Name: 인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 학습하세요 인간 면역 세포의 3차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경법을 사용하여 콜라겐 매트릭스 내 세포 이동을 추적하는 방법을. 이 기법은 광독성을 최소화하며 생리학적으로 관련된 환경에서 면역 세포 역학을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리 임상 Hemostaseology 연구소 및 수혈 의학 기증자 혈액;를 제공 하기 위한 감사 합니다. 카르멘 Hässig 및 우수한 기술 지원에 대 한 코 라 호자. 우리 LifeAct mEGFP 구조를 생성 하기 위한 수정된 pMAX 벡터에 대 한 옌스 Rettig (자를란트 대학), 롤랜드 Wedlich-용 병 (뮌스터 대학) 원래 LifeAct-루비 구문 및 기독교 고물 (자를란트 대학) 감사 합니다. 이 프로젝트는 Sonderforschungsbereich 1027 (B.Q. 프로젝트 A2)와 894 (수소 프로젝트 a 1)에 의해 투자 되었다. 빛-시트 현미경 DFG에 의해 투자 되었다 (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

인간의 재료 (인간의 혈액 기증자 로부터 백혈구 감소 시스템 실)와 함께이 연구를 위해 실시 하는 연구 승인 지역 윤리 위원회 (16.4.2015 (84/15;에서 선언 교수 박사 Rettig Stürmer))와 해당 지침을 따릅니다.
1. 중화 콜라겐 솔루션의 준비 (500 µ L)
<ol><li>셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 냉장된 콜라겐 재고 솔루션 (10.4 mg/mL)의 400 µ L를 전송. 천천히의 50 µ L 냉장 10 x PBS (pH 7.0-7.3) 냉장된 콜라겐 재고 솔루션의 400 µ L 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 타일링 하 여 솔루션을 믹스. 참고: 1 부의 모든 단계는 셀 문화 후드 행해져야 한다.</li>
	<li>1.1에서 콜라겐 솔루션의 500 µ L로 0.1 M NaOH의 8 µ L를 추가 합니다. pH 7.2-7.6를 조정 하려면 PH 시험 지구를 사용 하 여 (pH 범위: 6-10) 혼합물의 pH 값을 확인 하. 참고: 볼륨 콜라겐의 다른 일괄 처리에 대 한 달라질 수 있습니다. NaOH 솔루션을 공기 방울을 피하기 위해 천천히 혼합 될 수 있다. 혼합물을 콜라겐 겔 화를 피하기 위해 얼음에 보관 한다.</li>
	<li>추가 2 µ L 살 균 ddH2O 500 µ L. 최종 볼륨을 잘 섞어 또는 및 저장이 콜라겐 솔루션 (8.32 mg/mL) 얼음에 4 ° C에서 사용까지. 참고:이 조건 하에서 중화 콜라겐 사용할 수 있습니다 24 h. 위해 Aliquots 공기 방울을 피하기 위해 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>2. 샘플 준비 빛 시트 형광 현미경 검사 법 모 세관을 사용 하 여
<ol><li>앞에서 설명한 대로 붙일 원하는 기본 형광 염료15 또는 형광 단백질11 관심의 라이브 셀 라벨.</li>
	<li>1 × 106 셀의 셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 전송 합니다. 원심 8 분 삭제에 대 한 200 x g에 튜브는 상쾌한 고 문화 매체의 200 µ L에 펠 릿을 resuspend. 참고: 5 × 106 셀/mL의 셀 밀도 인간의 면역 세포 이동, 세포 독성 T 세포 (CTL)과 자연 킬러 (NK) 세포의 시각화에 대 한 것이 좋습니다.</li>
	<li>1.3에서 중화 콜라겐 솔루션의 85.9 µ L를 추가 합니다. 에 세포 현 탁 액 2.2에서. 그리고 제대로 2.5 mg/mL의 콜라겐 농도 도달 하는 혼합. 후드에 얼음에 셀/콜라겐 혼합을 둡니다. 참고: 콜라겐의 원하는 농도 N mg/mL 이면 가정의 볼륨 무력화 (200 µ L 세포 현 탁 액)에 대 한 콜라겐 솔루션 = 200 × N /(8.32-N)</li>
