Name: 녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 배우세요 분할 슈퍼폴더 GFP 시스템을 이용하여 세균 이펙터를 식물 세포에서 시각화하는 방법을. Nicotiana benthamiana와 Arabidopsis thaliana를 사용하여 식물-미생물 상호작용을 연구하고 병원성 세균의 분비 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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이 연구는 기초 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 사역의 과학, ICT 및 향후 계획 (NRF-2018R1A2A1A05019892) dc 및 식물 분자 번 식 센터 (에서 교부 금에 의해 투자에 의해 지원 되었다 PMBC) 에피소드를 농촌 개발 관리 (PJ013201)의 다음 세대 Biogreen 21 프로그램의 우리 confocal 현미경 촬영을 제공 하기 위해 환경 관리에 대 한 국립 계측 센터의 이미징 센터를 감사 합니다.

참고: 모든 단계는 수행 실 온에서 달리 명시 하지 않는 한.
1. 식물 재료 (4 주)의 준비
<ol><li>명. benthamiana 식물에 대 한 준비<ol>
<li>명. benthamiana 의 각 냄비의 토양 표면에 2 씨앗을 뿌리 다, 플라스틱 돔 트레이 커버 및 25 ° C, 16/8-h 명암 photoperiod 사이클 60% 습도 성장 챔버에에서 발 아를 씨를 허용.</li>
		<li>2 주 후, 선택 하 고 각 냄비에 작은 경종을 폐기 단계 1.1.1에서에서 발 아에 대 한 적용 동일한 성장 조건 하에서 식물 성장을 계속. 매 2 일 트레이 당 물 1 리터를 추가 합니다. 참고: 식물의 성장 조건 실험실에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 건강 한 상태에 있는 식물을 성장 하는 일반 급수 프로토콜을 따릅니다.</li>
		<li>일주일에 새로운 용지함에 식물을 전송 하 고 추가 성장 위한 충분 한 공간이 그들을 주선. 계속 그들은 나이의 4 주에 침투 될 준비가 될 때까지 단계 1.1.1에서에서 설명한 조건 하에서 식물 성장. 참고: 식물 성장 연구소에서 성장 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로, 우리는 그 4 주 된 찾을 명. benthamiana 식물 약 6 잎 곰.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A. thaliana 유전자 변형 식물에 대 한 준비<ol>
<li>테이블의 자료 를 참조 하 고 유전자 변형 애기 씨앗 주문.</li>
		<li>1 mL의 증류수에 50-100 유전자 변형 애기 씨를 담근 다 고 발 아의 발병을 동기화를 어둠 속에서 3 일 동안 4 ° C에서 그들을 저장 합니다.</li>
		<li>플라스틱 돔 트레이 커버와 플러그 공장 트레이의 토양 표면에 2 ~ 3 씨를 뿌리 다. 23 ° C, 10/14-h 명암 photoperiod 사이클 60% 습도에서 발 아 씨앗을 허용 합니다. 참고: 씨앗 homozygotes 이어야 한다입니다. 그러나, 일괄 처리에 있는 transgene의 존재를 재확인 하는 것이 좋습니다. 이 경우에, 2 분, 표 백제 50% 70% 에탄올으로 세척 하 여 씨앗을 소독 (약 2% 차 아 염소 산) 5-6 시간 살 균 두 배 증류수 (ddH2O)로 세척 하 여 5 분에 대 한 triton X-100 따라 0.05%를 포함 하. 살 균 후 4 ° C에서 3 일 동안 충 하 고 유전자 변형 식물 선택 hygromycin B의 25 µ g/L를 포함 하는 식물 발 아 미디어에 접시.</li>
		<li>주 후에, 플러그 당 하나의 공장 두고 단계 1.2.3 사용 동일한 성장 조건 하에서 식물 성장을 계속. 참고: 4 주 오래 된 식물 P. syringae 감염을 위해 사용 되었다. 물 식물 매일 식물의 건강을 유지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 모나 스 문화 (~ 1 주)의 준비
