개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

이 방법은 4D 광시트 현미경을 사용하여 노치 신호를 통해 심장 섬유주에 대한 전단 응력 조절과 같은 발달 심장 기계생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플의 얇은 부분을 5미크론 평면으로 비추어 광표백 및 광손상이 적다는 것입니다. 또한 당사의 계산 알고리즘을 통해 4D 박동하는 제브라피시 심장을 재구성할 수 있습니다.

이 기술의 의미는 초기 발달 단계에서 후기 표현형에 이르기까지 심장 섬유주에 대한 invivo 순차적 시각화를 허용하기 때문에 선천성 심장 질환의 진단으로 확장됩니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람들은 시간이 지남에 따라 3차원으로 생각하는 것을 상상하기 어렵다는 것을 알게 될 것입니다. 또한 시스템을 만들고 정확하게 정렬하는 데 시간이 걸립니다.

시작하려면 칸막이를 사용하여 번식 탱크에서 수컷과 암컷 제브라 피쉬를 분리하십시오. 그런 다음 칸막이를 들어 올리고 수컷과 암컷 제브라피쉬가 번식할 수 있도록 합니다. 제브라피쉬 배아를 채취하고 모르폴리노 올리고를 배아에 주입하여 섬유주화를 억제합니다.

다음으로, 증류수 100ml에 아가로스 1g을 첨가하여 1% 아가로스 젤을 준비하고 아가로스가 모두 녹을 때까지 가열합니다. 아가로스를 식힌 다음 20마이크로리터 피펫을 사용하여 준비된 배아와 아가로스 중 하나가 담긴 작은 플라스틱 튜브를 넣습니다. 튜브를 현미경 스테이지에 고정하고 ten x 대물렌즈를 사용합니다.

배아의 상단에 초점이 맞도록 손잡이를 사용하여 대물렌즈를 조정합니다. 5미크론 두께의 가벼운 시트를 사용하여 여러 번의 심장 박동 주기에 걸쳐 전체 물고기 배아의 이미지를 촬영합니다. 노출 시간이 10밀리초인 500개의 xy 프레임을 수집합니다.

그런 다음 z 액세스에서 스테이지 1미크론을 새 레이어로 이동하고 이미징 절차를 반복합니다. 심장 전체가 완전히 이미지화될 때까지 z 평면당 500프레임을 계속 상상해 보십시오. 그런 다음 이미지 처리 소프트웨어를 열고 이미지를 3D로 쌓기 시작합니다.

이렇게 하려면 먼저 열린 데이터를 클릭하십시오. 여기에서 3D로 쌓을 모든 이미지를 선택한 다음 로드를 선택합니다. 그런 다음 0.65 x 0.65 x 1 미크론의 복셀 크기를 추가하고 확인을 클릭합니다.

올바른 복셀 크기를 입력하는 것은 3D 이미지의 정확한 분석을 위해 매우 중요합니다. 이제 다중 평면 보기 상자를 클릭하고 3D 이미지를 시각화합니다. 파란색 slice one dot tiff 상자를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 display를 선택한 다음 volran을 클릭합니다.

편집 메뉴에서 options를 선택한 다음 color map을 편집합니다. 상자를 사용하여 색상을 조정한 다음 확인을 클릭합니다. 이미지 처리 소프트웨어에서 파일을 클릭하고 시계열 데이터를 엽니다.

로드를 클릭하여 방금 만든 3D tiffs를 선택하고 이전과 동일한 복셀 크기를 입력합니다. 파란색 slice one dot tiff 상자를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 display를 선택한 다음 volran을 선택합니다. 이제 편집을 클릭하십시오.

옵션을 선택합니다. 그런 다음 색상 맵 편집을 선택합니다. 상자를 사용하여 색상을 조정한 다음 확인을 클릭합니다.

그런 다음 시계열 컨트롤을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 무비 메이커를 클릭한 다음 재생 버튼을 눌러 영화를 시청합니다. 마무리하려면 파일 이름, 프레임 크기, 프레임 속도, 품질을 1로 추가하고 monoscopic을 입력합니다. 그런 다음 적용을 클릭합니다.

마지막으로 비디오를 내보냅니다. 혈역학적 전단 응력과 같은 생체 역학적 힘은 심장 형태 형성에 밀접하게 관련되어 있습니다. 여기서, 광시트 형광 현미경을 사용하여 수정 후 75시간에 심실 내강으로 돌출된 섬유주 융기를 시각화했습니다.

수정 후 100시간이 지나면 섬유주 네트워크가 명확하게 보입니다. gata1aMO 미세주입으로 처리된 배아에서는 조혈과 점도가 90% 감소합니다. 이로 인해 점도가 감소하면 혈역학적 전단 응력이 약화되어 시작이 지연되고 밀도가 낮은 섬유주 네트워크가 생겼습니다.

이러한 섬유주 네트워크의 지연과 밀도는 노치(notch) 관련 유전자 발현을 상향 조절하여 수정 후 75시간 및 수정 후 100시간에 섬유주 형성을 구제함으로써 회복될 수 있었습니다. 따라서 gata1a morpholino oligonucleotides는 혈역학적 힘을 감소시켜 notch signaling을 하향 조절하는 반면, Nrg1-mRNA는 조절된 notch 관련 유전자를 상향 조정하고 trabeculation을 다시 시작했습니다. 이 이미징 기술을 완전히 익히면 적절하게 수행하면 약 2시간 내에 완료할 수 있습니다.

개발 후, 이 기술은 심장 발달 분야의 연구자들이 제브라피시에서 섬유주(trabeculation)의 적절한 형성을 담당하는 노치 유전자의 요인을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 선택적 평면 조명 현미경을 사용하여 이미지를 획득하고 4D 이미지 파일을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

그리고 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.