Name: Decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 배우세요 식물 조직의 탈세포화 방법을 통해 조직 공학용 스캐폴드를 제작하는 기술을 익히세요. 세제 기반과 무세제 방식을 비교하며 세포외 기질을 보존하고 유체 전달 능력을 향상시키는 방법을 탐구합니다.

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우리는 기꺼이이 프로젝트에 사용 된 표본 공급 Olbrich 정원의 존 Wirth 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 국립 심장, 폐, 혈액 연구소에 의해 부분에서 지원 (G.R.G.에 R01HL115282) 국립 과학 재단 (J.R.G와 G.R.G.를 DGE1144804), 위스콘신 대학 외과 및 동문 기금 (H.D.L.). 이 작품 또한 일부 환경 보호 기구 (스타 그랜트 no. 83573701)에서 건강의 국가 학회 (R01HL093282-01A1 및 UH3TR000506), 그리고 국립 과학 재단 (IGERT DGE1144804)에 의해 지원 되었다.

1. 식물 조직 세제 기반 접근을 사용 하 여 decellularization
<ol><li>
신선 또는 냉동 F. hispida, 잎 샘플을 사용 합니다. -20 ° C 냉동 고 (최대 1 년) 나중에 사용에 대 한 저장소에서 사용 되지 않는 신선한 샘플을 동결. 참고: 거의 모든 원하는 식물의 줄기 나 잎 조직을 사용 합니다. 확장된 저장 시간은 조직에 손상을 일으킬 수 있습니다.<ol>
<li>샘플의 용도 기준으로 하 여 처리 하는 샘플의 형태와 크기를 결정 (즉, 샘플 스트립으로 잘라 기계적 테스트 응용 프로그램에 대 한 적합, 한편 8 m m 디스크 샘플 다 잘 자란 응용 프로그램에 유용 ). 잘라 잎 8 m m 디스크 날카로운, 깨끗 한 생 검 펀치 실내 온도 (20-25 ° C) 이온된 H2o. 잠수 하는 동안 참고: 전체 잎과 줄기에는이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 그러나, 작은 샘플은 빨리 decellularize 것입니다.</li>
		<li>실내 온도 (20-25 ° C) 이온된 H2O 세척 및 그들을 녹여 낮은 속도 설정 흔들 플레이트 세트에 5-10 분에 대 한 샘플을 품 어. 충분히 이온된 h 조2O를 사용 하 여 모든 샘플은 철저 하 게 침수 되도록.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
10% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 이온된 H2o. 장소에서에서의 솔루션 (유리 또는 플라스틱 접시 이상적 이다) 적합 한 컨테이너에 샘플을 준비 하 고 SDS 솔루션 샘플 표지를 추가. 손상을 방지 하기 위해 샘플에 낮은 속도를 흔들 플레이트 세트에 실내 온도 (20-25 ° C)에서 5 일에 대 한 샘플을 품 어. 참고:이 decellularization 과정을 감속 하 고 SDS에 의해 고르지 치료 이어질 수 컨테이너를 혼잡 하지 않습니다. 이 단계 동안 샘플 갈색 색조를 취득 해야 합니다.<ol>
<li>5 일 후 바꿉니다 SDS 솔루션 이온된 H2o. 품 어떤 잔여 SDS 솔루션을 철저 하 게 씻어을 흔들어 접시에 추가 10-15 분에 대 한 샘플을.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10% (v/v) 표 백제 솔루션에서 1% (v/v) 비 이온 계면 활성 제를 준비 합니다. 500 mL 솔루션, 백제의 50 mL와 5 mL의 비 이온 계면 활성 제를 혼합 후 이온 H2o. Submerge 445 mL을 추가 갓된 솔루션에서 샘플링 합니다. 참고: 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션 없는 긴 수명, 따라서, 준비의 48 h 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>