	<li>다음, 모 세관에 넣고 일치 플런저 (내부 직경 ~ 1 mm) 플런저는 모 세관에서 1 m m까지. 문화 매체 (그림 1A)로 담거 서 플런저를 젖은. 참고:이 단계는 모 세관 셀/콜라겐 혼합으로 감소 때 기포를 방지 하기 위해 도울 수 있었다. 모 세관 및 플런저 살 균 될 필요가 없습니다.</li>
	<li>2.3에서 셀/콜라겐 혼합으로 모 세관을 찍어. 천천히 다시 10-20 m m (그림 1B)에 대 한 플런저를 당겨. 70% 에탄올 스프레이 나머지 콜라겐 솔루션 제거를 적신 종이 타월로 모 세관의 외부 벽을 닦으십시오.</li>
	<li>5 mL 튜브의 내부 벽에 클레이 모델링 모 세관을 탑재 하 고 모 세관 (그림 1C)의 가장자리에 셀/콜라겐 혼합을 밀어.</li>
	<li>5% CO2 콜라겐 합 1 h 37 ° C에서 모 세관을 유지.</li>
	<li>5 mL 튜브를 배양 (약 1-2 mL)를 추가 합니다. 신중 하 게 약 3/4 매체 (그림 1D)에 걸려 콜라겐의 중간에 밖으로 생산 콜라겐 로드를 누릅니다.</li>
	<li>모 세관,이, 같은 매체를 가진 교원 질 막대 equilibrate 또 다른 30 분 5% CO2 와 37 ° C에서 유지. 참고: 나중에, 콜라겐 막대 수 수 철수 모 세관 그리고 경작에 더 사용 하기 전에 추가.</li>
</ol>3. 이미지 수집 빛 시트 현미경을 사용 하 여
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 샘플 챔버 어셈블리입니다.</li>
	<li>보육 및 현미경 시료 챔버 (라이브 셀 이미징만)에 대 한 37 ° C에가 열을 켭니다.</li>
	<li>시료 챔버에서 모 세관을 놓고 이미지 수집에 대 한 관심의 영역을 찾아 샘플을 찾습니다.</li>
	<li>해당 laser(s)를 활성화 합니다. 다음 설정을 설정: 레이저 전원, 노출 시간, 단계-z-스택, 시작 위치와 끝 위치 z-스택, 그리고 라이브 셀 이미징에 대 한 시간 간격의 크기. 참고: 예를 들어 그림 2 의 샘플은 몇 군데 모든 40 단계-1 µ m의 크기와 37 ℃에서 6 h s (총 두께: 538 µ m). 레이저 파워 노출 시간 30 양 x-y 방향에서 픽셀 크기의 1%는 0.23 µ m 이었다.</li>
	<li>이미지 수집을 시작 합니다.</li>
</ol>4. 자동 분석 추적
<ol><li>파일 변환기를 열고, 파일 추가 (*.ims) 소프트웨어 파일 형식으로 변환할 이미지 파일 선택을 클릭 합니다. 찾아보기 를 클릭 하 고 변환 된 파일을 저장할 폴더를 선택 합니다. 모든 시작을 클릭 합니다.</li>
	<li>분석 소프트웨어를 엽니다. 클릭 능가합니다. 파일 에 가십시오 오픈, 클릭 다음 이미징 파일 분석을 선택 합니다. 참고: 파일 크기가 큰 경우이 단계 시간을 걸릴 수 있습니다. 1 테라바이트 (TB) 보다 큰 파일 권장 하지 않습니다 하나의 실험에 대 한 프로세스와 같은 큰 파일은 매우 계산 용량 요구.</li>
	<li>새로운 관광 명소를 추가클릭 합니다. 프로세스 전체 이미지 마지막으로상자를 확인 하십시오. 다음을 클릭 합니다.</li>
	<li>입력 x 좌표와 y (픽셀)에 관심 영역을 정의 하. (시간 및 z 위치) 분석 프레임 수를 입력 합니다. 다음을 클릭 합니다.</li>
	<li>소스 채널의 드롭다운 목록에서 추적할 개체를 포함 하는 대상 채널을 선택 합니다. 입력 예상 xy 직경 (µ m). 다음을 클릭 합니다. 참고: 예상된 xy 직경 추적할 개체의 x-y 차원에서 평균 지름이입니다.</li>
	<li>품질을 클릭 합니다. 있는 셀 (개체)의 대부분은 포함 되어야 하는 임계값을 설정 합니다. 다음을 클릭 합니다.</li>
	<li>원하는 알고리즘 (회귀 모션 권장)을 선택 합니다. 입력 하는 최대 거리 (20 µ m 권장)와 최대 간격 크기 (3 또는 2 권장). 프로세스 전체 이미지를 마지막으로클릭 합니다. 참고: 최대 거리 와 최대 간격 크기 트랙 휴식 두 임계값은. 좀 더 구체적으로, 두 개의 연속 프레임에서 동일한 개체 사이의 거리 최대 거리를 초과 하는 때 나중 프레임에이 개체 간주 됩니다 새 개체로. 가끔 중, 같은 개체 수 있습니다 몇 프레임 사라지고 다시 나타난다. 이 경우에, 최대 간격 크기 내에서이 개체가 다시 나타납니다 경우에 그것은 동일한 개체도 간주 될 것 이다.</li>
