초파리 애벌레의 열 환경 설정을 결정 하는 온도 분석 결과

이 방법은 초파리 멜라노가스터(drosophila melanogaster)와 같은 동물이 선호하는 환경 온도를 선택하는 메커니즘인 체성감각(somatosensation) 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연속적인 온도 범위에 직면했을 때 단일 분석에서 유충 그룹의 선호하는 온도를 설정할 수 있다는 것입니다. 초파리 유충의 온도 선호도에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도 impress plate는 벌레, 예쁜꼬마선충과 같은 다른 모델 유기체와 함께 사용하도록 조정할 수도 있습니다.

먼저 이스트 페이스트를 만들어 십자가용 바이알을 준비합니다. 증류수에 효모 알갱이를 섞어 유봉으로 반죽으로 갈아서 만듭니다. 그런 다음 음식 표면 바로 위에 있는 표준 초파리 바이알의 내벽 가까이에 효모 페이스트를 약간 추가합니다.

유충을 생산하려면 12-35 마리의 암컷과 최대 절반의 수컷을 수집하지만 10 마리를 넘지 마십시오. 효모 페이스트가 함유된 바이알에 이러한 그룹을 결합합니다. 준비된 바이알을 100바이알 트레이에 넣습니다.

습도를 제공하기 위해 트레이에 물이 담긴 열린 바이알 20개를 포함합니다. 그런 다음 트레이를 투명한 비닐 봉지에 밀봉하고 섭씨 25도에서 48시간 동안 배양합니다. 48시간 동안 먹이를 주고 짝짓기를 한 후 파리를 새 먹이 유리병으로 옮겨 알을 모으십시오.

탭하세요. 이산화탄소를 사용하지 마십시오. 그런 다음 파리가 섭씨 25도에서 3시간 동안 알을 낳도록 합니다.

나중에 성충을 제거하고 계란이 들어 있는 바이알을 물병과 함께 트레이에 다시 넣고 백을 닫습니다. 그런 다음 섭씨 25도에서 알을 원하는 유충 단계로 발달시킵니다. 단방향 그래디언트를 준비하려면 먼저 분석을 위한 인간 주변 환경을 만듭니다.

별도의 수조에 연결된 두 개의 알루미늄 블록을 젖은 종이 타월 위에 10cm 간격으로 놓습니다. 수조는 미리 예열해야 합니다. 다음으로, 100ml의 1%아가로스를 만들고 평평한 표면의 각 분석 플레이트에 25ml를 추가합니다.

아가로스가 굳으면 멜라민 스펀지로 표면을 부드럽게 문질러 표면을 약간 거칠게 만듭니다. 그런 다음 효율적인 온도 전달을 촉진하기 위해 분석 플레이트의 알루미늄 블록 사이의 틈을 스프레이 병에서 전달된 물로 채웁니다. 이제 알루미늄 블록에 분석 플레이트를 놓고 경계가 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치하도록 양쪽 가장자리에서 2cm인지 확인합니다.

다음으로, 젤이 마르지 않도록 플레이트 표면에 물막을 뿌립니다. 다음으로, 증발을 줄이고 겔 표면의 온도를 안정화하는 데 도움이 되도록 판지 상자로 시스템을 덮습니다. 온도가 평형을 이룰 때까지 5분에서 10분 동안 기다립니다.

그런 다음 최소 12개 위치에서 플레이트의 표면 온도를 확인하여 전체적으로 균일한 온도가 있는지 확인하고 섭씨 2도를 주거나 취합니다. 그런 다음 분석이 수행될 때까지 상자 덮개를 교체합니다. 깨끗한 유충을 분리하려면 먼저 50ml 시험관에 약 40ml의 18% 자당 용액을 추가합니다.

그런 다음 스쿠퓰라를 사용하여 음식 더미의 유충을 용액으로 옮깁니다. 다음으로, 스쿠퓰라를 사용하여 용액에 유충을 철저히 섞습니다. 이제 유충이 튜브의 최상층으로 떠오를 때까지 30-60초 동안 기다립니다.

그런 다음 유충과 함께 용액을 다른 50ml 튜브에 붓고 신선한 18% 자당으로 마무리합니다. 다시 말하지만, 유충이 떠오를 때까지 기다립니다. 음식의 존재는 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.

따라서 재현 가능한 결과를 얻으려면 유충을 철저히 청소하여 음식으로 인한 오염을 최소화하는 것이 중요합니다. 유충이 손상되지 않도록 부드럽게 하십시오. 다음으로, 50밀리리터 튜브 위에 300미크론 세포 여과기를 놓고 자당 용액 표면에서 성인 시체와 떠다니는 파편을 제거합니다.