샘플은 완전히 지워질 때까지 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션 마다 24 h를 교체 (시각적 비교를 위해 그림 1A 참조). 다음 씻어 초과 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션을 2 분 동안 흔들어 접시에 이온된 수에 샘플을 품 어. 흔들어 접시 샘플을 손상을 방지 하기 위해 낮은 설정으로 설정 합니다. 참고: 샘플 사용의 선택을 취소 하는 데 필요한 시간 따라 달라 집니다, 유형 및 식물의 종. 전체 decellularization의이 샘플의 완전 한 변색 (철저 한 청소를 보장 하기 위해 DNA 정량화를 수행).<ol>
<li>년까지 그들을 저장 하는 샘플을 lyophilize (플래시 동결 액체 질소를 사용 하 여 선호,-80 ° C에서 샘플을 동결 하 셔도 됩니다) 실내 온도 (20-25 ° C) 낮은 습도에 그들을 저장 하 고.</li>
		<li>Tris HCl (10 m m, pH 8.5)에서 샘플을 다시 구성 하기 충분히 코트 샘플을 사용 하 여. 혈 청 무료 미디어 사용 (린스, 표준 24 잘 접시에서 당즉 사용 150-300 µ L) 하기 전에 micropipette를 사용 하 여 부드럽게 2-3 번 샘플 린스. 참고: Tris HCl 버퍼 및 혈 청 무료 미디어 (즉 DMEM, 그러나 어떤 기본적인 세포 배양 매체를 대체할 수) 낮추는 이온 H2O 혼자 치료 보다 SDS 처리 샘플의 세포 생존 능력에 대 한 영향에 더 효과적입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세제 무료 Decellularization 접근을 사용 하 여 샘플의 준비
참고:이 절차의 초기 단계 일치 단계 1.1-1.1.2 (위 참조).
<ol><li>5% (v/v) 표 백제 (NaClO)와 3% (w/v) 나트륨 중 탄산염 (NaHCO3) 솔루션을 준비 합니다. F. hispida 잎 샘플 잘라 뜨거운 접시에 감동 하면서 8 m m 디스크에 대 한 60-70 ° C에 증기 두건에서 솔루션을 따뜻한. 참고: 중 탄산 나트륨 탄산 나트륨 (Na2CO3), 또는 수산화 나트륨 (NaOH)로 교체하실 수 있습니다. 원하는 온도 크게 (90 ° C로 실 온)에서 변화 하 고 사용 하는 샘플의 속성에 따라 조정 되어야 한다.</li>
	<li>솔루션에는 원하는 온도 도달 하면, 일단 샘플 잠수함 하 고 그들을 손상 되지 않도록 교 반 속도 줄일 수 있습니다. 후 샘플 지워집니다 가시 (참조 그림 1B 시각적 비교를 위해), 목욕에서 신중 하 게 제거. 이온된 H2O 초과 표 백제 솔루션을 제거 하려면 1-2 분에 한 번 샘플을 품 어. 참고: 샘플을 취소 하는 데 필요한 시간이 달라질 수 있습니다. 예를 들어 전체 잎 또는 줄기 완전히 취소 하 고 열 탕에 시간이 걸릴 수 있습니다와 같은 컷된 파 슬 리 10-15 분, 두꺼운 또는 더 큰 샘플 동안에 지울 수 있습니다.</li>
	<li>샘플을 lyophilize 하 고 실내 온도 (20-25 ° C) 낮은 습도에 그들을 저장 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, decellularize 식물 조직에 두 가지 방법은 설명 합니다. 여기, 결과 나온 프로토콜 가능성이 있다는 제안25, 이전 연구 결과 함께 결합의 광범위에 적용 가능한 종 식물, 줄기와 잎에서 수행할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 공장 decellularization 대부분 실험실에서 실행 될 수 있다 그래서 전문된 장비를 필요 하지 않습니다. 그것은 주목할 만한 그 decellularization, 후에 건설 기계 해야 합니다 수 functionalized 포유류 세포 접착을 촉진 하기 위하여입니다. 포유류 세포 접착 및 조직 되어 식물에 성장 수 있도록 다른 기능화 기술 설명 다른25 현재 원고는 아닙니다 주제.
두 decellularization 프로토콜 여기 (그림 1)에서 마지막 단계는 그들의 성공에 중요 했다. 때...