<ol><li>모나 스 변환에 대 한 플라스 미드의 건설<ol>
<li>테이블의 자료 를 참조 하 고 이펙터 T3SS 기반 배달 시스템 벡터25의 원하는 vector(s)를 주문.</li>
		<li>사이트별 재결합25복제를 사용 하 여 이펙터 배달 벡터에 관심의 이펙터 유전자를 삽입 합니다. 참고: 전체 길이 effector 단백질의 subcellular 지 방화, 모니터링 넣어에 전장 유전자 pBK-GW-1-2 또는 pBG-GW-1-2. 그것은 또한 pBK-GW-1-4를 선택할 수 또는 pBG-GW-1-4 포함 된 2에 대 한 x sfGFP11 증가 형광 신호. 신호 펩 티 드 부족 부분 이펙터, 경우 pBK-GW-2-2 또는 pBK-GW-2-4를 사용 합니다. 공원 외. 이펙터 배달 벡터25에 대 한 자세한 내용은 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>P. syringae pv sfGFP11 태그를 융합 하는 이펙터를 들고 플라스 미드를 변환. 토마토 (태평양 표준시) CUCPB5500 표준 electroporation29를 사용 하 여. 참고: 필요한 경우 다른 녹 종자를 사용할 수 있습니다. SfGFP11 태그 시스템은 벡터30 의 광범위 한 범위에 대 한 구성 하 고 있는 이펙터의 유전자 발현 비교와 함께, 예를 들어, 슈 도모 나 스 fluorescens (이 단)31AvrRpm1 발기인에 의해 규제 됩니다.</li>
	<li>임금의 B 한 천 배지 100 µ g/mL 리 팜 피신과 25 µ g/mL 대 또는 25 µ g/mL gentamycin 포함의 표면 변형 된 세균성 세포를 부드럽게 확산. 2 일 동안에 28 ° C를 품 어.</li>
	<li>킹의 B 액체 미디어 사용, 벡터에 대 한 적절 한 항생제로 한 식민지를 접종 하 고 200 rpm에서 떨고와 28 ° C에서 하룻밤 세포 성장.</li>
	<li>글리세롤 재고를 확인 합니다. 50%-80 ° c.에 게의 최종 농도에 압력가 글리세롤을 추가</li>
</ol>3. 과도 식 세포 기관이 대상 sfGFP1-10선택 북 아 일 benthamiana (4 일)에서
<ol><li>Agrobacterium 문화의 준비<ol>
<li>주문 sfGFP1-10선택 plasmid(s) 세포 기관이 대상의 원하는 vector(s) ( 테이블의 자료를 참조).</li>
		<li>plasmid(s) Agrobacterium tumefaciens 스트레인 GV3101 셀32변환. 2 일 동안 50 µ g/mL 대와 28 ° C에서 50 µ g/mL 리 팜 피신 보충 Luria Bertani (파운드) 한 천 매체에 세포 성장.</li>
		<li>파운드 한 천 매체에 단 하나 식민지에서 50 µ g/mL 대와 50 µ g/mL 리 팜 피신 보충 액체 LB 미디어의 5 mL로 세포를 접종. 200 rpm에서 떨고와 28 ° C에서 하룻밤 세포 성장.</li>
		<li>10 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리 하 여 세포 표면에 뜨는 미디어에서 부와 갓의 1 mL에 펠 릿을 resuspend 수확이 했다 침투 버퍼를.</li>
		<li>600의 흡 광도에서 광학 밀도 (OD) 값을 얻어서 Agrobacterium 의 수량을 측정 nm (Abs 600 nm). 0.5 침투 버퍼와 함께 박테리아의 세600 조정 합니다. 참고: 서 스 펜 션의 1 mL 두 개의 관광 명소에 침투 하기 충분 하다.</li>
		<li>실 온에서 문화를 침투 하기 전에 1-5 h에 대 한 부드러운 로커에 둡니다.</li>
		<li>10 µ L 팁으로 침투 하는 나뭇잎의 중심에 구멍을 찌른. 1 mL needleless 주사기를 사용 하 여 침투 Agrobacterium 정지. 신중 하 고 천천히 주사 약 500 µ L 주사기를 통해 잎 adaxial 측면에 3.1.5 단계에서 준비 하는 정지의. 실험적인 복제에 대 한 적어도 3 개의 다른 식물에 침투를 반복 합니다. 참고: 건강과 안전 이유를 위해 눈 보호 침투 동안 착용 되어야 한다.</li>