이제 여과기를 통해 유충을 부어 메쉬 스크린에 수집합니다. 그런 다음 여과기에 약 50ml의 물을 두 번 흘려보내 유충을 더 청소합니다. 그런 다음 빈 35mm 접시에 물을 사용하여 여과기에서 대부분의 유충을 헹굽니다.

페인트 브러시를 사용하여 메쉬에 남아 있는 유충을 옮깁니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 접시에서 대부분의 물을 빨아들입니다. 그런 다음 유충이 탈출하지 못하도록 접시의 뚜껑을 거꾸로 놓습니다.

이제 분석을 시작하기 전에 유충이 10-20분 동안 회복할 때까지 기다립니다. 먼저 젤 위의 판지 상자를 제거하고 젤 표면 온도를 빠르게 확인합니다. 표면이 건조하면 표면에 소량의 물을 분사하십시오.

젤이 좋으면 작은 붓을 사용하여 각 판의 중앙에 100-200 마리의 유충을 넣으십시오. 그런 다음 각 분석 플레이트에 뚜껑을 덮어 유충을 가두고 판지 상자로 설정을 덮어 빛 노출을 방지합니다. 분석은 현재 진행 중입니다.

10-30분 후 판지 상자와 마이크로플레이트 뚜껑을 제거합니다. 그런 다음 위에서 접시를 촬영하여 유충의 위치를 기록합니다. 젤 표면에 반사되지 않도록 상자를 카메라 위에 놓습니다.

접시를 청소하려면 흩어졌을 수 있는 모든 유충을 흡인하십시오. 이제 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 구역에서 유충의 백분율 분포를 계산하십시오. 분석 플레이트의 경계에 따라 2cm마다 선을 만들고 각 구역의 유충 수를 계산합니다.

계수할 때 젤 두께와 온도 조건이 가장자리 근처에서 균일하지 않으므로 각 가장자리에서 0.5cm 떨어진 능선에 분포된 유충은 무시합니다. 섭씨 18도에서 28도까지는 섭씨 16.8도와 섭씨 31도로 설정된 수조를 사용하여 단방향 구배를 만들었습니다. 구배를 따른 온도 분포는 거의 선형인 것으로 나타났습니다.

대조군 유충은 다양한 연령에서 분석되었습니다. 첫 번째, 두 번째, 세 번째 초기의 인스타 유충은 섭씨 24도 영역에서 최고의 선호도를 보였습니다. 3 분 3 중반 동안 대부분의 유충은 섭씨 18도 영역에 축적되었습니다.

돌아다니지 않는 후반 3분의 1 instar 유충은 섭씨 18도 영역에 빽빽하게 모여 있었습니다. 대조군 균주에서 섭씨 18도 구역에 축적되는 경향은 백색 1118이었는데, 이는 가장자리 효과 때문이 아니었는데, 이는 3분의 1 후반 인스타 유충이 여전히 양방향 구배를 사용하여 섭씨 18도 구역에 축적되었기 때문입니다. 3세 후반 instar 유충이 온도를 구별하는 데 필요한 돌연변이를 가지고 있는지 분석했을 때 결과가 바뀌었습니다.

trpA1에서 null 돌연변이가 있는 유충은 섭씨 18도에서 섭씨 28도 구배 전체에 균등하게 분포했습니다. A와 B 이성질체 또는 trpA1의 C와 D 이성질만 없는 유충도 심각한 손상을 보였다. 포스포리파제 c 베타(phospholipase c beta)인 norpA를 암호화하는 두 유전자 중 하나에 돌연변이가 있는 유충도 파괴되었다.

그러나 다른 포스포리파제 c 베타인 plc21c를 암호화하는 유전자에 돌연변이가 있는 유충은 정상적으로 행동했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 야생형 유충과 돌연변이 초파리 유충의 온도 선호도를 비교할 수 있는 연속 열 구배를 사용하여 재현 가능한 결과를 얻는 방법에 대해 명확하게 이해하게 될 것입니다. 이 기법을 완전히 익히면 단일 분석으로 30분 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 플라이 바이알의 상태에 주의를 기울이고 유충이 건조된 경우 사용하지 않는 것이 중요합니다. 이 기술은 초파리 유충이 편안한 범위에서 좋아하는 온도를 선택하는 데 필요한 새로운 유전자의 발견을 단순화합니다.