조직 생활을 만드는 1980 년대에 등장 하는 조직 공학 대체, 그리고 잠재적으로 주소 중요 한 장기 및 조직 부족1. 한 전략은 자극 하 고 누락 된 조직이 나 장기를 재생성 하기 위해 시체를 안내 건설 기계를 사용 하 고. 첨단 3 차원 인쇄 생산 독특한 물리적 특성으로 건설 기계와 같은 접근을 제조, 비록 달성 물리적 및 생물학적 속성의 다양 한 범위와 건설 기계를 제조 하는 능력 유지 도전2 , 3. 또한, 기능 혈관 네트워크의 부족으로 이러한 기술을 제한 되어 3 차원 조직 재생에. Decellularized 인간과 동물 조직으로 건설 기계를 사용 하 여가 문제4,5,,67우회 주 었 있다. 그러나, 높은 비용, 일괄 배치 변화, 및 제한 된 가용성의 광범위 한 사용을 제한할 수 있습니다 decellularized 동물 투어8. 또한 환자에 게 잠재적인 질병 전송 및 일부 decellularized 포유류 조직9면역학 반응에 대 한 우려가 있다.
셀 루 로스, 식물 및 세균성 소스에서 파생 된 다양 한 응용 프로그램에 대 한 바이오 재생 의학에서 생성 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. 몇 가지 예는 다음과 같습니다:10,11, 연골12,,1314 및 상처 치유15뼈. 그들은 내 구성과 저항 포유류 세포에 의해 분해 되 고 하는 룰의 구성 되어 건설 기계 추가 혜택이 있다. 이것이 사실은 포유류 세포는 셀 룰 로스 분자를 분해 하는 데 필요한 효소를 생산 하지 않습니다. 비교에서는, 건설 기계는 세포 외 기질, 콜라겐 등에서 고분자를 사용 하 여, 쉽게16 를 세분화 생산과 장기 응용 프로그램에 적합 하지 않을 수 있습니다. 콜라겐 건설 기계 화학 cross-linking에 의해 안정 될 수 있다. 그러나, 건설 기계17의 생체 적합성에 영향을 주는 cross-linkers의 고유한 독성 때문 교환이 이다. 반대로, 셀 루 로스 통하지 포유류 세포18,,1920효소 저하 때문에 시간의 연장된 기간에 대 한 이식의 사이트에 남아 있을 가능성이 있다. 이 가수분해 전처리를 통해 저하의 속도 cellulases21장비의 공동 배달을 조정 하 여 변경할 수 있습니다. Decellularized 플랜트-파생 셀 룰 로스 건설 기계에서 vivo에서 의 생체 적합성도 쥐22연구에서 입증 되었습니다.
진화의 년의 수백만의 수백을 통해 식물의 구조와 구성의 유체 수송 및 유지의 효율성을 증가 하 정제는. 공장 혈관 혈관은 작은 혈관, 머 레이 법23에 따르면 포유류 맥 관 구조에 유사한으로 분기 하 여 유압 저항을 최소화 합니다. Decellularization, 후 식물의 용기 및 상호 연결 된 숨 구멍의 복잡 한 네트워크 유지 됩니다. 쉽게 사용할 수 있는 고유 식물 종의 수많은 고려 건설 기계 공장에서 파생 된 현재 조직 공학24,25건설 기계에 영향을 미치는 디자인 한계를 극복 하기 위해 가능성이 있다. 예를 들어, Modulevsky 그 외 여러분 시연 신생 및 셀 마이그레이션 decellularized 애플 조직 마우스22의 뒤에 피하 이식 했다 때 발생. 마찬가지로, Gershlak 외. 내 피 세포 decellularized 잎24의 맥 관 구조 내에서 성장 될 수 있었다 보여주었다. 별도 실험에서 Gershlak 그 외 여러분 또한 cardiomyocytes 잎의 표면에 성장 수와24계약 수를 보여줄 수 있었다.
식물은 또한 현재까지 개발 된 가장 진보 된 제조 기법으로도 달성 하기 어려운 거시적인 규모에 복잡 한 조직 세포에서 포함 됩니다. 식물 조직의 복잡 한 계층 구조 디자인은 그들이 그들의 성분26의 합계 보다 더 강한 합니다. 식물 줄기 등 견고 하 고 힘든 구성에서 배열 하는 다른 기계적 특성의 과다 보유와 같은 훨씬 더 유연 하 고 유연한 것27를 나뭇잎. 잎 크기 면에서 종에 따라 다릅니다, 그리고 모양, 강도, vascularization, 정도 휴식 및 화란의 다른 학위를가지고 있습니다. 전반적으로, 이러한 식물 속성 decellularized 식물 독특하고 대단히 기능적인 의료 기기, 건설 기계 엔지니어링 조직 등으로 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.