		<li>잎에 남아 있는 세균 현 탁 액 떨어져 닦 고 침투 지역의 경계를 표시.</li>
		<li>2 일 동안 단계 1.1.1 사용 동일한 성장 조건 하에서 침투 식물 유지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 접종의 모나 스 (4 일)
<ol><li>2 일 동안 28 ° C에 적절 한 항생제와 킹의 B 천 미디어에 2.5 단계에서 글리세롤 재고에서 행진 변형된 녹 스트레인. 참고: 녹 의 건강이 매우 중요 합니다. 식민지를 잘 형성 하지 않는다, 세포를 다시 행진 또는 진행 하기 전에 임금의 액체 매체에 있는 셀을 전파.</li>
	<li>마 니 톨 조미료 (MG) 액체 미디어 28 ° C에서 하룻밤을 위해 200 rpm에서 떨고 있는 녹 셀의 loopful 접종</li>
	<li>수확 10 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리에 의해 셀 부 표면에 뜨는 미디어 어 펠 릿 10 mm MgCl2, resuspend 고 명 benthamiana 잎 및 0.002 (1 x 106 세600 0.02 (1 x 107 cfu/mL)을 조정 cfu/mL) 애기 단풍. 에 대 한
</li>
	<li>명. benthamiana에 대 한 녹 서 스 펜 션 sfGFP1-10선택 구문을 들고 Agrobacterium 이전 (3.1.7 단계)에서 2 일을 침투 했다 잎의 영역으로 침투. sfGFP1-10선택 유전자 변형 애기, 대 두 4 주 오래 된 짧은 하루 성장 잎으로 녹 서 스 펜 션에 침투. 참고: 적어도 3 개의 식물 실험 복제 필요 합니다.</li>
</ol>5. sfGFP 신호 Confocal 현미경 검사 법 (1 일)을 통해 관찰
<ol><li>녹에서 잎 디스크 잘라-잎을 주사. 모나 스의 침투 후 특정 시간 점에, 40 X confocal 시스템 스캐닝 레이저를 사용 하 여 단일 공장에서 두 개의 2 cm2 잎 디스크 이미지 / 1.2 나 C-Apochromat 물 침수 목표 또는 63 / 0.8 X 나 C-Apochromat 기름 침수 목적입니다. 부상에 의해 살해 하는 죽은 세포를 방지 하려면 침투 구멍에서 세포를 관찰 합니다.</li>
	<li>488 nm 아르곤 레이저의 저전력 설정에서 관측을 시작 합니다. 레이저 파워 sfGFP 탐지를 증가. 참고: 우리가 일반적으로 형광 신호를 찾으려면를 레이저 강도의 2-15%를 사용 합니다. 그러나, 레이저 파워와 검색 설정을 조정 해야 사용자의 현미경 시스템에 따라. 여기, 방출 필터 520-550 nm로 설정 했다. 죽은 세포는 종종 488 nm 레이저 여기 아래 자동-형광 방출. 따라서, 부정적인 컨트롤 sfGFP11 태그를 하지 않고 같은 이펙터 침투 하 고 동일한 관측 조건 하에서 관찰 될 해야 합니다. 또한, 높은 레이저 여기 엽록소 autofluorescence를 유도할 수 있다. 따라서 엽록소 autofluorescence 유도를 하지 않도록 제어 식물 세포를 사용 하 여 레이저 강도 조정 합니다.<ol>
<li>세포 벽의 counterstaining에 대 한 리프 디스크 관찰 전에 5-10 분에 20 m m propidium 요오드 화물 (PI)을 침투.</li>
		<li>얼룩이 핵에 대 일 분 뒤에 물으로 세척 하 여 0.1 %paraformaldehyde 리프 디스크 잠수함. 그런 다음, 10mm, PI 리프 디스크 현미경 관찰 하기 전에 5-10 분에 침투. 실험 3 번 이상 반복 합니다. 참고:이 단계는 아닙니다 중요 하지만 원형질 막 또는 핵에 이펙터 지역화를 정의 하는 데 도움이. 관심의 이펙터에 특정 세포 기관이 그들의 지역화 면, 주어진된 세포 기관이 대 한 마커를 사용 하 여는 이펙터의 지역화를 확인.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

