Name: 개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 학습하세요 4차원 광시트 형광 현미경법을 사용하여 제브라피심장의 전단 응력 효과를 시각화하는 방법을. 계산 알고리즘으로 심장을 재구성하고 선천성 심장질환 진단에 활용할 수 있습니다.

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저자는 인간을 제공 하기 위한 스탠포드 대학에서 윌리엄 탤벗에 감사를 표현 하 고 싶습니다 Nrg1 cDNA를 제공 하기 위한 UCSD에서 데보라 Yelon는 wea 돌연변이입니다. 저자 또한 이미지 수집 도와주 신 시아 첸을 감사 하 고 싶습니다. 이 연구 보조금 NIH HL118650 (T.K. Hsiai)에 의해 지원 되었다 (T.K. Hsiai)에 HL083015, HD069305 (하려면 노스캐롤라이나 치 T.K. Hsiai.), HL111437 (T.K. Hsiai 노스캐롤라이나 치)를, (T.K. Hsiai)에 HL129727, T32HL007895 (R.R. Sevag Packard)에, HL 134613 (V. Messerschmidt) 하 고 텍사스 시스템 별 자금 (현)의 대학.

우 타와 UCLA IACUC 프로토콜에 따라 다음 방법은 수행 했다. 이러한 실험적인 그룹 유전자 변형 Tg(cmlc2:gfp)와 함께 사용 되었다 wea (약한 아 트리 움) 나 clo (접속이) 돌연변이: (a) 야생-타입 (WT) 제어, (b) gata1a 미주리, 및 (c) tnnt2a 모 주사 (표 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>모델</td>
			<td>이름</td>
			<td>수정 된 유전자</td>
			<td>표현 형</td>
			<td>참조</td>
		</tr>
<tr>
<td>제어</td>
			<td>야생 타입</td>
			<td>없음</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Tg(cmlc2:gfp)</td>
			<td>심장 myosin 빛 사슬</td>
			<td>심근에서 구체적으로 표현 하는 그린 flourescence</td>
			<td>34</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">감소 벽 전단 응력</td>
			<td>약한 아 트리 움 (wea) 돌연변이</td>
			<td>아 트리 움 전용 myosin heacy 체인</td>
			<td>아 트리 움 계약 수, 심, 두꺼운 심근 벽, 좁은 루멘, dialated 아 트리 움, 소형</td>
			<td>37</td>
		</tr>
<tr>
<td>접속이 (clo) 돌연변이</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Endocardium, 작은 심 실, 존재 하지 않는 심장 cushins unaturally 큰 아 트리 움의 완전 한 제거</td>
			<td>41</td>
		</tr>
<tr>
<td>
gata1a 모</td>
			<td>
gata1a </td>
			<td>적혈구의 부족으로 빈 혈</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>
tnnt2a 모</td>
			<td>tnnt2a</td>
			<td></td>
			<td>39</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">증가 벽 전단 응력</td>
			<td>
EPO mRNA</td>
			<td>없음</td>
			<td>심한 존슨, 혈액 세포, 순환의 증가 점도 증가</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isoprotenerol</td>
			<td>없음</td>
			<td>심장 박동 증가</td>
			<td>7</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 제 브라 대 한 설명입니다. 정의 하 고 실험에 사용 된 Zebrafish의 설명입니다.
1. 연구 설치
<ol><li>Trabeculation 구조에 대 한 Nrg1 및 EPO mRNA를 준비 합니다.<ol>
<li>인간의 Nrg1 cDNA를 기증자 플라스 미드에서 증폭. 참고: 인간의 Nrg1 cDNA는 스탠포드 대학에서 윌리엄 Talbot에서 재능 했다.<ol>
<li>필요한 시 약 및 재료, 즉 PCR mastermix (-20 ° C에 저장), 뇌관 (참조 표 2) (-20 ° C에 저장)는 PCR 플레이트 (실내 온도에 저장), 그리고 20 μ 피 펫 (실내 온도에 저장)을 꺼내. 예를 들어 제품에 대 한 자료의 표 를 참조. <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57763/57763tbl2v2.jpg"> 표 2: 인간 Nrg1 복제를 위한 뇌관.
</li>
			<li>mastermix triplicate 20 μ 피 펫을 사용 하 여 설정 하는 각 뇌관을 위한 준비. Triplicates의 1 세트는 mastermix의 37.5 μ, DNA 무료 물 3 μ, 뇌관의 4.5 μ를 사용 하 여. 더 많은 triplicates에 대 한 샘플의 수로 곱하면 단순히.</li>
			<li>샘플 당 잘 당 총 10 μ 있다 그래야 DNA 무료 물 뇌관 지구에서 작업 솔루션 인간 Nrg1 cDNA (20 ng/μ g 농도)을 희석. 참고: 각 솔루션 단계 1.1.1 고르게 분포 되어 있는지 확인 합니다. 아래로 pipetting으로 각 솔루션을 혼합 하 여 이렇게 합니다. 교차 오염을 방지 하기 위해, 하나의 샘플에 대 한 하나의 피 펫 팁을 사용 합니다.</li>
