Name: 초파리 애벌레의 열 환경 설정을 결정 하는 온도 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 애벌레의 온도 선호도를 연속적 열 환경 설정을 통해 분석하는 방법을. 이 기법은 신경과학 및 행동학 연구에서 감각 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
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<li>Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+thermotactic+behavior+via+coupling+of+a+TRP+channel+to+a+phospholipase+C+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade.</a> Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).</li>
<li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li>
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<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜의 성공을 위해 실험을 수행 하는 애벌레의 적절 한 숫자를 얻기 위해 조치를 취할 중요 하다. 전 달걀 누워 개선 하기 위해 2-3 d에 대 한 효 모 붙여넣기 포함 된 튜브에 파리를 먹이 포함 됩니다. 튜브 물 튜브를 포함 하는 쟁반에 배치 하는 식품의 수 분을 유지 하 고 촉진 효과 먹이 애벌레에 의해 정상적인 빛 어두운 주기에 노출을 허용 하는 동안 투명 한 플라스틱 가방에 포함 해야 합니다. 그러나, 누 룩 붙여 부드러운 파리 갇혀 될 수 없습니다. 유리병 당 여성의 수는 유전자 형에 따라 달라 집니다. W1118, 경우 일반적으로 12 ~ 여성 및 ~ 6 남성 3 h에 대 한 알 수 있도록 충분 한입니다. 두 개의 튜브는 일반적으로 단일 지향성 분석 결과 대 한 접시에 충분 한 애벌레 (유 충 100-200)를 제공 합니다. 비행 주식 야생-타입 보다 적은 알을 낳는 또는 부 화 애벌레의 비율 감소, 추가 (30-35/유리병)까지 추가 여성 및 남성.
<p class...

Thermotaxis는 모바일 동물 선택 가장 유리한 조건1,2,3환경 하에 고용 됩니다. 지나치게 뜨겁거나 차가운 기후 인 경우이 문제는 생존을 위해 생명 이다. 또한, 많은 동물 편안한 범위에서 온도에 아주 작은 차이에 민감한 고 이상적인 온도 환경. 이 같은 환경과 그들의 체온을 equilibrate 과일 파리 poikilothermic 유기 체에 대 한 특정 중요성 이다. 애벌레 thermotaxis 모니터링 분석 수단이 식별, Drosophila 일시적인 수용 체 잠재력 (TRP) 채널4,,56, 같은 분자 센서의 역할을 명확히 rhodopsins7,8와 ionotropic 수용 체 수용 체 (국세청)9, 다른 온도 범위와 온도 감도이 동물을 부여.
양방향 선택 테스트 애벌레6,7열 기본을 공부 하는 한 가지 방법은 제공 합니다. 분석 결과 수반 두 가지 온도 영역을 설정 하 고 다른 한쪽을 선택 하는 동물을 수 있습니다. 양방향 선택 테스트에서 결과 강력 하 고, 두 가지 옵션 사이의 온도 차이가 큰 경우 특히 수 있습니다. 또한, 각 분석 결과 두 그룹을 tabulating 포함, 데이터는 간단한 기본 색인으로 표현할 수 있습니다. 편리 하 고 양방향 선택 분석 실험의 단순 유전 스크린 의무가 있습니다. 그러나, 주요 한계는 많은 실험은 야생-타입 또는 돌연변이 동물의 원하는 온도 설정 하는 데 필요한입니다.
그라데이션 분석 결과 단일 분석 결과8원하는 온도 설정할 기회를 제공 합니다. 연속 범위의 온도 직면할 때 또한, 양방향 선택 테스트와는 달리 그것은 동물의 그룹의 분포의 평가 허용. 한 그라데이션 분석 결과 페 트리 접시를 사용 하 여 단일 동물 이며 개별 동물10의 상세한 동작을 특성화 하는 데 적합 합니다. 그러나, 접시 라운드 이기 때문에, 온도 영역의 크기 변화 하 고 중심 으로부터 거리에 따라 점차적으로 작은. 따라서,이 설정 온도 선택의 동물의 인구를 모니터링에 이상적입니다.
애벌레의 그룹의 온도 선호를 평가 하기 위해 적합 한 연속 열 그라데이션 기구 직사각형 경기장을 고용 하 고 여기 설명. 기구는 생성 하 고 조립 하기 쉽습니다. 또한, 그라데이션, 선형 이며 유연 하 고, 42 ° c에 10 ° C에서 큰 온도 범위 동안 thermotaxis를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다. 분석 결과 신속 하 고 간단 하 게 수행 하 고 재현 가능한 데이터를 생성 합니다. 애벌레의 선호 온도 보고, 뿐만 아니라 그것은 하나의 실험에서 전체 선형 범위 동물의 인구의 환경 설정을 보여준다. 이러한 장점으로 인해 thermotaxis에 필요한 유전자를 식별 하는 데 탁월한 선택 이다.