여기에 설명 된 프로토콜 모니터링 호스트 식물 세포 감염 시 세균 T3SS에 의해 주입 하는 effector 단백질의 정확한 지역화에 사용 됩니다. 이전, 분할 GFP 시스템 포유류 단백질23,36의 subcellular 지 방화, 살 모 넬 라 T3E 지역화, Agrobacterium VirE2 납품에 T4SS 통해 공부 하는 도구로 사용 되었다는 식물 세포37. 식물 세포에서이 시스템을 적용, 이전 연구 유전자 변형 옥수수 식물을 constitutively 세포질 GFP1-10과 유전자 변형 균, 표현 Ustilago maydis, GFP11 태그 effector 단백질을 표현 하는 사용. 그러나, 옥수수-미국 maydis 시스템 되지 않았습니다 성공적인 translocated effector 단백질 식 수준의 약한...

식물은 수많은 침입 병원 체 포함 박테리아, 곰 팡이, 바이러스, 곤충 및 nematodes 그들의 수명 주기 동안 발생 하는 착 유기 체. Phytopathogens, 중 녹 종 등 Ralstonia 종, 그램 음성 세균성 병원 체 상처 또는 stomata 및 hydathode 같은 자연 구멍을 통해 입력 하 여 그들의 호스트 식물을 감염1. 성공적으로 호스트 식물 식민지로 세균성 병원 균 독성 요인2의 다양 한 개발을 진화 했다. 박테리아는 기 주 식물을 침공, 그들은 일련의 독성 단백질 주사-이펙터로 알려진-그들의 pathogenicity 홍보를 식물 세포에 직접. 이 이펙터 억제 또는 공장 타고 난 면역을 조절 하 고 세균 생존3결과 호스트 세포 프로세스를 조작.
병원 성 박테리아는 주로 호스트 셀4에 직접 효과 기 단백질을 제공 하는 T3SS를 사용 합니다. T3SS는 호스트 셀5의 사출 사이트 내부와 외부 세균 막 비 계 단백질 구조에서 연결 바늘 같은 채널 분자 주사기를 유사 합니다. 이 이펙터 T3SS 중재 (T3E) 분 비 메커니즘은 인간 뿐만 아니라 식물의 다양 한 그램 음성 세균성 병원 체에 잘 보존. 대표적인 식물 병원 체, P. syringae pv 중 하나입니다. 토마토 DC3000 hrcC 돌연변이 일반적으로 결함이 있는 T3SS 완전히 억제 식물 면역 (effector 단백질을 주입)에 의해6에이 돌연변이의 무 능력으로 인해 식물에 성장을 제한 했다. 호스트 세포로 전, 시 이펙터 대상 다양 한 호스트 단백질 등 식물 방위 응답, 유전자 전사, 세포 죽음, 프로테아좀, 소포 매매, 호르몬 경로7 호스트 셀 시스템에 대 한 중요 한 , 8 , 9 , 10. 따라서, 추적 호스트 셀에 effector 단백질의 세포질 지 방화의 식물 면역의 변조에 관하여 그들의 기능을 이해 하는 매력적인 대상 이다.
T3Es의 지역화 연구의 대부분 Agrobacterium-중재 overexpression 호스트 식물9큰 형광 단백질으로 고용 했다. 그러나, 다른 종에 도입 된 유전자의 분리 식 방법 잘못 지역화 된 또는 때때로 작동 하지11,,1213되도록 표시 되었습니다. 또한, 여러 연구 결과 세균성 이펙터는 호스트 셀14,15,,1617에서 적절 한 대상에 대 한 수정 받을 밝혔다. 따라서, 세포 기능 또는 양적 이펙터 병원 체 감염18시 T3SS에 의해 전달 되는 동일 하지 않을 수 있습니다 식물의 cytosol에서 이펙터 뚜렷이 표현. 또한, 대형 형광 태그 effector 단백질의 융합 적절 한 이펙터 배달 및 시각화18,19중단 될 수 있습니다. 따라서, T3E 함수 분석에이 접근 T3SS 분 비 이펙터의 네이티브 지역화를 완벽 하 게 반영 되지 않을 수 있습니다.
녹색 형광 단백질 (GFP)20발 색 단 포함 하는 중앙 물가 포함 하는 11-배가 좌초 하는 β-배럴의 구성 됩니다. Waldo 외. 작은 부품으로 구성 된 새로운 분할-GFP 시스템을 보고 (GFP β 물가 11; GFP11)와 대형 보완 조각 (GFP β 물가 1-10; GFP1-10)21. 조각을 스스로 형광 하지 않습니다 하지만 두 조각을 서로 가까운 근접에 있을 때 그들의 자기 협회에 형광. 단백질 접히는 효율성의 최적화에 대 한 강력한 접는 변종 GFP, 즉, sfGFP 및 sfGFP선택, 이후에 분할 GFP 시스템20,,2122개발 되었다. 최근, 단일 아미노산 돌연변이 sfGFP1-10선택-sfYFP1-10선택 및 sfCFP1-10선택-을 각각 sfGFP11 조각와 쇼 노란색과 청록색 형광 reconstitute 수, 생성 된23의 변형 . 또한, sfCherry, mCherry의 파생 분열 될 수 있다 sfGFP23와 같은 방식으로 sfCherry11와 sfCherry1-10 조각으로.
이 시스템은 고 살 모 넬 라24. 에서 이펙터를 사용 하 여 감염 동안 추적 하는 HeLa 세포에서 T3SS 이펙터에 맞게 되었습니다. 그러나, 그것은 이전 하지 최적화 호스트 식물 세균성 병원 체 시스템에 대 한. 최근에, 우리는 식물 세포25에 P. syringae 에서 전달 하는 T3Es의 subcellular 지 방화를 모니터링 하는 데 향상 된 sfGFP1-10선택 에 따라 분할 GFP 시스템 최적화. 식물 세포, 유전자 변형 애기 thaliana 집합에에서 다른 subcellular 구획을 T3Es의 지역화 연구를 촉진 하기 위하여 식물 다양 한 subcellular 구획 에서에서 sfGFP1-10OPT 를 표현 하기 위해 생성 된 25. 또한, 다양 한을 운반 하는 플라스 미드 세포 기관이 대상 sfGFP1-10선택 Agrobacterium에 대 한-중재 과도 overexpression 이펙터 T3SS 기반 배달에 대 한 sfGFP11 태그 벡터 또한 생성 했다. 다양 한 유전자 변형 애기 라인과 관심의 T3Es을 표현 하는 플라스 미드의 씨앗 테이블의 자료26,27에서 언급 한 소스에서 얻을 수 있습니다.
다음 프로토콜에서 우리는 분할 sfGFP 시스템을 사용 하 여 호스트 세포에 박테리아에 의해 전달 하는 이펙터의 역학을 모니터링 하는 최적화 된 시스템을 설명 합니다. SfGFP1-10선택 유전자 변형 녹 sfGFP11 재조합 플라스 미드를 들고와 표현 하는 식물의 감염 호스트 셀으로 모나 스 에서 sfGFP11 태그 이펙터의 전달 결과. 따라서, 이러한 단백질 재구성 되 고 특정 이펙터 대상 compartment(s)에 이동. 슈 도모 나 스 syringae pv입니다. 토마토 18 이펙터 삭제 됩니다, CUCPB5500 스트레인이이 스트레인 A. thaliana 및 북 아 일 benthamianas28에 낮은 또는 없음 세포 죽음을 보여주 때문에 사용 되었다. 그러나, 모든 자료와 여기에 설명 된 단계 교체 수 있습니다 또는 다른 생물학 질문 또는 지정 된 실험실 조건에서 최적화의 조사를 위해 분할 sfGFP 시스템에 맞게 수정.