			<li>약 수 10 μ 다중 채널 피 펫 PCR 접시에 원하는 웰 스와 Nrg1 cDNA.</li>
			<li>우물에서 cDNA를는 mastermix의 14.5 μ를 추가 합니다. 웰 스, 밀봉 하 고 PCR 기계를 PCR 접시에 스티커 덮개를 적용 합니다.</li>
			<li>PCR 기계를 시작 하 고 주기 효소와 뇌관 사용에 따라 적절 한 온도 도달 하면 확인 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>플라스 미드 pCS2에 Nrg1 cDNA를 클론+ 사용 하 여 초과 효소 BamHI 및 EcoRI cDNA 모든 플라스 미드에 출혈 BamHI EcoRI 사이트에서.<ol>
<li>기증자와 플라스 미드 pCS2 Nrg1 cDNA를 믹스+, 상용 마스터 혼합 솔루션 및 뇌관 (표 2). 참고: 총 반응 볼륨 마스터 믹스, 뇌관의 3 μ와 Nrg1 cDNA와 20 ng/μ 기증자 플라스 미드의 1 μ의 25 μ와 50 μ 이어야 한다.</li>
			<li>PCR 기계에 단계 1.1.2.1에서에서 믹스 하 고 다음 사양을 충족 시키기 위해 매개 변수를 설정: 98 ° C 10 s 5 또는 15 s, 55 ° C, 5 s/kb에 대 한 72 ° C.</li>
			<li>제조업체의 지침에 따라 정화 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화. 차입 버퍼의 50 μ로 제품을 elute.</li>
			<li>순화 된 PCR 제품 및 pCS2의 5 μ g 소화+ BamHI와 200 μ 반응 볼륨에서 2 h 동안 37 ° C에서 별도로 EcoRI. 상업적인 장비로 결과 소화를 정화 하 고 각각 20 μ에 Tris HCl (pH 8.5)의 100 μ elute.</li>
			<li>Nrg1 cDNA의 4 μ와 소화 pCS2의 2 μ 선+ 25 μ 반응에 1 μ와 16 ° C에 리가 촉매의 하룻밤 플라스 미드. 참고: 절차 야간 보육에 대 한 여기 중지 될 수 있습니다.</li>
			<li>1.1.2.5 단계에서 결 찰 솔루션 및 변환의 2 μ를 사용 하 여 복제 ( 재료의 표참조)에 대 한 적합 한 대장균 박테리아 세포의 50 μ로.</li>
		</ol>
</li>
		<li>확인 변환 Nrg1 cDNA 클론 PCR를 사용 하 여 심사에 의해 일어났다. 클론을 무작위로 선택한 특정 뇌관, 중 합 효소, 및 deoxyribonucleotide 된 (dNTPs)의 솔루션에 추가 합니다. 참고: 컨트롤 했다 벡터 (pCS2+)와 삽입 (인간 cDNA) 없이. 선택 하지 너무 큰 식민지의 과도 한 박테리아 PCR을 억제할 수 있는 때문에.<ol>
<li>변환 및 화면 pCS2에서 8 식민지를 선택+-Nrg1는 표 2에서 PCR 뇌관을 사용 하 여 복제.</li>
			<li>한 복제는 pCS2을 Nrg1 cDNA와 문화+-Nrg1 플라스 미드 DNA. PCS2와 대장균 박테리아의 100 μ와 접종+-파운드 미디어와 문화 (160-225 RPM) 37 ° c.에 떨고 하 여 100 mL로 플라스 미드 Nrg1</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transfect 순화 pCS2+-HEK 293으로 플라스 미드 Nrg1 제조업체의 지침에 따라 상업 transfection 시 약을 사용 하 여 6 잘 플레이트 세포.</li>
		<li>transfection, 후 24 h lyse 세포 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여 SDS 페이지 젤을 통해 실행, 젤 막에 전송 하 고 안티-Nrg1 항 체22얼룩. Nrg1 단백질 표정을 서쪽 오 점 사용 하 여 확인 합니다. 참고: 컨트롤은 빈 pCS2+ 플라스 미드. 수 수 일시 중지 여기 젤 막 전송 하룻밤 발생 하는 경우.</li>
		<li>테이블의 재료 에서 비슷한 상용 제품을 사용 하 여 Nrg1 mRNA를 합성 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.<ol>
<li>받아 5 μ는 pCS2의+-플라스 미드를 선형화를 37 ° C에서 2 시간 200 μ 반응에서 노트와 고립 된 박테리아 문화 다이제스트에서 Nrg1 DNA.</li>
			<li>상업적인 장비로 선형화 플라스 미드 정화 하 고 Tris HCl (pH 8.5)의 20 μ에 elute.</li>
			<li>제조업체의 지침에 따라 선형화 플라스 미드의 5 μ를 사용 하 여 20 μ 반응에 상업적인 RNA 격리 키트와 함께 녹음 방송 생체 외에서 실시 합니다.</li>
			<li>생체 외에서 베 꼈 다 Nrg1 RNA 세포의 용 해 버퍼의 350 μ를 추가 하 고 RNA 격리 키트 정화. Tris HCl (pH 8.5)의 60 μ에 RNA을 elute.</li>
			<li>RNA 농도 측정 하 고 나중에 사용-80 ° C에서 저장.</li>
		</ol>
</li>
		<li>따라 단계 1.1.6.1- EPO cDNA 및 mRNA 준비 하지만 클론 EcoRI와 XhoI pCS2 + 플라스 미드에 cDNA 대신 사이트에 대 한 위의 1.1.6.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Zebrafish Morpholino 주입<ol>