<table><tbody><tr><td>Gradient assay apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, 냉장/가열식 6L 순환 수조</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>이 모델은 단종되었습니다. 업데이트된 교체 모델에는 120V, 60Hz용 1186R00 및 1197U04 또는 240V, 50Hz용 1184L08 및 1197U04가 포함됩니다.</td></tr><tr><td>알루미늄 분석 플레이트(단방향 구배용)</td><td></td><td></td><td>외부 크기: 14 x 10.1 x 0.9cm, 내부 크기: 12.9 x 8.7 x 0.8cm, 검은색 아노다이징 처리.</td></tr><tr><td>알루미늄 플레이트(양방향 그라디언트용)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0.2cm, 검은색 아노다이징 처리.</td></tr><tr><td>알루미늄 블록</td><td></td><td></td><td>외부 크기: 25.5 x 5 x 1.4cm, 내부 채널의 매개변수는 그림 1D에 나와 있습니다.</td></tr><tr><td>알루미늄 블록 및 튜빙용 커넥터</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 위생 실리콘 튜빙</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" 벽</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Items 및 분석용 시약</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유봉</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브용 유봉</td></tr><tr><td>온도계</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>열전대</td><td></td><td>Fluke K형</td><td></td></tr><tr><td>범용 마이크로플레이트 뚜껑</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>35mm 접시</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>라벨링 테이프 (양방향 구배용)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Fisherbrand 라벨링 테이프 2 in x 14 yds</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>1% 용액 준비</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389-5KG</td><td>분석 시작 직전 18% 용액 준비</td></tr><tr><td>페인트 브러시</td><td>Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리 튜브</td><td>Denville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500mL 원형 입이 넓은 병</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기(300mm 기공)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>유충 세척용 옵션 항목</td></tr><tr><td>판지 상자(바이알 트레이)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>Drosophila 식품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td></td><td></td><td>22,400 mL</td></tr><tr><td>옥수수 가루, 노란색 (극세 메쉬, 플록) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1,609 g</td></tr><tr><td>맥주 효모 100 lbs</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg; 콩가루(10kg/단위)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221g</td></tr><tr><td>초파리 한천, II형(5kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190g</td></tr><tr><td>Karo light 옥수수 시럽</td><td>Karo</td><td></td><td>1,700mL</td></tr><tr><td>메틸 4-하이드록시벤조에이트(200프루프 에탄올에 현탁)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72g/240mL</td></tr><tr><td>프로피온산 퓨리스. pa,>99.5%(GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>인산&nbsp; ACS 시약, &ge; 85 wt. H2O 시</td><td>그마 Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8.5 mL</td> 중 %</tr></tbody></table>

초파리 애벌레의 열 환경 설정을 결정 하는 온도 분석 결과

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

많은 동물, 과일 파리, 초파리 melanogaster를 포함 하 여 차별 분 차이 환경 온도를 선호 그들의 열 조를 찾아 그들을 가능 하 게 할 수 있다. 애벌레의 온도 환경 정의 된 선형 범위를 정의 하려면 우리는 온도 기울기를 사용 하 여 분석 결과 개발 했다. 단일 지향성 그라디언트를 설정 하려면 두 개의 알루미늄 블록 독립 물 탕, 각각의 개별 블록의 온도 제어에 연결 됩니다. 해당 하위 및 상위 제한을 설정 하는 두 개의 블록. 온도 기울기는 접시에 걸쳐 그들 사이의 거리는 두 물 제어 블록 위에 agarose 코팅 알루미늄 플레이트를 삽입 하 여 설정 됩니다. 끝 물 블록 위에 설정 된 알루미늄 플레이트의 최소 및 최대 온도 정의 하 고 지역 사이 선형 온도 기울기를 형성 하는 두 개의 블록. 그라데이션 분석 결과 다른 연령대의 애벌레에 적용할 수 있는 고 고기, 인코딩 TRP 채널 및 opsins, 온도 차별에 필요한 유전자에 영향을 미치는 돌연변이 등을 전시 하는 돌연변이 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.

