마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

이 기술의 전반적인 목표는 면역자기 분리를 사용하여 체외 배양 분석을 위해 신생아 마우스 새끼에서 O4 양성 희소돌기아교구를 선택하는 것입니다. 이 방법은 수초와 수초화에 영향을 미치는 질병 연구와 관련된 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 약 한 시간 내에 80% 이상의 순도의 최종 희소돌기아교세포 배양을 용이하게 한다는 것입니다.

먼저 작은 해부 가위를 사용하여 5-7일 생쥐의 두피 정중선을 따라 피부를 자릅니다. 피부 덮개를 집어넣어 두개골을 드러내고 뒤쪽 개구부에서 정면까지 정중선을 따라 두개골을 조심스럽게 자릅니다. 두개골 뒤쪽의 구멍에서 뼈 기저부를 따라 각 눈구멍 쪽으로 자르고 가는 집게를 사용하여 피질이 중뇌에서 멀어지도록 부드럽게 놀립니다.

그런 다음 피질을 7ml의 B-27 Neurobasal A Medium이 들어 있는 60mm 조직 배양 접시로 옮깁니다. 모든 뇌를 채취한 후, 피질을 5밀리리터의 해리 완충액이 들어 있는 새로운 60밀리미터 조직 배양 접시에 옮기고, 15번 메스 날을 사용하여 피질을 1개의 세제곱밀리미터 조각으로 깍둑썰기한다. 섭씨 37도의 5%CO2 인큐베이터에서 20분 동안 뇌 조각을 배양합니다.

그런 다음 소 성장 세럼 1ml를 첨가하여 효소 반응을 멈추십시오. 10 밀리리터 혈청 파이펫을 사용하여 조직 슬러리를 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 파이펫팅으로 뇌 조직을 6-8회 부드럽게 해리합니다. 해리된 조직 덩어리가 2-3분 동안 가라앉도록 합니다.

그런 다음 상등액을 새 튜브에 옮깁니다. 다음으로, 소 성장 혈청과 DNase I이 보충된 Neurobasal A Medium 3ml를 조직에 첨가하고 5ml 피펫을 사용하여 더 많은 피펫팅으로 조직을 부드럽게 해리합니다. 보시다시피, 적절한 피펫팅 힘은 생존 가능한 세포의 높은 수율을 보장하는 데 중요합니다.

파이펫팅이 너무 단단하면 생존력이 낮을 수 있습니다. 반면 피펫팅이 너무 완만하면 세포 수율이 낮을 수 있습니다. 조직 조각이 2-3분 더 가라앉을 때까지 기다립니다.

그런 다음 상층액을 새 튜브에 옮기고 소 성장 혈청과 DNase I을 보충한 신선한 Neurobasal A 배지 3ml를 조직에 추가합니다. 큰 조직 덩어리가 남지 않을 때까지 P-1000 피펫 팁으로 뇌 조직을 부드럽게 해리하고 거품이 생기지 않도록 주의합니다. 10 밀리리터 피펫을 사용하여 70 미크론 세포 스트레이너를 통해 세포 용액을 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 여과하고, 소 성장 혈청 및 DNase I.Split으로 보충 된 새로운 Neurobasal A Medium으로 단일 세포 현탁액의 최종 부피를 30 밀리리터로 가져옵니다.세포 현탁액을 2 개의 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 분할합니다. 그리고 원심분리에 의해 신경 세포를 펠릿화합니다.

마지막 5-10마이크로리터의 탁한 상층액을 제외한 모든 것을 제거하고 소 성장 세럼이 보충된 Neurobasal A Medium 3ml를 세포에 추가합니다. 세포 펠릿을 조심스럽게 다시 현탁시키고 10% 소 성장 혈청을 함유한 신선한 Neurobasal A 배지로 최종 부피를 최대 15ml까지 가져옵니다. 40미크론 세포 여과기를 통해 세포 용액을 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 여과하고 10% 소 성장 혈청을 함유한 새로운 Neurobasal A 배지로 최종 부피를 최대 30ml까지 가져옵니다.