	<li>필터 형식 을 클릭 하 고 원치 않는 트랙을 제외 하는 옵션을 선택 합니다. 참고:이 단계는 선택 사항입니다.</li>
	<li>다음 을 클릭 한 다음 마침을 클릭 합니다. 참고:이 단계는 일 컴퓨팅 성능에 따라 시간을 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>트랙 편집 을 클릭 하 고 올바른 드리프트를 선택 합니다. (변환 드리프트 권장) 적절 한 알고리즘을 선택 합니다. 원하는 결과 데이터 집합 크기 를 선택 합니다 (새 크기와 같은 현재 크기 권장). 확인을 클릭 합니다. 참고:이 단계는만 콜라겐 이미지 중 떠내려 때 필요한.</li>
	<li>통계 를 클릭 하 고 구성의 표시 통계 값 목록을선택 합니다. 관심의 옵션을 수출 (예: 좌표, 속도 및 등) 확인 하십시오. 확인을 클릭 합니다.</li>
	<li>파일 내보내기 모든 통계 를 클릭 하 고 파일 이름을 입력 합니다.</li>
</ol>5. 고정 및 면역 형광 콜라겐 매트릭스 셀의 얼룩
<ol><li>화학 후드 5 mL 튜브에 4 %paraformaldehyde (PFA, PBS)의 1000 µ L를 전송 합니다. 참고: PFA 실내 온도 균형 해야 합니다.</li>
	<li>2.9에서 생산 콜라겐과 모 세관을 찍어. PFA 솔루션으로 (대 한 ~ 5 m m) ( 그림 1C에서 같이) 클레이 모델링 5 mL 튜브의 내부 벽에는 모 세관을 탑재.</li>
	<li>PFA 솔루션 (그림 1D)에 매달려 콜라겐 로드의 절반 때까지 플런저를 살짝 누릅니다. 20 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.</li>
	<li>다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. 모 세관을 꺼내와 PFA 삭제.</li>
	<li>신선한 관으로 모 세관을 탑재 하 고 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 모 세관은 PBS에 몰입은 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>교원 질 막대의 절반은 솔루션에 매달려 때까지 플런저를 살짝 누릅니다. 클레이 모델링 내부 벽에는 모 세관을 탑재 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.</li>
	<li>5.4를 반복 합니다. -또 다른 2 시간 동안 5.7입니다.</li>
	<li>다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. PBS를 삭제 합니다. 차단/permeabilization 버퍼 (PBS + 1 %BSA + 0.1% 비 이온 계면 활성 제)의 1-2 mL 튜브에 전송 하 고 5.6를 반복 합니다. 참고: BSA (1%) 5% 보조 Ab에서 발생 하는 동물의 혈 청으로 교체할 수 있습니다.</li>
	<li>30-60 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.</li>
	<li>다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. Permeabilization 버퍼를 삭제 합니다. 차단/permeabilization 버퍼에 1 차적인 항 체의 200-500 µ L를 전송 하 고 솔루션으로 막대를 퇴 학 시켜도.</li>
	<li>1 시간에 대 한 실 온에서 튜브를 유지.</li>
	<li>5.4에 설명 된 대로 3 번 PBST (PBS + 0.1-% 비 이온 계면 활성 제)와 함께 교원 질 막대를 씻어. -5.8입니다.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 대 한 차단/permeabilization 버퍼에 이차 항 체에 막대를 품 어. 빛에서 그것을 유지.</li>
	<li>5.4에 설명 된 대로 콜라겐 로드 3 회 PBS로 세척. -5.8입니다.</li>
	<li>다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. PBS 영상까지 샘플을 하십시오.</li>
	<li>3에 설명 된 대로 샘플을 검사 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 금융 또는 상업적 충돌의 관심을 선언합니다.

