고, 이 현탁액은 항-CD11b 항체로 코팅된 마이크로비드로 배양된 후 자기 컬럼 기반 분리를 통해 CD11b+ 세포 집단을 정제합니다.

쥐 강아지 뇌에서 미세아교세포의 자기 분리(Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains)

이 비디오는 쥐 새끼 뇌 피질에서 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다.

Isolating and Culturing Oligodendrocyte Precursor Cells from Mouse Pup Brain Cortex(쥐 강아지 뇌 피질에서 희소돌기아교세포 전구세포)

이 비디오는 자기 분리를 사용하여 새끼 쥐에서 얻은 신경 세포 현탁액에서 일차 희소돌기아교세포 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 희소돌기아교세포 항원에 특이적인 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 이러한 세포를 선택적으로 분리할 수 있습니다.

면역자기 비드를 사용한 쥐 1차 희소돌기아교세포 분리

이 비디오는 자기 세포 분류를 사용하여 마우스 뇌의 탈수초 병변에서 미세아교세포를 추출하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 미세아교세포를 포함하는 병변된 뇌 조직을 절개하고, 특정 효소로 조직을 처리하여 단세포 현탁액을 얻고, 미세아교세포 수용체 특이적 자기 비드를 사용하여 미세아교세포를 분리하는 것이 포함됩니다.

Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting(자기 활성화 세포 분류를 사용한 마우스 뇌 탈수초 병변에서 미세아교세포 분리)

여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

여기에서는 마우스 CNS로부터 다중 신경교 세포 집단의 시험관 내 분리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 국소 미세아교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 성상세포를 분리하여 다양한 배양 시스템에서 각각의 표현형을 연구할 수 있습니다.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.

탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 일차 미세아교세포의 분리

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

우리는 상대적으로 짧은 시간에 MACS(magnetically activated cell sorting)를 사용하여 쥐의 시상하부(또는 이에 상응하는 작은 뇌 구조)에서 미세아교세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. MACS 분류된 시상하부 미세아교세포는 체외 분석에 사용할 수 있으며 in vitro 분석을 수행하기 위해 도금할 수 있습니다.

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting  

배우세요 신생 마우스에서 O4 양성 올리고덴드로사이트를 면역자기 분리하는 방법을 통해 신경과학 및 수초 형성 연구를 수행하세요. 이 기술은 80% 이상의 순도로 세포를 신속하게 분리하여 체외 실험에 활용할 수 있습니다.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

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