<table><tbody><tr><td>Arabidopsis 형질전환 계통</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 효과기의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69831</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69832</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69833</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69834</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69835</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69836</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69837</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69838</td><td></td></tr><tr><td>Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 효과기의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97387</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97388</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97389</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97390</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97391</td> ER-sfGFP1-10 Addgene 97392 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97393</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97394</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfCherry1-10</td><td>Addgene</td><td>97403</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfYFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97404</td><td></td></tr><tr><td>CYTO-sfCFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97405</td><td></td></tr><tr><td>sfGFP11 태그가 지정된 T3SS 기반 이펙터 전달 시스템용 Gateway 호환 벡터</td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 효과기의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pBK-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98250</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; 카나마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)</td></tr> <tr><td>pBK-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98251</td><td>pAvrRpm1 : GW : HA-2xsfGFP11 : AvrRpm1t; Kanamycin (25 ug/ml)에 저항하는</td></tr> <tr><td>pBK-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98252</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; 카나마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)</td></tr> <tr><td>pBK-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98253</td><td>pAvrRpm1 : AvrRPM1sp : GW : HA-2xsfGFP11 : AvrRpm1t; 카나마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)</td></tr> <tr><td>pBG-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98254</td><td>pAvrRpm1 : GW : HA-sfGFP11 : AvrRpm1t; 겐타마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)</td></tr> <tr><td>pBG-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98255</td><td>pAvrRpm1 : GW : HA-2xsfGFP11 : AvrRpm1t; 겐타마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)</td></tr> <tr><td>pBG-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98256</td><td>pAvrRpm1 : AvrRPM1sp : GW : HA-sfGFP11 : AvrRpm1t; 겐타마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)</td></tr> <tr><td>pBG-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98257</td><td>pAvrRpm1 : AvrRPM1sp : GW : HA-2xsfGFP11 : AvrRpm1t; Gentamycin (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>Bacterial strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens GV3101</td><td></td><td></td><td>Csaba Koncz 및 Jeff Schell에 대한 내성, TL-DNA gene 5의 promoter는 새로운 유형의 Agrobacterium binary vector에 의해 운반되는 chimaeric 유전자의 조직 특이적 발현을 제어합니다. 몰 젠 유전자. 204,383-396 (1986); 겐타마이신(50 ug/ml) 및 리팜피신(50 ug/ml)에 대한 내성</td></tr><tr><td>Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500</td><td></td><td></td><td>Kvitko, B. H. et al. Pseudomonas syringae pv. 토마토 DC3000 유형 III 분비 효과기 유전자의 레퍼토리에서 결실은 효과기 간의 기능적 중복을 나타냅니다. PLoS 병원. 5 (4) (2009).; 리팜피신에 대한 내성 (100 ug / ml)</td></tr> <tr><td>< 강> 매체 구성 요소 < / 강력 ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< > 식물 발아 배지 < / 강력 ></td><td></td><td></td> <td>2.165g / L Murashige & 추가 Skoog 분말, 물에 10 g/L 자당. pH 5.8로 조정하고 2.2g/L 피타젤을 추가합니다. 자동 가속.</td></tr><tr><td>무라시게 & 비타민을 포함한 Skoog 배지</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td>4 >C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>설탕</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>LB media</td><td></td><td></td><td>10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물, 10 g/L NaCl을 물에 첨가합니다. 고체 매체의 경우 15g/L 마이크로 한천을 추가합니다. 오토클레이브.&nbsp; 용액을 55°C로 식히십시오. C를 선택하고 필요한 경우 항생제를 추가합니다.</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>BD Bioscience</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520</td><td></td></tr><tr><td>Micro 한천</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>King's B media</td><td></td><td></td><td>10 g/L 프로테아제 펩톤 #2, 1.5 g/L 무수 K2HPO4, 15 g/L의 한천을 물에 넣습니다. 오토 클레이 브. 55도로 식히십시오. C를 선택하고 멸균 15ml/L 글리세롤, 5ml/L MgSO4를 배지에 첨가합니다. 필요한 경우 항생제를 추가하십시오.</td></tr><tr><td>프로테오스 펩톤</td><td>BD Bioscience</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>무수 K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551128 USP</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Bioscience</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td><강>만니톨-글루타메이트(MG) 액체 배지 </강력></td><td></td><td></td>만<td>니톨 10g/L, L-글루탐산 2g/L, KH2PO4 0.2g/L, NaCl 0.2g/L<><>를 물에 첨가합니다. pH 7</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0803</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0707</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>침투 완충액</td><td></td><td></td><td>10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 &micro; M 아세토시링곤. 산도 5.6; 사용하기 전에 새 버퍼를 준비하십시오.</td></tr><tr><td>MES</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td>물에 100mM(pH 5.6) 스톡을 준비합니다. 필터는 살균합니다.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>물에 100mM 스톡을 준비합니다. 오토 클레이 브.</td></tr><tr><td>아세토시링곤</td><td>시그마-알드리치(Acetosyringone Sigma-Aldrich</td><td>) D134406</td><td>DMSO에서 150mM 스톡을 준비합니다.</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 장비/재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>710 레이저 스캐닝 컨포칼 시스템</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio observer Z1 도립 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>ThermoFisher</td><td>P1304MP</td><td></td></tr></tbody></table>