대부분 체 외에서 분석 vivo에서 세포, 면역 세포 특히 주로 3D microenvironment을 경험 하는 반면 2D 표면, 세포 배양 배지, 페 트리 접시 또는 coverslips, 예를에 밖으로 수행 됩니다. 증거를 신흥 면역 세포의 이동 패턴 2D 및 3D 시나리오17사이 다 보여줍니다. 또한, 종양 세포의 식을 프로필은 2D 및 3D 교양 조직18,,1920에서 다른도. 따라서, 최고의 시뮬레이션 시험관에생리 적 조건, 예를 들면 3D 콜라겐 매트릭스에서에서 3D 맥락에서 실험을 수행 하는 큰 장점은의입니다. 새로 개발된 된 접근, 특히 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 제어 환경 조건 하에서 3 차원 매트릭스 시스템에서 안정적이 고 재현 실험을 수 있습니다.</...

마이그레이션에 대 한 대부분 지식 세포에서 온다 2D는 일반적으로 유리 또는 플라스틱 표면 문화/이미징의 실시는1,2,3, 실험 접시. 그러나, 생리 적인 시나리오 필요, 대부분의 경우, 3D microenvironment, 기질 (ECM) 결정적인 역할을 담당 합니다. ECM 뿐만 아니라 적절 한 세포 형태를 유지 하기 위해 3 차원 구조 에센셜을 제공 하지만 또한 생존 신호 또는 많은 셀4,5 의 최적의 기능에 대 한 방향 신호를 제공 합니다. 따라서, 3D 환경이입니다 더 나은 휴대 전화 기능 및 생리 적 컨텍스트를 반영 하는 더 나은 환경에서 동작을 식별 하는 데 필요한.
인간의 신체에서 대부분 세포 면역 세포 특히 3D 시나리오에서 그들의 기능을 발휘 한다. 예를 들어 활성화 된 T 세포 순찰 조직 대상 셀에 대 한 검색, naïve T 세포 마이그레이션 기간 동안 마이그레이션 모드와 기계는 해당 하는 extracellular 적응 그들의 동족 항 원 제시 세포에 대 한 검색에서 림프절을 통해 환경3,,67. 3D 콜라겐 젤 잘 설립 하 고 잘 특징이 3D 셀 문화 시스템8,,910로 널리 사용 되었습니다. 우리의 이전 작품에서는 기본 인간의 세포 높은 모바일 0.25% 콜라겐 기반 매트릭스11약 4.8 µ m/min의 평균 속도에 마이그레이션할. 골격의 재배치는 셀 마이그레이션12에서 핵심 역할을 한다. 세포 이동의 단일 모드에만 적용 되지 않습니다 아직 위치, microenvironment, cytokines, 혈 그라디언트, 특정 마이그레이션 동작 간에 전환할 수 및 extracellular 신호는 조정 보여주는 증거를 축적 된 여러 가지 방법 3에 철새 행동입니다.
안정적으로 면역 세포 기능 및 동작을 예를 들어 마이그레이션, 돌출 형성 또는 기공을 교통 분석을 그것 큰 장점은 신속 하 고 안정적인 방식으로 상대적으로 대용량 3D 이미지를 취득할 수 있을 것입니다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 만족 스러운 솔루션13,14을 제공 합니다. 이미지 수집, 동안 얇은 정적 빛 시트 샘플을 밝히는 생성 됩니다. 초점 비행기에 이렇게에서 넓은 지역 비행기에서 세포를 영향을 주지 않고 동시에 조명 될 수 있습니다. 이 기능에는 크게 감소 표백 및 photocytotoxicity 높은 수집 속도를 수 있습니다. 이 문서에서 우리 주 인간의 면역 세포 빛 시트 현미경을 사용 하 여 시각화 하는 방법 및 마이그레이션 3D 시나리오에서를 분석 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Fibricol, bovine collagen solution</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>&nbsp;#5133-20ML</td><td>콜라겐 매트릭스</td></tr><tr><td>0.5 M NaOH 용액</td><td>Merck</td><td>1091381000</td><td>for neutralizing Fibricol solution</td></tr><tr><td>Ultra-Low melting agarose</td><td>Affymetrix</td><td>32821-10GM</td><td>저농도 c[Col]</td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>11348D</td><td>PBMC에서 일차 인간 CD8+ T 세포 분리</td></tr><tr><td>T 세포 증식 및 활성화를 위한 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Thermo Fisher</td><td>11132D</td><td>CTL 집단의 