<li>23 개월 주사 gata1a4 (5 '-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3) 및 tnnt2a5 (5 '-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3) ATG 시퀀스에 대 한 온라인 도구 (테이블의 재료)를 사용 하 여 디자인 합니다.</li>
		<li>8 ng/nL와 4 ng/nL의 최종 농도 각각 있도록 nuclease 무료 물에 gata1a 및 tnnt2a 모 별도로 추가 합니다. 20 세/nL의 최종 농도와 EPO mRNA와 반복. 마지막 볼륨 1 mL 인지 확인 합니다.</li>
		<li>1 주사 nL 8 gata1a 모의 nL와 1의 심 실 벽 전단 응력 (WSS)24를 줄이기 위해 4 tnnt2a 모 4 셀 단계 1에서 별도 zebrafish 태아로의 nL의 nL. WSS를 증가 하기 위하여 주사 1 1-4 세포 단계에서 zebrafish 태아에 EPO mRNA6 의 20 세/nL의 nL.</li>
	</ol></li>
	<li>제 브라 trabeculation를 억제 하기 위해 화학적 치료<ol>
<li>30 5 μ M의 최종 농도에 E3 매체에 1 %DMSO 10 mg/mL AG1478 희석 20 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 관으로 hpf. 컨트롤, 각 물고기 1 %DMSO을 처리 합니다.</li>
		<li>1 %DMSO N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-부 틸 에스테 르 (DAPT) 추가 (100 μ M) 40에서 노치 신호를 억제 하기 위해 15 mL 튜브에 E3 매체 hpf 비슷한 방식. 컨트롤로 1 %DMSO 치료.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 이미징 기술
<ol><li>4 차원 심장 LSFM 이미징 동기화 알고리즘<ol>
<li>여러 심장 박동 주기 (그림 1) 아래 단계를 사용 하 여 전체 물고기 태아의 2 차원 이미지를 인계. 빛-시트 두께 약 5 μ m 인지 확인 합니다. 나이 키스 트 샘플링 원리25에 따르면 무손실 디지털 샘플링에 대 한 1 μ m 500 x-y 프레임 10 양 세트 z 검색의 노출 시간을 가져가 라.<ol>
<li>100 ml agarose의 1 g을 추가 하 고 모든 agarose 해산 때까지 열 하 여 1% (w/v) agarose 젤을 만듭니다. 배아와 agarose 20 μ 피 펫을 사용 하 여 작은 플라스틱 튜브를 로드 하 고는 무대에 그것을 확보.</li>
			<li>이미지 보기 소프트웨어 열고 라이브 샘플의 라이브 뷰를 보려면 클릭 합니다. 목표는 샘플 초점에서 손잡이 사용 하 여 조정 합니다. 마찬가지로, 샘플의 라이브 뷰 태아의 맨 위에 표시 되도록 스테이지를 이동 합니다.</li>
			<li>5에 대 한 500 번 이미지에서 10 배 확대 현미경의 소프트웨어26를 사용 하 여 s.</li>
			<li>새 레이어 (z 축에서 1 μ m)에 모터를 사용 하 여 스테이지를 이동 하 고 이미징 절차를 반복 합니다.</li>
			<li>전체 심장 군데 완전히 될 때까지 위의 2 단계를 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>첫 번째 및 마지막 심장 주기 이미지를 무시 하 여 데이터 무결성을 확인 합니다. 심장 주기, 하지만 다른 기간에 같은 시간 지점에서 찍은 이미지를 일치 하 여 심장 주기의 기간을 찾아. 기간을 찾기 위해 개발 되었다 다음 식을 사용 하 여: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57763/57763eq1.jpg">(1) D 기간 가설 피팅 사용 비용 함수는 나m 캡처된 이미지 τ' 이미지가 캡처된 시간 zk 이미지의 z 방향 인덱스, xm 는 픽셀 인덱스의 벡터와 T' 정기 가설입니다.</li>
		<li>다음 방정식을 사용 하 여 유사한 단계에 두 사진 사이의 상대 shift를 찾을. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57763/57763eq2.jpg">(2) 여기서 Qk', k 나타냅니다 상대적 변화, R 에 대 한 비용 함수는 가능한 공간 이웃 L 이미지 캡처의 총 시간, x 는 픽셀 인덱스, zk 및 zk' 첫 번째 및 두 번째 z-방향으로 분할 영역, 이며, t 는 시간, s 는 상대 shift 가설.</li>
		<li>첫 번째 이미지에 대해 절대 변화에 상대 shift를 변환 하 고 앞에서 설명한27이미지의 다음 섹션을 정렬 하려면 절대 관계를 찾으려고 의사 역 접근을 사용 하 여 선형 방정식을 해결.</li>
		<li>마지막 4 차원 이미지 이미지 프로세싱 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 처리 되었습니다.<ol>
<li>3 차원으로 2 차원 이미지를 스태킹<ol>
<li>상업 이미지 프로세싱 소프트웨어를 엽니다.</li>
				<li>오픈 데이터를 클릭 합니다.</li>
				<li>모든 이미지를 3 차원으로 쌓을 수 선택 &gt; 클릭 부하.</li>
				<li>0.65 x 0.65 x 1의 복 크기에 추가 &gt; 확인을 클릭 합니다.</li>
				<li>3 차원 이미지를 시각화에 Multi-Planar 보기 상자를 클릭 합니다.</li>
				<li>블루 slice_1.tiff 상자를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 &gt; 디스플레이 선택 &gt; Volren를 선택 합니다.</li>
				<li>편집 을 클릭 &gt; 옵션 &gt; 편집 색상표선택.</li>