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

박테리아, 다양 한 식물 질병의 원인이 되는 가장 중요 한 에이전트 중 하나는 호스트 식물 세포 식물 면역 체계를 파괴에 effector 단백질의 집합을 분 비. 감염 시 세포질 이펙터 유형 III 분 비 시스템 (T3SS)를 통해 호스트 cytosol에 전달 됩니다. 식물 세포에 배달, 후에 effector(s) 생존 및 병원 체의 복제에 대 한 호스트 세포 프로세스를 변조 하는 것 특정 compartment(s) 대상. 비록 pathogenicity에 형광 단백질을 사용 하 여 그들의 기능을 이해 하는 호스트 셀에 effector 단백질의 subcellular 지역화의 박테리아에서 직접 주입 하는 이펙터의 역학 조사에서 일부 연구 하고있다 T3SS와 형광 단백질 간의 비 호환성으로 인해 도전 하고있다.
여기, 우리가 호스트 셀에서 세균 T3SS 통해 전달 하는 이펙터의 지역화를 시각화 하기 위해 최적화 된 분할 superfolder 녹색 형광 단백질 시스템 (sfGFPOPT)의 최근 우리의 방법을 설명 합니다. sfGFP11 (11번째 β 물가의 sfGFP)-태그 이펙터는 T3SS을 통해 분 비 사이트에서 형광 방출에 표적으로 하는 특정 세포 기관이 sfGFP1-10선택 (1-10번째 β 물가의 sfGFP) 행간 조립 될 수 있다. 이 프로토콜 애기 Nicotiana benthamiana 식물에 특정 세포 기관이에 슈 도모 나 스 syringae 에서 effector 단백질으로 재구성된 sfGFP 형광 신호를 시각화 하는 절차를 제공 합니다.

GFP의 β 배럴 구조 11 β 물가의 구성 이며, 두 조각, 1-10번째 가닥 (GFP1-10선택)와 11일 (GFP11) 가닥으로 나눌 수 있습니다. 비록 둘 다 2 개의 파편 스스로 형광의 자기 조립된 sfGFP 근접 (그림 1A)에 존재 하는 2 개의 파편 때 형광을 내보낼 수 있습니다. 이 시스템에서는, sfGFP1-10선택-식물 녹 sfGFP11 태그 이펙터를 들고와 주사는 애기 명. benthamiana 를 표현. 호스트 셀의 cytosol로 모나 스 에 의해 전달 sfGFP11 태그 이펙터는 cytosol에서 표현 sfGFP1 10OPT 를 재구성 하 고 대상 구획 (그림 1B)에 함께 이동...