이 프로토콜 decellularize 식물 조직에 두 가지 방법에 초점을 맞추고와 같은 고 조직 공학에서 공중 발판으로 사용 하기 위해 유래한 다. 첫 번째 방법은 DNA와 포유류 decellularize 조직6,22,25 식물에 널리 사용 되는 기술에서 적응 되어 세포 물질을 제거 하는 일련의를 사용 하는 세제 기반 기술 ,,2829,30. 두 번째 방법은 세제 무료 이며 일반적으로 나뭇잎31의 부드러운 조직을 제거 하는 데 사용 하는 "skeletonization" 프로토콜에서 적응 됩니다. 이전 작업 그 주변의 부드러운 조직31는 맥 관 구조 분리를 촉진 표 백제와 나트륨 중 탄산염 해결책에서 잎을 끓인 것을 보여주었다. 이 기술은 17번째 및 18번째 세기 Albertus Seba32 및33에드워드 패 리 쉬 작품 등에서 실시 하는 실험을 다시 인용 될 수 있다. 이러한 실험을 중심으로 잎과 과일, 같은 공장 문제를 떠나 장기간 물에 잠긴 (달 주) 시간과 수 있도록 자연스럽 게 멀리 부패 부드러운 조직. 여기 "skeletonization" 접근은 셀룰러 잔류물을 제거 하 고 부드러운 조직 구조를 크게 방해 하지 않도록 낮은 온도에서 더 이상 보육 시간 등 온화한 조건, 사용에 적응 됩니다. 여기 자세한 실험에 대 한 3 개의 식물 종류 사용 되었다: 무화과나무 hispida, Pachira aquatica 및 필리핀의 종. DNA 정량화, 기계적 테스트, 그리고 두 방법 모두에서 세포 대사 활동에 미치는 영향의 결과 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>Sigma Life Science</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>807426</td><td>종이에 언급된 비이온성 계면활성제. 매우 점성이 있는 시약은 피펫 팁을 끌어올릴 때 피펫 끝부분을 자르는 데 도움이 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>농축 표백제 (8.25 % 차아 염소산 나트륨)</td> <td>클로록스</td><td>항목 # : 31009</td><td>표준 농축 표백제.</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Acros Organics</td><td>217120010</td><td>수산화나트륨 또는 탄산나트륨으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>8mm Biopunch</td><td>HealthLink</td><td>15111-80</td><td>24웰 플레이트</td></tr><tr><td>Belly Dancer-Shake 테이블</td><td>Stovall Life Sciences</td><td>BDRAA115S</td>에 잘 맞는 샘플을 절단합니다<td>. 조직을 손상시키지 않도록 저속을 사용합니다. 쉐이크 테이블의 모든 모델/브랜드를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Isotemp 핫/교반 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>모든 스타일/브랜드의 핫/교반 플레이트를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>비커</td><td>Any</td><td></td><td>: 샘플에 맞고 샘플이 너무 붐비지 않는 한 모든 크기의 비커를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Tris Hydrochloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT50003PC</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA 분석</td><td>Life Technologies</td><td>P11496</td><td>모든 dsDNA 정량 분석 방법을 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