				<li>빨간색으로 설명 된 상자를 사용 하 여 색상 조정 &gt; 확인을 클릭 합니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>4 차원 3 차원 변환<ol>
<li>클릭 "파일 &gt; 시계열 데이터를 엽니다.</li>
				<li>그냥 만들어진 3 차원 tiffs 선택 &gt; 클릭 부하.</li>
				<li>앞으로 동일한 복 크기를 입력 합니다.</li>
				<li>블루 slice_1.tiff 상자를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 &gt; "디스플레이"를 선택 &gt; Volren를 선택 합니다.</li>
				<li>편집 을 클릭 &gt; 옵션 &gt; 편집 색상표선택. 상자를 사용 하 여 색상 조정 &gt; 확인을 클릭 합니다.</li>
				<li>시간 시리즈 컨트롤 마우스 오른쪽 클릭 &gt; Movie maker 를 클릭 &gt; 영화를 시청 하려면 재생 단추를 누릅니다.</li>
				<li>추가 파일 이름, 프레임 크기, 프레임 속도, 품질 1, 평면 입력 &gt; 클릭 적용
</li>
				<li>비디오를 내보냅니다. 적절 한 소프트웨어에서 비디오를 엽니다.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. qRT-PCR 분석
<ol><li>Zebrafish 노치 ligands, 수용 체, 계량 RNA 격리 마음과 대상 유전자의 식<ol>
<li>Tricaine methylate,2829의 과다 복용에 그들을 쓰는 하 여는 제 브라를 희생. 앞에서 설명한 프로토콜30을 사용 하 여, zebrafish 마음 excised 했다 고 RNA 격리에 대 한 준비.</li>
		<li>총 RNA를 분리 하 고 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용 하 여 cDNA를 합성.</li>
		<li>PCR 뇌관 디자인 노치 ligands Jag1, Jag2, Dll4, Notch1b, 수용 체 및 신호 관련 유전자 Nrg1 및 ErbB2. 우리가 사용 하는 뇌관 표 3을 참조 하십시오.</li>
		<li>단계의 3.1.3 뇌관, 단계의 3.1.2, 고립 된 mRNA와 상업 mastermix PCR 접시에 추가 합니다. 적절 한 온도 시간에 따라 사용 하는 효소에서 qRT-PCR을 실행 합니다. 정상화 zebrafish α-걸을 결과. 참고: 이 ligands, 수용 체, 그리고 유전자의 각 식 레벨을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 인간의 대동맥 내 피 세포 (항구적) 실험 체 외에
<ol><li>동적 전단 응력 모델<ol>
<li>항구적 문화 미디어와 문화 항구적 셀입니다. 일단 완전히 confluent 층 류 및 23 x 10-5 N 24 h에 대 한 1의 속도 타악기 흐름 셀을 표시 합니다.<ol>
<li><li><li><li><li></li><li></li></ol></li><li><li><li></li></ol></li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></ol><ol><li><li> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57763/57763eq3.jpg"> </li><li></ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 우리 4 차원 이미징 biomechanical 세력의 변화에 대 한 응답에서 배수 네트워크의 개발을 추적 하기 위해 사용 될 수 있다는 것으로 나타났습니다. 특히, 내 피 세포에 의해 경험된 전단 응력 노치 신호 폭포, 차례 차례로 trabeculation를 승진 시키는 시작 합니다. 우리는 (1) gata1a 모 사출 조 감소 하 고 따라서 벽 전단 응력 감소, (2) tnnt2a 모 사출 벽 전단 응력, 그리고 (3) wea를 줄이기 위해 심 실 수축 기능을 저해 표시는이 원고 돌연변이 부족 다음 감소는 hemodynamic 힘은 심 실 심 방 수축. 심장 벽에 전단 응력을 줄임으로써, 우리는 노치 신호 qRT-PCR을 통해 계량 하 고 감소 wss 했음을 발견 노치 신호 감소. 더 증명 하기 위해 우리의 가설, clo 돌연변이 부족 endocardium trabeculae, 형성 하지 않았다 그리고 그 전단 응력은 노치 신호 활성화 하는 것을 ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>.&#160;Additional author names were added, and an author affiliation was updated.
The author list was updated from:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
to:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
The author affiliation for Rongsong Li was updated from:
Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA
to:
College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>. Additional&#160;author names were&#160;added, and an author affiliation was updated.

Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Biomechanical 세력, hemodynamic 전단 응력, 같은 심장 morphogenesis에서 친밀 하 게 포함 된다. Hemodynamic 전단 세력에 대 한 응답, 심근 능선과 홈 개발 전단 응력의 방향으로 정렬에 파도 같은 배수 네트워크에 걸쳐 것 (AV) 밸브1. Trabeculation 심장 수축 기능 및 심근 질량2증가 필요가 있다. 노치 신호 통로에서 돌연변이 인간과 다른 척추 동물3에서 선 천 성 심장 결함 발생. 예를 들어, gata1a4 , tnnt2a5 morpholino oligonucleotides (MO) erythropoietin (EPO) mRNA6 및 Isoproterenol (ISO)7 증가 빨간 혈액 적혈구를 줄이기 위해 표시 되었습니다 있다 세포와 심장 박동 각각, 그리고 그러므로 전단 응력 (WSS) 벽. 또한, ErbB2 신호, 하류, 노치의 cardiomyocyte 확산 및 차례 차례로 활성화 노치 신호8,9수축 성 힘을 생성 하는 차별화를 촉진. 노치 신호 심 실 개발에 대 한 제어 trabeculation를 지배 하는 그 전단 응력이 좋습니다. 현재, 추가 선 천 성 심장 결함 (CHD)10,,1112, 선도 유전자 프로그래밍 이벤트를 이해 하려고 많은 연구 하지만 거의 조사 하는 방법 기계적인 힘 영향 형성 심장.
기계적인 힘 조사 연기 endocardium, 발달 기간 동안 가까운 관측에 구현 해야 합니다. 그러나, vivo에서 박동 때문에 전통적인 현미경 검사 법13의 판매세 샘플의 좋은 품질의 이미지를 얻기 위해 도전 이다. 샘플 내에서 시간이 지남에 개발을 관찰 하기 위해 실제 단면 및 얼룩, 따라서 필요가 발생 하는13,,1415. Confocal 현미경 검사 법은 널리 샘플14,16의 3 차원 구조를 이미지 하는 데 사용 됩니다, 비록 이러한 이미징 시스템이 인수는 여전히 느린 검색 속도 의해 제한 됩니다.
빛-시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM)은 긴 작동 거리13동적 이벤트 vivo에서 의 시각화 수 있도록 독특한 이미징 기술입니다. 이 기술은 빛 시트 형광 현미경을 사용 하 여 광학 샘플17섹션. 샘플에 빛의 단지 얇은 시트의 조명으로 인해 사진 표백 및 사진 독성13,18에 감소가입니다. 보기 및 긴 작동 거리의 큰 분야 대형 샘플 이미지13,,1417은 그대로 남아 있습니다. 낮은 확대 긴 동안 이미지를 더 큰 영역에 대 한 허용 작업 거리 신호 대 잡음 비율을 타협 하지 않고 이미지를 두꺼운 샘플에 대 한 수 있습니다. 많은 그룹 이미지 전체 배아17LSFM 사용,14,18, 근육 및 심 혼19 다른 조직 중 몇 군데 수 샘플의 다양 한 종류를 보여주는 두뇌.
이전 연구 zebrafish 심장의 유입 또는 유출 트랙 경색으로 감소 hemodynamic 전단 힘 설명, 정보는 전적으로 질적. 그것은 결과 비정상적인 3 챔버, 저하 심장 루핑, 장애인된 밸브 대형20. 4 차원 LSFM 이미지 hemodynamic 전단 세력에 영향을 미칠 방법으로 심장 조직 개발 새로운 관점 제공 합니다. 이러한 기계적인 힘 힘 민감한 신호 분자를 활성화 하 고 배수 능선의 형성을 유발 수 있습니다. 4 차원 영상의 추가 시간 측면 때문에 하나는 개발 이전 주목 했다 새로운 폭로 이어질 수 있는 실시간으로 변경 내용을 추적할 수 있다. Zebrafish는 과학자만 세포 세포 상호 작용에 대 한 전체 척추 동물을 관찰할 수 있기 때문에 이미지에 대 한 이상적인 모델입니다. 산소 또한 포유류 개발에서와 달리 혈관 시스템에 따라 하지 않고 발생 하는 개발을 수 있는 전체 태아 통해 무마 수 있습니다. Zebrafish 심장 필요 4 연 발 심장, 폐 장기 부족 하더라도 심장 유전자가 zebrafish와 인간21사이 보존의 큰 숫자가입니다.
이 원고에 우리는 다양 한 상황에서 zebrafish 마음에 개발 trabeculae 이미지를 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 주입 gata1a4 또는 tnnt2a5 의 모스 낮은 혈액 점성을 따라서 WSS 사용 되었다. 심장의 형태학 다음 기록 했다. 물고기의 별도 그룹에서 우리 EPO mRNA6 또는 isoproterenol7 을 투여 하 여 WSS를 증가 하 고 결과 관찰 했다. 우리는 또한 다른 타악기 또는 진동 흐름 율을 가진 셀 연구를 실시. 후 각 그룹 이미징, 우리 발견 WSS 노치 통해 endocardium에 의해 감지 신호 시작 trabeculation.