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

이 방법은 병원성 박테리아가 식물 세포에 분비되는 효과기라는 단백질을 사용하여 숙주 식물 세포의 최적 상태를 방해할 수 있는 방법과 같은 식물-미생물 상호 작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 박테리아 효과기 단백질이 본래 발현 시스템을 사용하여 박테리아 세포에서 발현된 다음 박테리아 유형 III 분비 시스템을 통해 식물 세포로 전달된다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Nicotiana benthamiana 및 Arabidopsis thaliana 식물을 준비합니다.다음으로, 표준 전기천공법을 사용하여 sfGFP11 태그에 융합된 플라스미드 운반 및 효과기 유전자를 Pseudomonas syringae pathovar tomato CUCPB5500 균주로 변환합니다. 최적의 시점과 발현 수준 또는 sfGFP의 재구성은 실제로 effector 단백질에 따라 다릅니다. 접종 또는 관찰 조건을 최적화하는 것이 좋습니다.변형된 박테리아 세포를 King's B Agar 플레이트의 표면에 부드럽게 펴 바릅니다. 그런 다음 섭씨 28도에서 이틀 동안 플레이트를 배양합니다. 그 후, 하나의 박테리아 콜로니를 King's B 액체 배지에 벡터에 적합한 항생제를 접종합니다.섭씨 28도에서 200rpm으로 흔들면서 밤새 배양합니다. 다음날, 접종된 배지에 오토클레이브 글리세롤을 최종 농도 50%로 첨가하고 섭씨 마이너스 80도에서 보관합니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101 세포로 변환합니다.보충된 LB 한천 배지에서 2일 동안 섭씨 28도에서 세포를 성장시킵니다. LB 한천 배지의 단일 콜로니를 사용하여 5ml의 보충된 액체 LB 배지를 접종합니다. 그런 다음 섭씨 28도에서 200rpm으로 흔들면서 밤새 세포를 성장시킵니다.그 후, 3000G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상층액을 붓고 펠릿을 갓 만든 침투 완충액 1ml에 다시 현탁시킵니다. 분광 광도계를 사용하여 600나노미터의 흡광도에서 광학 밀도 값을 측정하여 Agrobacterium 세포의 수량을 측정합니다.그런 다음 침투 버퍼를 사용하여 박테리아 세포의 OD 600을 0.5로 조정합니다. 배양물을 부드러운 로커에 담아 실온에서 1-5시간 동안 그대로 둡니다. 잎에 침투하려면 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 잎 중앙에 구멍을 뚫습니다.바늘 없는 1ml 주사기를 사용하여 500마이크로리터의 Agrobacterium 현탁액을 잎의 인접 면에 조심스럽게 주입합니다. 잎에 남아 있는 박테리아 현탁액을 닦아내고 침투 부위의 경계를 표시합니다. 침투한 식물을 섭씨 25도, 습도 60%의 생장실에 이틀 동안 보관합니다.글리세롤 스톡에서 변형된 슈도모나스 균주를 적절한 항생제를 사용하여 King's B Agar 배지에 줄무늬를 만듭니다. 섭씨 28도에서 이틀 동안 배양합니다. 슈도모나스 세포의 루프를 만니톨 글루타메이트 액상 배지에 접종합니다.섭씨 28도에서 200rpm으로 흔들면서 밤새 배양물을 배양합니다. 그 후, 3000G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상등액을 붓고 펠릿을 10 밀리 몰 염화 마그네슘 용액에 다시 현탁시킵니다.그런 다음 Nicotiana benthamiana 잎의 경우 광학 밀도를 0.02로, 애기장대 잎의 경우 0.002로 조정합니다. 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 잎의 경우, 이틀 전에 아그로박테리움(Agrobacterium)이 침투한 것과 같은 부위에 슈도모나스 현탁액을 침투시킵니다. 형질전환 애기장대(Arabidopsis)의 경우, 슈도모나스(Pseudomonas) 현탁액을 4주 된 낮에 자란 짧은 잎 두 개에 침투시킵니다.마지막으로, 슈도모나스(Pseudomonas)가 접종된 잎을 위해 잎 디스크를 잘라냅니다. 슈도모나스(Pseudomonas)에 침투한 후 특정 시점에 컨포칼 레이저 스캐닝 시스템을 사용하여 단일 식물에서 두 개의 평방 센티미터 잎 디스크를 이미지화합니다. 상처로 인해 죽은 세포가 죽지 않도록 침투 구멍에서 멀리 떨어진 세포를 관찰하십시오.박테리아로부터 전위된 효과기는 매우 적은 양으로만 존재합니다. 따라서 레이저 출력을 높이고 형광 방출을 얻어 형광 신호를 감지할 수 있습니다. 그러나 식물 세포의 자가형광으로 인한 잘못된 신호를 포착하지 않기 위해 과도하게 압도하지 마십시오.이 연구에서는 형광 단백질 기반 접근 방식을 사용하여 박테리아가 숙주 세포로 분비하는 효과기를 모니터링합니다. 감염 후 3시간 후에 Nicotiana benthamiana 잎에 대한 컨포칼 레이저 스캔이 여기에 표시됩니다. AvrB만으로 최적화된 sfGFP를 발현하는 세포는 형광 신호를 나타내지 않습니다.그러나 AvrB, sfGFP11을 포함하는 감염된 세포에서 GFP 신호가 관찰됩니다. 이를 통해 AvrB sfGFP11 복합체가 세포질에서 최적화된 sfGFP로 재구성된 후 원형질막으로 전위되는 것을 확인할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 식물 재료를 건강하게 유지하고 활성 세포를 위한 새로운 박테리아 배양을 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 수지 혈액 분석과 같은 다른 방법을 사용하여 식물 면역 반응 중 식물 세포에서 박테리아 효과기 단백질의 잘못된 번역 변형을 이해할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 감염된 식물 세포에서 III형 효과기 전달을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 식물 재료 및 박테리아 배양물은 생물학적 유해 폐기물에 대한 실험실의 기준에 따라 폐기해야 하며 PPE를 착용하는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Lee, H. et. al., 감염 중 박테리아로부터 전달되는 이펙터를 시각화하기 위한 녹색 형광 단백질 시스템 분할. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 공초점 현미경과 결합된 분할 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP) 상보를 사용하여 식물 세포에서 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 이 접근 방식을 통해 숙주 세포 세포질로의 이펙터 전좌를 정확하게 시각화할 수 있습니다.