18 °-28 ° C 단일 방향 설정 그라데이션, 우리 두 물 탕의 온도를 설정 16.8 ° C와 31 ° C 우리는 agarose 젤 표면 (그림 2C, 2E)의 극단적인 끝에 모든 6 영역, 영역 사이의 테두리 라인의 상단과 하단에서 26 위치에서 온도 측정 하 여 13 지점에서 온도 얻을. 그라데이션에 따라 온도 분포는 거의 선형 (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (그림 2E).
우리는 다양 한 연령대에서 제어 (w1118) 애벌레의 온도 선호를 분석. 1세인트 (24 ± 1.5 h AEL), 2nd</su...

여기, 우리는 연속 열 그라디언트를 사용 하 여 초파리 애벌레의 기본 환경 온도 결정 하는 프로토콜 제시.

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

이 방법은 초파리 멜라노가스터(drosophila melanogaster)와 같은 동물이 선호하는 환경 온도를 선택하는 메커니즘인 체성감각(somatosensation) 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연속적인 온도 범위에 직면했을 때 단일 분석에서 유충 그룹의 선호하는 온도를 설정할 수 있다는 것입니다. 초파리 유충의 온도 선호도에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도 impress plate는 벌레, 예쁜꼬마선충과 같은 다른 모델 유기체와 함께 사용하도록 조정할 수도 있습니다.먼저 이스트 페이스트를 만들어 십자가용 바이알을 준비합니다. 증류수에 효모 알갱이를 섞어 유봉으로 반죽으로 갈아서 만듭니다. 그런 다음 음식 표면 바로 위에 있는 표준 초파리 바이알의 내벽 가까이에 효모 페이스트를 약간 추가합니다.유충을 생산하려면 12-35 마리의 암컷과 최대 절반의 수컷을 수집하지만 10 마리를 넘지 마십시오. 효모 페이스트가 함유된 바이알에 이러한 그룹을 결합합니다. 준비된 바이알을 100바이알 트레이에 넣습니다.습도를 제공하기 위해 트레이에 물이 담긴 열린 바이알 20개를 포함합니다. 그런 다음 트레이를 투명한 비닐 봉지에 밀봉하고 섭씨 25도에서 48시간 동안 배양합니다. 48시간 동안 먹이를 주고 짝짓기를 한 후 파리를 새 먹이 유리병으로 옮겨 알을 모으십시오.탭하세요. 이산화탄소를 사용하지 마십시오. 그런 다음 파리가 섭씨 25도에서 3시간 동안 알을 낳도록 합니다.나중에 성충을 제거하고 계란이 들어 있는 바이알을 물병과 함께 트레이에 다시 넣고 백을 닫습니다. 그런 다음 섭씨 25도에서 알을 원하는 유충 단계로 발달시킵니다. 단방향 그래디언트를 준비하려면 먼저 분석을 위한 인간 주변 환경을 만듭니다.별도의 수조에 연결된 두 개의 알루미늄 블록을 젖은 종이 타월 위에 10cm 간격으로 놓습니다. 수조는 미리 예열해야 합니다. 다음으로, 100ml의 1%아가로스를 만들고 평평한 표면의 각 분석 플레이트에 25ml를 추가합니다.아가로스가 굳으면 멜라민 스펀지로 표면을 부드럽게 문질러 표면을 약간 거칠게 만듭니다. 그런 다음 효율적인 온도 전달을 촉진하기 위해 분석 플레이트의 알루미늄 블록 사이의 틈을 스프레이 병에서 전달된 물로 채웁니다. 이제 알루미늄 블록에 분석 플레이트를 놓고 경계가 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치하도록 양쪽 가장자리에서 2cm인지 확인합니다

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