활성화</td></tr><tr><td>인간 재조합 인터루킨-2</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC0023</td><td>배양 CTL</td></tr><tr><td>P3 1차 용액 키트</td><td>Lonza</td><td>V4XP-30XX</td><td>Transfection</td></tr><tr><td>&alpha;-PFN1 항체, 토끼, IgG</td><td>Abcam</td><td>ab124904</td><td>IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22284</td><td>IF</td></tr><tr><td>CellMask 주황색 플라즈마 멤브레인 염색</td>체 <td>Thermo Fisher</td><td>C10045</td><td>형광 세포 라벨</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-250mL</td><td>IF</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Eurobio</td><td>018774</td><td>IF</td></tr><tr><td>DPBS Dulbecco의 phopsphate 완충 식염수</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>IF 소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A9418-100G</td><td>IF</td></tr><tr><td>Goat &alpha; 토끼 568, IgG, 토끼</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11011</td><td>IF</td></tr><tr><td>Lightsheet Z.1 (광시트 현미경)</td><td>Zeiss</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 후드</td><td>Thermo Fisher</td><td>HeraSafe KS</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터 HERACell 150i&nbsp;</td><td>써모 피셔</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5418 및 5452</td><td>Eppendorf</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039, 3123000020, 3123000063</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>VWR</td><td>89079-444, 89079-436, 89079-452&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>모세혈관 50 &마이크로; L</td><td>VWR (브랜드)</td><td>613-3373</td><td>Zeiss LSFM 샘플 준비</td></tr><tr><td>캐필러리용 플런저</td><td>VWR (브랜드)</td><td>BRND701934</td><td>"테플론 팁이 있는 스탬프" LSFM 샘플 준비</td></tr><tr><td>MColorPhast pH 스팁</td><td>Merck</td><td>1095430001</td><td>중화된 Fibricol</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1mL 주사기</td><td>BD</td><td>Z230723&nbsp; ALDRICH</td><td>대체 시료 준비</td></tr><tr><td>모델링 점토 (Hasbro Play-Doh A5417EU7)</td><td>Play-Doh</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 파일 변환기</td><td>Bitplane</td><td>available at http://www.bitplane.com&nbsp;</td><td>이미징 파일을 Imaris 파일 형식으로 변환</td></tr><tr><td>Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)</td><td>Bitplane</td><td>available at http://www.bitplane.com&nbsp;</td> (비트플레인)<td>3D 및 4D 이미징 데이터 분석</td></tr></tbody></table>