<table><tbody><tr><td>클론텍 하이파이 PCR 프리믹스&nbsp;</td><td>타카라&nbsp;</td><td>639298</td><td>PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4</td></tr><tr><td>인간 Nrg1 cDNA</td><td>선물, William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N</td><td>/A</td><td>trabeculation rescue 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1</td></tr><tr><td>CFX Connect&trade; Real-Time PCR 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>PCR Machine 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2</td></tr><tr><td>pCS2+</td><td>GE Health</td><td></td><td>Plasmid는 mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5</td></tr><tr><td>Nucleospin 정제 키트를 합성하는 데 사용됩니다. &nbsp;</td><td>클론텍</td><td>740609.25</td><td>DNA 정제 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>2011A</td><td>PCR 결찰 솔루션 1.1.2.5</td></tr><tr><td>항성 적격 세포</td><td>Clontech</td><td>636763</td><td>E. coli 형질전환에 사용되는 세포 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 형질주입 시약</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>형질주입 시약 1.1.4</td></tr><tr><td>mMessage SP6 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td>mRNA 1.1.6.3</td></tr><tr><td>Aurum Total RNA Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>7326820</td> RNA를 합성하는 데 사용되는 키트<td>&nbsp; 1.1.6.4, 3.1.2</td></tr><tr><td>GeneTools 4.3.8</td><td>GeneTools</td><td>프라이머 설계용 N/A 소프트웨어 1.2.1, 3.1.3</td><td></td></tr><tr><td>EPO cDNA</td><td>Creative Biogene</td><td>CDFH006026</td><td>Increases WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7</td></tr><tr><td>AG1478</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T4182</td><td>ErbB 억제제 1.3.1</td></tr><tr><td>E3 배지</td><td></td><td></td><td>배아 성장 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5942</td><td>&감마;-세크레타제 억제제 1.3.2</td></tr><tr><td>아가로스&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>A9539</td><td>배아 장착에 사용됩니다 2.1.1.1</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT&nbsp; 디지털 CMOS 카메라</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>이미지를 캡처하는 데 사용됨 2.1.1.2, 2.1.1.3</td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>FEI Software</td><td>N/A</td><td>시각화 및 분석된 이미지를 3D, 그리고 4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8</td></tr><tr><td>Tricaone mesylate&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>886-86-2</td><td>배아를 인도적으로 진정시키거나 희생하는 데 사용됨 3.1.1</td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td>cDNA 합성 3.1.2</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-005</td><td>microcentrifuge 4.1.1.3</td></tr><tr><td>GI254023X</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>260264-93-5</td><td>ADAM10 억제제 4.1.2, 4.1.3&nbsp;</td></tr><tr><td>이소프레날린 하이드로클로</td>라이드 <td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I5627</td><td>이소프로테레놀은 WSS 증가시킵니다 5.1.5</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>심장 역학 분석</td></tr></tbody></table>

