인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경

이 방법은 면역학 분야의 주요 질문, 예를 들어 3차원 환경에서 표적 세포를 효율적으로 검색하는 방법과 같이 생리학적으로 관련된 맥락에서 면역 세포가 정확히 어떻게 행동하는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 매우 얇은 광선 시트를 생성하여 오프 플레인 셀에 영향을 주지 않고 초점면만 비출 수 있다는 것입니다. 이를 통해 매우 빠른 수집 속도와 함께 표백 및 광세포 독성의 현저한 감소를 가능하게 합니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Renping Zhao 박사입니다. 먼저 세포 배양 후드 아래에서 400마이크로리터의 냉각 콜라겐 스톡 용액을 멸균 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 냉각된 50X PBS 50마이크로리터를 천천히 추가합니다.

그런 다음 튜브를 부드럽게 기울여 용액을 혼합합니다. 콜라겐 용액에 0.1 몰 수산화나트륨 48 마이크로리터를 첨가하여 pH를 7.2에서 7.6으로 조정합니다. pH 테스트 스트립을 사용하여 혼합물의 pH 값을 결정하십시오.

2마이크로리터의 멸균 증류수 탈이온수를 추가하여 최종 부피를 500마이크로리터로 만듭니다. 잘 섞어 콜라겐 용액을 얼음 위에 올려 보관하거나 나중에 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 살아있는 세포를 형광 라벨링한 후 세포 배양 후드 아래에서 10의 곱을 6번째 세포로 1배씩 멸균 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

튜브를 200회 g으로 8분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 버리고 200마이크로리터의 배양 배지를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 85.9마이크로리터의 중화된 콜라겐 용액을 세포 현탁액에 추가하고 적절하게 혼합하여 밀리리터당 2.5mg의 콜라겐 농도에 도달합니다.

세포 콜라겐 혼합물을 후드의 얼음에 그대로 두십시오. 다음으로, 플런저가 모세관에서 1mm 돌출될 때까지 일치하는 모세관에 플런저를 삽입합니다. 그런 다음 배양 배지에 담궈 플런저를 적십니다.

이 단계를 건너뛰면 플런저와 콜라겐 매트릭스 사이에 원치 않는 기포가 유입될 수 있습니다. 모세관을 세포 콜라겐 혼합물에 담그고 플런저를 천천히 10-20mm 뒤로 당깁니다. 그런 다음 70% 에탄올의 스프레이 병으로 종이 타월을 적셔 모세관 외벽을 닦아 남아 있는 콜라겐 용액을 제거합니다.

이제 모델링 점토를 사용하여 5mm 튜브의 내벽에 모세관을 장착합니다. 세포 콜라겐 혼합물을 모세혈관 가장자리로 밀어 넣습니다. 그런 다음 콜라겐을 중합하기 위해 섭씨 37도, 5%CO2에서 1시간 동안 모세관과 함께 튜브를 배양합니다.

배양 후 튜브에 1-2ml의 배양 배지를 추가합니다. 그런 다음 콜라겐의 약 절반이 배지에 매달려 있을 때까지 중합된 콜라겐 막대를 배지 밖으로 조심스럽게 배출합니다. 모세혈관을 30분 더 배양합니다.

광시트 현미경 검사를 수행하려면 제조업체의 지침에 따라 샘플 챔버를 조립하십시오. 실시간 이미징을 수행하는 경우 현미경과 인큐베이터를 켠 후 캐필러리를 샘플 챔버에 놓고 샘플을 찾고 이미지 획득을 위한 관심 영역을 찾습니다. 해당 레이저를 활성화합니다.

그런 다음 레이저 출력과 노출 시간을 설정합니다. 또한 Z 스택의 단계 크기, Z 스택의 시작 및 종료 위치, 라이브 셀 이미징을 위한 시간 간격을 설정합니다. 그런 다음 이미지 획득을 시작합니다.

PBS에 있는 4% 파라포름알데히드 1ml를 화학 후드 아래의 5ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 중합된 콜라겐이 있는 모세관을 파라포름알데히드 용액에 담그고 모델링 점토를 사용하여 튜브의 내벽에 모세관을 장착합니다. 콜라겐 막대의 절반이 파라포름알데히드 용액에 매달려 있을 때까지 플런저를 부드럽게 누릅니다.

그런 다음 플런저를 뒤로 당겨 콜라겐 막대를 모세관 안으로 다시 들어 올립니다. 튜브에서 모세관을 제거하고 파라포름알데히드를 버립니다. 캐필러리를 새 튜브에 장착하고 PBS 1ml를 추가합니다.

모세관이 PBS에 잠겨 있는지 확인합니다. 콜라겐 막대의 절반이 용액에 매달려 있을 때까지 플런저를 부드럽게 누르고 5분 동안 배양합니다. 플런저를 뒤로 당겨 모세혈관의 콜라겐 막대를 흡수합니다.

그런 다음 PBS를 새 PBS로 교체하고 콜라겐 막대를 용액으로 배출합니다. 세 번째 세척 후 1-2ml의 차단 투과 완충액을 튜브에 추가합니다. 콜라겐 막대를 용액으로 배출하고 튜브를 실온에서 30-60분 동안 배양합니다.

차단 투과화 완충액에서 차단 투과화 완충액을 200-500마이크로리터의 1차 항체로 교체하고 침수된 콜라겐 막대를 용액에 1시간 동안 배양합니다. PBST를 사용하여 콜라겐 막대를 세 번 세척한 후 실온에서 투과화 완충액을 차단하는 2차 항체로 막대를 1시간 동안 배양합니다. PBS를 세 번 더 세척한 후 콜라겐 막대를 모세혈관으로 다시 당겨 넣고 이미징할 때까지 샘플을 PBS에 보관합니다.

이 동영상에서 볼 수 있듯이, 이동 중에 EGFP 액틴 융합 단백질로 형질 주입된 CTL 세포는 미세한 방추체와 같은 구조로 둘러싸인 레몬 모양의 주요 돌출부를 형성했습니다. CTL의 궤적은 여기에 속도와 지속성 또는 변위를 총 트랙 길이로 나눈 값으로 측정된 매개변수로 설명되어 있습니다. 속도 범위는 초당 0.01에서 0.19미크론이며 거의 20배 차이가 있으며 지속성 범위는 0에서 0.7까지입니다.

이 그림은 내인성 퍼포린-1 및 액틴으로 염색된 3D 콜라겐 겔의 고정 CTL 세포를 보여줍니다. 샘플은 한쪽 또는 양쪽에서 조명되었습니다. 서로 다른 Z 위치에서 세포가 고르게 염색되어 콜라겐 겔에 항체가 잘 침투하고 있음을 나타냅니다.

Fixed CTL은 살아있는 세포와 동일한 형태를 보였으며, 이는 형태학이 이 프로토콜로 잘 유지되고 있음을 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 기포를 피하고 pH 값을 적절하게 조정하는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차에 따라 특정 표면 분자를 사용한 살아있는 세포 염색과 같은 다른 방법을 수행하여 세포 거동을 분화 또는 다른 세포 아형과 상관시키는 방법 또는 세포-세포 상호 작용 및 세포 운명을 조사하는 방법과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 세포 생물학, 면역학 및 암 연구 분야의 연구자들이 생리학적으로 가장 관련성이 높은 in vitro 시스템에서 세포 행동, 세포 운명, 분화 및 세포 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 3차원 콜라겐 매트릭스에 포함된 세포로 샘플을 준비하는 방법, 실시간 또는 고정식 광시트 현미경을 사용하여 샘플을 시각화하는 방법, 3D로 세포 이동을 추적하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.