헌, 합성, 및 동물 파생 된 이식 조직 교체에 대 한 건설 기계로 현재 사용 되는 낮은 가용성, 불 쌍 한 생체 적합성 및 비용 제한이 있습니다. 식물 조직 그들이 유일 하 게 적합 상호 다공성, 기존 혈관 네트워크, 그리고 다양 한 기계 건설 기계, 높은 표면적, 우수한 물 수송 및 보존, 등으로 사용 하는 유리한 특성이 있다 속성입니다. 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 식물 decellularization의 2 개의 성공적인 방법이 여기 설명 되어 있습니다. 첫 번째 방법은 포유류 조직 취소 하는 데 사용 하는 이전 설립된 방법과 비슷합니다 세포 물질을 제거 하는 세제 목욕을 기반으로 합니다. 두 번째 잎 맥 관 구조를 격리 하 고 온수 표 백제 및 잎과 줄기를 소금 목욕의 사용을 포함 하는 프로토콜에서 적응 하는 세제 무료 방법입니다. 두 방법 모두 유사한 기계적 특성 및 낮은 세포 대사 충격, 따라서 더 나은 그들의 의도 된 응용 프로그램을 적합 한 프로토콜을 선택 하려면 사용자를 허용 건설 기계를 얻을.

두 방법 모두 굴복 건설 기계 세포 배양 및 조직 엔지니어링 응용 프로그램에 적합 했다. 그림 1 세제 기반 메서드와 세제 없는 메서드에 대 한 컷된 샘플 (8 m m 직경)에 그대로 잎을 사용 하 여 decellularization 프로세스의 일반적인 워크플로 보여 줍니다. 무화과나무 hispida 조직 두 방법 모두 다음의 성공적인 decellularization 나왔고 명확 하 고 그대로 샘플 (그림 1A 및 1B). 그것은 전체 식물 조직 (그림 1A); decellularize 수 그러나, 작은 샘플을 빠르고 효과적으로 취소 등장. 세제-기반 접근 방식으로 관찰 잠재적인 문제 참여 비 이온 계면 활성 제 탕 (그림 1C<...

여기에 우리가 현재, 및 대비 2 프로토콜 decellularize 식물 조직 하는 데 사용: 세제 기반 접근 및 세제 무료 접근. 두 방법 모두 다음 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 건설 기계로 활용 될 수 있습니다 사용, 식물 조직의 세포 외 매트릭스 뒤에 남겨두고.

Decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

이러한 방법은 정교한 초미세 구조 및 확장 가능한 제조를 통해 우수한 유체 전달 기능을 갖춘 스캐폴드 개발과 같은 생체 재료 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 특수 장비 없이도 줄기 조직용 대부분의 식물에 적용할 수 있다는 것입니다. 먼저 F.hispida 잎의 신선 또는 냉동 샘플을 수집합니다.나중에 사용할 수 있도록 남아있는 신선한 샘플을 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 잎을 섭씨 20-25도의 탈이온수에 그대로 두십시오. 깨끗한 생검 펀치를 사용하여 잎을 직경 8mm 디스크로 자릅니다.다음으로, 잎 샘플을 세척하려면 탈이온수에 담근 후 5-10분 동안 저속으로 쉐이크 플레이트에서 배양합니다. 그런 다음 탈이온수에 SDS의 부피로 10%중량을 준비합니다. SDS 용액을 준비한 후 잎 샘플을 플라스틱 접시에 놓습니다.그런 다음 SDS 용액을 추가하여 샘플을 완전히 덮습니다. SDS 에머 잎 s를 놓습니다.amp증발을 방지하기 위해 덮개를 씌운 다음 쉐이크 플레이트에 놓습니다. 그런 다음 잎 샘플을 실온에서 5일 동안 배양합니다.5일간의 배양 후 SDS 용액을 탈이온수로 교체하십시오. 탈이온수에 담근 샘플을 쉐이크 플레이트에서 10-15분 동안 배양합니다. 다음으로, 5ml의 비이온 계면활성제와 50ml의 표백제를 혼합합니다.이 혼합물을 445ml의 탈이온수에 첨가하십시오. 그런 다음 갓 준비된 비이온 계면활성제 표백제 용액에 샘플을 추출합니다. 샘플이 제거될 때까지 24시간마다 비이온 계면활성제 표백제 용액을 계속 교체하십시오.그런 다음 세척된 샘플을 탈이온수에 2분 동안 담근 상태로 쉐이크 플레이트에 담가 둡니다. 세제가 없는 탈세포화를 위해 중탄산나트륨 용액 3%중량에 5% 부피 표백제를 준비합니다. 다음으로, 흄 후드 내의 핫 플레이트에서 용액을 섭씨 60-70도까지 가열합니다.용액이 원하는 온도에 도달하자마자 잎 샘플을 담그십시오. 그런 다음 시료 손상을 방지하기 위해 교반 플레이트의 속도를 줄이고 눈에 띄게 세척된 시료를 찾아 수조에서 조심스럽게 옮깁니다. 마지막으로 샘플을 탈이온수에서 1-2분 동안 배양합니다.모든 샘플이 본질적으로 다르기 때문에 샘플이 손상되지 않았는지 확인하기 위해 약 15분마다 탈세포화 진행 상황을 확인하는 것이 좋습니다. MTM, SAF 및 UTS 매개변수는 P.aquatica 및 F.hispida 종의 고유한 탈세포화된 골

two-methods-for-decellularization-plant-tissues-for-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

재관류의 decellularization는 기관의 세포외 기질 구성과 마이크로 아키텍처를 유지 전체 간 공사장 공중 발판을 생산하는 새로운 기술입니다. 여기에, hepatocytes과 재관류의 decellularization 이후 repopulation를 사용하여 전체 오르간 공사장 공중 발판을 준비하는 방법이 설명되어 있습니다. 기능 및 transplantable 간 이식이 기술을 사용하여 생성할 수 있습니다.

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.

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거꾸로 방향 가압된 주머니 안에 전체 인간의 마음의 decellularization

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