인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

Vivo에서, 활성화, 확산, 그리고 모든 면역 세포의 기능 림프절 이나 조직에 예를 들어 3 차원 (3D) 환경에서 발생합니다. 최신, 대부분 체 외에 시스템 셀 문화 또는 coverslips와 같은 2 차원 (2D) 표면에 의존합니다. 최적의 모방 생리 조건에 생체 외에서우리는 간단한 3D 콜라겐 매트릭스를 활용합니다. 콜라겐은 세포 외 기질 (ECM)의 주요 구성 요소 중 하나입니다 그리고 3D 매트릭스 구성에 널리 사용 되 고 있다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 높은 수집 속도, 큰 침투 깊이, 낮은 표백 및 photocytotoxicity 기능입니다. 또한, 빛 시트 현미경 장기 측정을 위해 특히 유리 하다. 여기 우리는 최적화 된 프로토콜 설정 하 고 인간의 면역 세포, 예를 들어 기본 인간의 세포 독성 T 세포 (CTL)을 처리 하는 방법을 설명 하 고 라이브 셀 이미징에 대 한 빛-시트 현미경과 사용에 대 한 3D 콜라겐 매트릭스에 자연 킬러 (NK) 세포와 고정된 샘플입니다. 이미지 수집 및 세포 이동의 분석을 위한 절차 되 게 됩니다. 특히 초점 중요 한 단계 및 샘플 준비 및 데이터 분석에 대 한 요소를 강조 하기 위해 제공 됩니다. 이 프로토콜은 3D 콜라겐 매트릭스에 현 탁 액 셀의 다른 종류에 대 한 고용 수 있습니다 하 고 면역 세포에 국한 되지 않습니다.

T 세포 마이그레이션 중 돌출 형성 걸 의존 하는 매우 역동적인 프로세스입니다. 기본 인간 CTL의 돌출 형성을 시각화 하려면 우리는 뚜렷이11전에 설명한 대로 CTL에 말라 골격을 mEGFP 융합 단백질 페. Transfection, 후에 1 일 셀 콜라겐 매트릭스에 포함 했다. 이미지 스택 인수 했다 모든 40 단계-빛-시트 현미경을 사용 하 여 37 ° C에서 1 µ m의 크기와 함께 s. 같이 그림 2A 에 보충 영화 1, 마이그레이션 중 인간의 CTL 양식 주요 돌출 레몬 모양 좋은 스핀 들 모양의 구조에 의해 드리워진. 실험 같이, 뿐만 아니라 하나의 단일 셀은 몇 군데 있지만 큰 볼륨 (538 µ m3x 450 x 450)에서 (그림 2B). 따라서, 광학 품질...

