녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

이 방법은 병원성 박테리아가 식물 세포에 분비되는 효과기라는 단백질을 사용하여 숙주 식물 세포의 최적 상태를 방해할 수 있는 방법과 같은 식물-미생물 상호 작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 박테리아 효과기 단백질이 본래 발현 시스템을 사용하여 박테리아 세포에서 발현된 다음 박테리아 유형 III 분비 시스템을 통해 식물 세포로 전달된다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Nicotiana benthamiana 및 Arabidopsis thaliana 식물을 준비합니다.

다음으로, 표준 전기천공법을 사용하여 sfGFP11 태그에 융합된 플라스미드 운반 및 효과기 유전자를 Pseudomonas syringae pathovar tomato CUCPB5500 균주로 변환합니다. 최적의 시점과 발현 수준 또는 sfGFP의 재구성은 실제로 effector 단백질에 따라 다릅니다. 접종 또는 관찰 조건을 최적화하는 것이 좋습니다.

변형된 박테리아 세포를 King's B Agar 플레이트의 표면에 부드럽게 펴 바릅니다. 그런 다음 섭씨 28도에서 이틀 동안 플레이트를 배양합니다. 그 후, 하나의 박테리아 콜로니를 King's B 액체 배지에 벡터에 적합한 항생제를 접종합니다.

섭씨 28도에서 200rpm으로 흔들면서 밤새 배양합니다. 다음날, 접종된 배지에 오토클레이브 글리세롤을 최종 농도 50%로 첨가하고 섭씨 마이너스 80도에서 보관합니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101 세포로 변환합니다.

보충된 LB 한천 배지에서 2일 동안 섭씨 28도에서 세포를 성장시킵니다. LB 한천 배지의 단일 콜로니를 사용하여 5ml의 보충된 액체 LB 배지를 접종합니다. 그런 다음 섭씨 28도에서 200rpm으로 흔들면서 밤새 세포를 성장시킵니다.

그 후, 3000G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상층액을 붓고 펠릿을 갓 만든 침투 완충액 1ml에 다시 현탁시킵니다. 분광 광도계를 사용하여 600나노미터의 흡광도에서 광학 밀도 값을 측정하여 Agrobacterium 세포의 수량을 측정합니다.

그런 다음 침투 버퍼를 사용하여 박테리아 세포의 OD 600을 0.5로 조정합니다. 배양물을 부드러운 로커에 담아 실온에서 1-5시간 동안 그대로 둡니다. 잎에 침투하려면 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 잎 중앙에 구멍을 뚫습니다.

바늘 없는 1ml 주사기를 사용하여 500마이크로리터의 Agrobacterium 현탁액을 잎의 인접 면에 조심스럽게 주입합니다. 잎에 남아 있는 박테리아 현탁액을 닦아내고 침투 부위의 경계를 표시합니다. 침투한 식물을 섭씨 25도, 습도 60%의 생장실에 이틀 동안 보관합니다.

글리세롤 스톡에서 변형된 슈도모나스 균주를 적절한 항생제를 사용하여 King's B Agar 배지에 줄무늬를 만듭니다. 섭씨 28도에서 이틀 동안 배양합니다. 슈도모나스 세포의 루프를 만니톨 글루타메이트 액상 배지에 접종합니다.

섭씨 28도에서 200rpm으로 흔들면서 밤새 배양물을 배양합니다. 그 후, 3000G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상등액을 붓고 펠릿을 10 밀리 몰 염화 마그네슘 용액에 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 Nicotiana benthamiana 잎의 경우 광학 밀도를 0.02로, 애기장대 잎의 경우 0.002로 조정합니다. 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 잎의 경우, 이틀 전에 아그로박테리움(Agrobacterium)이 침투한 것과 같은 부위에 슈도모나스 현탁액을 침투시킵니다. 형질전환 애기장대(Arabidopsis)의 경우, 슈도모나스(Pseudomonas) 현탁액을 4주 된 낮에 자란 짧은 잎 두 개에 침투시킵니다.

마지막으로, 슈도모나스(Pseudomonas)가 접종된 잎을 위해 잎 디스크를 잘라냅니다. 슈도모나스(Pseudomonas)에 침투한 후 특정 시점에 컨포칼 레이저 스캐닝 시스템을 사용하여 단일 식물에서 두 개의 평방 센티미터 잎 디스크를 이미지화합니다. 상처로 인해 죽은 세포가 죽지 않도록 침투 구멍에서 멀리 떨어진 세포를 관찰하십시오.

박테리아로부터 전위된 효과기는 매우 적은 양으로만 존재합니다. 따라서 레이저 출력을 높이고 형광 방출을 얻어 형광 신호를 감지할 수 있습니다. 그러나 식물 세포의 자가형광으로 인한 잘못된 신호를 포착하지 않기 위해 과도하게 압도하지 마십시오.

이 연구에서는 형광 단백질 기반 접근 방식을 사용하여 박테리아가 숙주 세포로 분비하는 효과기를 모니터링합니다. 감염 후 3시간 후에 Nicotiana benthamiana 잎에 대한 컨포칼 레이저 스캔이 여기에 표시됩니다. AvrB만으로 최적화된 sfGFP를 발현하는 세포는 형광 신호를 나타내지 않습니다.

그러나 AvrB, sfGFP11을 포함하는 감염된 세포에서 GFP 신호가 관찰됩니다. 이를 통해 AvrB sfGFP11 복합체가 세포질에서 최적화된 sfGFP로 재구성된 후 원형질막으로 전위되는 것을 확인할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 식물 재료를 건강하게 유지하고 활성 세포를 위한 새로운 박테리아 배양을 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 수지 혈액 분석과 같은 다른 방법을 사용하여 식물 면역 반응 중 식물 세포에서 박테리아 효과기 단백질의 잘못된 번역 변형을 이해할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 감염된 식물 세포에서 III형 효과기 전달을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 식물 재료 및 박테리아 배양물은 생물학적 유해 폐기물에 대한 실험실의 기준에 따라 폐기해야 하며 PPE를 착용하는 것을 잊지 마십시오.