개발 zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

심장 영향 심장 개발, 특히 trabeculation, 심근에서 분기 outgrowths의 네트워크를 형성 하 여 경험 hemodynamic 세력. 캐스케이드 왼쪽 심 실 비 압축 심근 또는 Hypoplastic 좌 심 혼 증후군 같은 심 실 결함에 관련 된 신호 단계에서 결함을 유전 프로그램. 이 프로토콜을 사용 하 여, 그것은 확인할 수 있습니다 전단 응력 중심 trabeculation 및 노치 신호 서로 관련. 빛-시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여, 개발 zebrafish 심장의 시각화 가능 했다. 이 원고에서 그것은 평가 되었다 hemodynamic 세력 노치 신호를 통해 trabeculation의 개시를 변조 하 고 따라서, 수축 성 기능에 영향을 미칠 여부를 발생 합니다. 정성 및 정량에 대 한 전단 응력 해석, 4 차원 (3-D + 시간) 이미지 zebrafish 심장 morphogenesis 동안 인수 했다 그리고 4 차원 동기화 통합된 빛 시트 형광 현미경 검사 법 심 실 모션 캡처. 혈액 점도 gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) 마이크로-주입 함으로써, 전단 응력을 감소를 통해 다운 조절 노치 신호 및 trabeculation 약하게 감소 되었다. Gata1a 모와 Nrg1 mRNA의 공동 주입 노치 관련 유전자 trabeculation를 복구를 구출. 노치 신호를 구동 하는 전단 응력 영향 trabeculation 것인지 cardiomyocyte 수축 더 tnnt2a을 통해 체포 됐다-모, hemodynamic 세력을 줄이기 위해 비-trabeculated 개발 하 노치 대상 유전자 다운 규제 심근입니다. 마지막으로, 전단 응력 응답 노치 유전자의 표현 패턴의 확증 타악기 흐름에 내 피 세포를 쓰는 하 여 실시 했다. 따라서, 4 차원 빛 시트 현미경 기본 노치 신호 및 trabeculation 비 압축 심근에 임상 관련성 hemodynamic 세력 적발.

LSFM은 고해상도 2 차원 및 3 차원 사진을 얻기 위해서는이 원고에 사용 되었다. 그림 1A 및 1B에서 보듯이 조명 렌즈 빛 시트 샘플에 지시 합니다. 빛 시트의 두께, 때문에 단일 평면 조명 이다. 감지 렌즈 조명 렌즈에 수직으로 위치 이며 조명된 평면 (그림 1B)에 초점을 맞추고. 조명 렌즈에서 빛 시트 다음 왼쪽에서 오른쪽 (그림 1C) 샘플을 검색합니다. 스캔 덜 사진-표백, 사진-독성, 허용 하 고 더 낮은 신호 대 잡음 비율.
LSFM 빠른 스캐닝 (&gt; 30 s) 복 셀 해상도 0.65 x 0.65 x 1 µ m입니다. 단일 평면 조명 때문에 의해<su...

여기, 선물이 시각화 4 차원 (4d)에서 zebrafish에 마음을 개발 하는 프로토콜. 빛-시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM)를 통해 4 차원 영상, 3 차원 (3 차원) 이미지 개발 마음을 재구성 하는 시간 걸립니다. 우리 그 전단 응력 활성화 endocardial 노치 신호 챔버 개발, 심장 trabeculation를 승진 시키는 동안 질적 및 양적 보여줍니다.