식물 세포의 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달 모니터링

이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

Electroporation은 정제된 박테리아 독성 효과기 단백질을 살아있는 진핵 세포에 직접 삽입하는 데 사용되었습니다. 단백질 국소화는 컨포칼 면역형광 현미경으로 모니터링했습니다. 이 방법을 사용하면 활성 외인성 단백질을 사용하여 이동, 기능 및 단백질-단백질 상호 작용에 대한 연구를 수행할 수 있으므로 진핵 세포에서 이종 발현의 필요성을 피할 수 있습니다.

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

III형 분비 시스템을 통해 숙주 세포로 이펙터 전좌는 그람 음성 박테리아 사이에서 일반적인 독성 전략입니다. 전좌의 정량 분석을 위한 beta-lactamase effector fusion 기반 분석법을 적용했습니다. Yersinia에 감염된 세포에서 베타-락타마제에 의한 FRET 리포터의 전환은 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 모니터링됩니다.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

세균성 병원균과 호스트 사이의 상호 작용을 조사하는 것은 생물학적 연구의 중요한 영역입니다. 여기서는 BLAM 기판을 사용하여 siRNA의 유전자 사일런 동안 Coxiella burnetii에 의해 이펙터 전위를 측정하기 위해 필요한 기술들을 설명한다.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

여기, 우리 향상 된 녹색 형광 단백질 표현 대장균을 사용 하 여 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

여기에 설명 된 세포 수준에서 동물의 조직에서 세균 유전자 발현을 분석 하기 위한 방법이입니다. 이 메서드는 감염 동안 조직 환경에 대 한 응답에서 세균성 인구 내에서 발생 하는 phenotypic 다양성을 공부에 대 한 리소스를 제공 합니다.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

이 기사는 유전자 코드 확장(GCE) 부위 특이적 표지를 사용하여 살모넬라균 분비 이펙터에 라벨을 붙이고 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포 내 국소화를 이미지화하는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공합니다...

유전자 코드 확장을 이용한 박테리아 분비 단백질의 초고해상도 이미징

여기에서는 감염 중 병원성 박테리아를 장기 전체에서 검출하고 형광 리포터 활동을 정량화할 수 있는 절차에 대해 설명합니다.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

배우세요 분할 슈퍼폴더 GFP 시스템을 이용하여 세균 이펙터를 식물 세포에서 시각화하는 방법을. Nicotiana benthamiana와 Arabidopsis thaliana를 사용하여 식물-미생물 상호작용을 연구하고 병원성 세균의 분비 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

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