그런 다음 원심분리를 위해 여과된 세포 현탁액을 두 개의 15ml 원뿔형 튜브 사이에 분할합니다.세포를 풀링하기 전에 펠릿을 2.5ml의 얼음처럼 차가운 Magnetic Cell Sorting Buffer에 다시 현탁시킵니다. 계수 후, 세포를 다시 원심 분리하고, 7 개의 세포에 1 배 10 당 90 마이크로 리터의 새로운 자기 세포 분류 버퍼에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

다음으로, 7개의 세포에 1 곱하기 10당 10마이크로리터의 anti-04 beads를 첨가하고 세포 용액을 부드럽게 튕기면서 혼합합니다. 섭씨 4도에서 5분마다 가볍게 가볍게 튕기며 15분 후, 원심분리로 세척하기 위해 7개의 셀에 1 곱하기 10당 2ml의 Magnetic Cell Sorting Buffer를 부드럽게 첨가하고 조심스럽게 진공 흡입하여 상층액을 버립니다. 펠릿을 500마이크로리터의 새 Magnetic Cell Sorting Buffer에 7개의 셀에 10배마다 다시 현탁시키고 적절한 크기의 마그네틱 비드 분류 컬럼을 해당 자기 분리기에 놓습니다.

40미크론 스트레이너를 컬럼에 놓고 3ml의 Magnetic Cell Sorting Buffer로 스트레이너를 미리 헹구어 컬럼이 건조되지 않고 버퍼가 컬럼을 통과하도록 합니다. 세포를 스트레이너에 추가한 다음 Magnetic Cell Sorting Buffer로 1ml를 세척합니다. 세척당 3ml의 Magnetic Cell Sorting Buffer로 컬럼을 3회 세척하고, 희소돌기아교세포 증식 배지(Oligodendrocyte Proliferation Medium)로 1회 세척합니다.

그런 다음 컬럼을 15ml 튜브로 옮기고 플런저를 사용하여 컬럼을 통해 5ml의 새로운 희소돌기아교세포 증식 배지를 즉시 플러시합니다. 계수 후 세포를 적절한 도금 밀도로 희석하고 24웰 플레이트의 사전 코팅된 커버 슬립의 라미닌을 100마이크로리터의 희소돌기아교세포 증식 배지로 교체합니다. 희소돌기아교세포를 섭씨 37도 및 5%CO2에서 45분 이상 배양하지 않고 배양하여 커버 슬립에 희소돌기아교세포 부착을 촉진합니다.

그런 다음 24 웰 플레이트의 각 웰에 500 마이크로 리터의 희소 돌기아 교구 증식 배지를 24 시간 배양합니다. 다음 날, 상층액을 희소돌기아교세포 분화 배지(Oligodendrocyte Differentiation Medium)로 교체하고 고정할 준비가 될 때까지 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 도금 후 24시간이 지나면 세포는 위상차 현미경(Phase Contrast Microscopy)에서 이중 또는 삼극성으로 나타나며, 이는 초기 단계 증식 희소돌기아교세포의 특징입니다.

면역형광 염색은 도금 후 24시간이 지나면 이러한 전치돌기아교세포의 대다수가 NG2 및 O4 라벨링도 나타내는 반면, GFAP 및 항-01 항체를 사용한 라벨링은 훨씬 덜 일반적임을 보여주며, 이는 이 단계에 있는 대부분의 세포가 미성숙 또는 성숙한 희소돌기아교세포가 거의 없는 전희소돌기아교세포임을 시사합니다. 72시간에는 희소돌기아교세포 형태가 24시간보다 더 복잡한 것으로 보이며, 초기 희소돌기아교세포 마커인 NG2에 대해 양성인 세포의 빈도가 훨씬 낮습니다. 또한 대부분의 세포는 O4 표지를 나타내며, 이 단계에서 세포의 거의 절반이 01 항체로 염색되어 세포가 더 성숙한 표현형으로 분화하고 있음을 시사합니다.

특히 성상세포의 존재는 매우 낮습니다. 이러한 결과는 시간이 지남에 따라 면역자기적으로 분리된 희소돌기아교세포가 성상세포와 같은 다른 세포 유형의 오염이 거의 없이 체외에서 성숙 3단계로 분화할 수 있음을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 면역자기 분리를 사용하여 신생아 쥐 새끼에서 1차 희소돌기아교세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운을 빕니다.