여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

이 방법은 면역학 분야의 주요 질문, 예를 들어 3차원 환경에서 표적 세포를 효율적으로 검색하는 방법과 같이 생리학적으로 관련된 맥락에서 면역 세포가 정확히 어떻게 행동하는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 매우 얇은 광선 시트를 생성하여 오프 플레인 셀에 영향을 주지 않고 초점면만 비출 수 있다는 것입니다. 이를 통해 매우 빠른 수집 속도와 함께 표백 및 광세포 독성의 현저한 감소를 가능하게 합니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Renping Zhao 박사입니다. 먼저 세포 배양 후드 아래에서 400마이크로리터의 냉각 콜라겐 스톡 용액을 멸균 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 냉각된 50X PBS 50마이크로리터를 천천히 추가합니다.그런 다음 튜브를 부드럽게 기울여 용액을 혼합합니다. 콜라겐 용액에 0.1 몰 수산화나트륨 48 마이크로리터를 첨가하여 pH를 7.2에서 7.6으로 조정합니다. pH 테스트 스트립을 사용하여 혼합물의 pH 값을 결정하십시오.2마이크로리터의 멸균 증류수 탈이온수를 추가하여 최종 부피를 500마이크로리터로 만듭니다. 잘 섞어 콜라겐 용액을 얼음 위에 올려 보관하거나 나중에 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 살아있는 세포를 형광 라벨링한 후 세포 배양 후드 아래에서 10의 곱을 6번째 세포로 1배씩 멸균 1.5ml 튜브로 옮깁니다.튜브를 200회 g으로 8분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 버리고 200마이크로리터의 배양 배지를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 85.9마이크로리터의 중화된 콜라겐 용액을 세포 현탁액에 추가하고 적절하게 혼합하여 밀리리터당 2.5mg의 콜라겐 농도에 도달합니다.세포 콜라겐 혼합물을 후드의 얼음에 그대로 두십시오. 다음으로, 플런저가 모세관에서 1mm 돌출될 때까지 일치하는 모세관에 플런저를 삽입합니다. 그런 다음 배양 배지에 담궈 플런저를 적십니다.이 단계를 건너뛰면 플런저와 콜라겐 매트릭스 사이에 원치 않는 기포가 유입될 수 있습니다. 모세관을 세포 콜라겐 혼합물에 담그고 플런저를 천천히 10-20mm 뒤로 당깁니다. 그런 다음 70% 에탄올의 스프레이 병으로 종이 타월을 적셔 모세관 외벽을 닦아 남아 있는 콜라겐 용액을 제거합니다.이제 모델링 점토를 사용하여 5mm 튜브의 내벽에 모세관을 장착합니다. 세포 콜라겐 혼합물을 모세혈관 가장자리로 밀어 넣습니다

light-sheet-microscopy-for-three-dimensional-visualization-human

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 살아있는 T 세포와 항원 제시 세포 간의 상호 작용을 시각화하기 위한 격자 광시트 현미경 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 초박형 격자 광시트를 상호 작용하는 세포 쌍에 집중시켜 일련의 2차원 이미지를 얻고, 이를 결합하여 세포-세포 상호 작용의 시공간 역학을 나타내는 고해상도 4차원 이미지를 얻는 것을 포함합니다.

살아있는 세포에서 수용체-리간드 상호작용을 시각화하기 위한 Lattice Light Sheet 현미경 검사

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

이 프로토콜은 가벼운 시트 현미경의 설치 및 C의 생체 내 이미징을위한 그것의 구현에 대해 설명합니다 엘레 배아.

에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정<em&gt; 토토에서</em&gt; 이미징<em&gt; C. 엘레</em&gt; 개발

단일 평면 조명 현미경 용 모듈 (SPIM)이 쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양을 위해 최적화되어 설명된다. 샘플은 직사각형 모세관 내에 위치되며, 마이크로 유체 시스템 형광 염료로, 약제 또는 약물은 소량으로 적용 할 수있다.

단일 평면 조명 모듈과 와이드 필드 현미경 용 마이크로 모세관 접근법

여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

이 프로토콜의 목표는 살아있는 세포에 있는 표면 수용체 역학을 4 차원으로 가시화하기 위하여 격자 빛 시트 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 여기서CD4+ 원발성 T 세포상에 T 세포 수용체가 도시된다.

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

이 프로토콜은 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경을 구축하는 방법과 세포골격 네트워크 시각화를 위한 사용법에 대해 자세히 설명합니다.

세포골격 네트워크의 시각화를 위한 맞춤형 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경의 설계 및 구축

학습하세요 인간 면역 세포의 3차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경법을 사용하여 콜라겐 매트릭스 내 세포 이동을 추적하는 방법을. 이 기법은 광독성을 최소화하며 생리학적으로 관련된 환경에서 면역 세포 역학을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경

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