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

이 방법은 4D 광시트 현미경을 사용하여 노치 신호를 통해 심장 섬유주에 대한 전단 응력 조절과 같은 발달 심장 기계생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플의 얇은 부분을 5미크론 평면으로 비추어 광표백 및 광손상이 적다는 것입니다. 또한 당사의 계산 알고리즘을 통해 4D 박동하는 제브라피시 심장을 재구성할 수 있습니다.이 기술의 의미는 초기 발달 단계에서 후기 표현형에 이르기까지 심장 섬유주에 대한 invivo 순차적 시각화를 허용하기 때문에 선천성 심장 질환의 진단으로 확장됩니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람들은 시간이 지남에 따라 3차원으로 생각하는 것을 상상하기 어렵다는 것을 알게 될 것입니다. 또한 시스템을 만들고 정확하게 정렬하는 데 시간이 걸립니다.시작하려면 칸막이를 사용하여 번식 탱크에서 수컷과 암컷 제브라 피쉬를 분리하십시오. 그런 다음 칸막이를 들어 올리고 수컷과 암컷 제브라피쉬가 번식할 수 있도록 합니다. 제브라피쉬 배아를 채취하고 모르폴리노 올리고를 배아에 주입하여 섬유주화를 억제합니다.다음으로, 증류수 100ml에 아가로스 1g을 첨가하여 1% 아가로스 젤을 준비하고 아가로스가 모두 녹을 때까지 가열합니다. 아가로스를 식힌 다음 20마이크로리터 피펫을 사용하여 준비된 배아와 아가로스 중 하나가 담긴 작은 플라스틱 튜브를 넣습니다. 튜브를 현미경 스테이지에 고정하고 ten x 대물렌즈를 사용합니다.배아의 상단에 초점이 맞도록 손잡이를 사용하여 대물렌즈를 조정합니다. 5미크론 두께의 가벼운 시트를 사용하여 여러 번의 심장 박동 주기에 걸쳐 전체 물고기 배아의 이미지를 촬영합니다. 노출 시간이 10밀리초인 500개의 xy 프레임을 수집합니다.그런 다음 z 액세스에서 스테이지 1미크론을 새 레이어로 이동하고 이미징 절차를 반복합니다. 심장 전체가 완전히 이미지화될 때까지 z 평면당 500프레임을 계속 상상해 보십시오. 그런 다음 이미지 처리 소프트웨어를 열고 이미지를 3D로 쌓기 시작합니다.이렇게 하려면 먼저 열린 데이터를 클릭하십시오. 여기에서 3D로 쌓을 모든 이미지를 선택한 다음 로드를 선택합니다. 그런 다음 0.65 x 0.65 x 1 미크론의 복셀 크기를 추가하고 확인을 클릭합니다.올바른 복셀 크기를 입력하는 것은 3D 이미지의 정확한 분석을 위해 매우 중요합니다. 이제 다중 평면 보기 상자를 클릭하고 3D 이미지를 시각화합니

light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

우리는 빛 시트 형광 현미경 검사법과 생체 내 제브라피시 심장을 연구하는 최적화 된 도구를 설명합니다. 특히, 우리는 밝은 심장 형질 전환선을 제안하고 발달과 심장 결함을 피하는 새로운 부드러운 임베드 및 고정 기술을 제시합니다. 심장 이미징에 적응된 가능한 데이터 수집 및 분석 파이프라인도 제공됩니다.

얼룩말 물고기 배아에서 빠른 심장 역학의 빛 시트 현미경 검사

이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

생리학 및 병리 학적 압력 조건에 심장 밸브 조직을 쓰는 수있는 순환 압력 생물 반응기는 설계되었습니다. LabVIEW 프로그램은 사용자가 압력 크기, 진폭 및 주파수를 제어할 수 있습니다. 이 장치는 심장 밸브 조직이나 격리 세포의 mechanobiology을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

우리는 인간의 혈청에서 낮은 분자량의 단백질과 펩티드의 선택적 회수를위한 mesoporous 실리카 박막을 기반으로 기술을 개발했습니다. 우리 mesoporous 칩 physico - 화학적 성질은 잘게 펩타이드 강화에 실질적인 컨트롤을 제공하며, 결과적으로 진단을 위해 혈청 프로테옴을 프로파일하기 위해 조정되었습니다.

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

이 비디오 프로토콜에서는 변형된 이광자 현미경에서 궤도 추적 방법을 사용하여 살아있는 세포 내에서 형광 표지된 리소좀을 고속으로 3차원으로 추적합니다.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

학습하세요 4차원 광시트 형광 현미경법을 사용하여 제브라피심장의 전단 응력 효과를 시각화하는 방법을. 계산 알고리즘으로 심장을 재구성하고 선천성 심장질환 진단에 활용할 수 있습니다.

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

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