Name: Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 학습하세요 단일 분자 수준에서 DNA-단백질 상호작용을 시각화하는 TIRFM 기법을 활용한 방법입니다. 수정된 λ DNA와 퀀텀닷 표시 단백질을 사용하여 분자 역학을 연구할 수 있습니다.

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우리 닥터 하 산 Yardimci 감사 하 고 종류의 프랜시스 크릭 연구소의 Dr.Sevim Yardimci 도움이 단일 분자 실험에의 컬럼비아 대학, 박사 에릭 C. 그린의 연구소에서 박사 다니엘 Duzdevich 박사 유지 북경 대학교의 태양과의 Chunlai 첸 박사 칭화 대학 유용한 토론에 대 한입니다. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 31371264, 31401059, CAS 혁신 팀과 뉴턴 고급 친교 (NA140085)에서 왕 사회에 의해 지원 되었다.

1. λ-ARS317 DNA 기판의 준비
<ol><li>DNA 기판 건설 및 포장<ol>
<li>소화 Xho을 사용 하 여 네이티브 λ DNA 나 효소; ARS317 신진의 genomic DNA에서 20를 포함 하는 뇌관을 사용 하 여 효 모 543 bp DNA 조각 베어링 증폭 bp 동종 시퀀스의 업스트림 및 다운스트림 Xho나 람다 DNA에서 효소 사이트. 추가 100 ng Xho의 λ DNA와 10 소화 DNA의 ng 동종 재결합 반응 시스템, 10 µ L를 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 반응을 품 어.</li>
		<li>재결합 λ DNA 패키지, 재결합 제품으로 람다 포장 추출의 25 µ L을 추가 하 고 90 분 30 ° C에서 반응을 품 어. 그런 다음 람다 포장 추출 반응 관에의 한 추가 25 µ L를 추가 합니다. 계속 품 어 90 분 30 ° C에서 반응.</li>
		<li>반응 시스템에 살 균 희석 버퍼 (10 mM Tris HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 m m MgCl2)의 500 µ L을 추가 하 고 부드럽게 튜브를 거꾸로 여러 번 설정 하 여 혼합. 클로 프롬의 25 µ L을 추가 하 고, 부드럽게 혼합, 4 ° c.에 저장</li>
		<li>포장 된 살 균 소의 100 µ L 및 100 µ L 세균 LE392MP의 추가 (0.8-에서 교양 1.0 파운드 매체 10 mm MgSO4추가 사용 하 여) 새로운 튜브로. 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>4 mL oftop agar (파운드 매체 + 0.7% agar 10mm MgSO4, 48 ° C에 냉각)으로 살 균 소 박테리아 혼합물의 200 µ L를 추가 합니다. 즉시 튜브를 거꾸로 여러 번 설정 하 여 혼합 하 고 미리 따뜻하게 (37 ° C) 파운드 접시에 부 어.</li>
		<li>37 ° C에서 접시를 밤새 품 어 그리고 λ-ARS317 패 PCR를 사용 하 고 시퀀싱 화면.</li>
	</ol>
</li>
	<li>액체 lysates11,18 에서 DNA 기질 정화<ol>
<li>살 균 ddH2O 10 m MgCl2 와 10 nM CaCl2의 200 µ L로 한 패를 선택 합니다. 200 µ L의 박테리아 LE392MP (파운드 매체에서 교양된 하룻밤)와 함께 혼합 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>NZCYM의 100 mL에 박테리아 살 균 소 혼합물을 추가 (10 g/L 뉴질랜드-아민, 5 g/L 효 모 추출 물, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino의, 그리고 2 g/L MgSO4·7H2O) 37 ° c.에 7 h에 대 한 문화와 매체 문화에 클로 프롬의 250 µ L을 추가 하 고 다른 10 분 동안 흔들어.</li>
		<li>200 mL 플라스 크에 문화를 전송 합니다. NaCl (1 M 최종 농도)의 5.8 g를 추가 하 고, 해산 저 어 30 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>셀 파편 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심. 200 mL 플라스 크에는 상쾌한을 수집 하 고 10% 말뚝8000 (m/V) 추가. 자석 교 반 장치에 의해 해산 하 고 30 분 이상 얼음에 품 어 저 어.</li>
		<li>살 균 소 침전에 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심. 제거는 상쾌한.</li>
		<li>살 균 소 희석 버퍼의 2 mL에 침전을 resuspend. 15 mL 튜브로 전송 하 고 RNase (최종 농도 20 µ g/mL)의 10 µ L 및 DNase (최종 농도 5 µ g/mL)의 40 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>0.3의 2 개 mL를 추가 M Tris HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1.25 %SDS, 15 µ L 성분 K (최종 농도 10 µ g/mL). 10 분 동안 65 ° C에서 품 어.</li>
		<li>사전 냉각된 칼륨 아세테이트 (3 M, pH 4.8)의 2 개 mL를 추가 하 고 10 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.</li>
		<li>불용 성 물질을 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 8000 x g에서 원심.</li>
		<li>에 상쾌한 소 프로 파 놀의 0.7 x 볼륨을 추가 합니다. 거꾸로 여러 번 튜브를 설정 하 여 혼합 하 고 실내 온도 (RT)에 2 분 동안 품 어.</li>
		<li>DNA를 침전 하는 RT에 10 분 동안 8000 x g에서 원심. 제거는 상쾌한.</li>
		<li>일단 70% 에탄올 10 분에 대 한 8000 x g에서 원심 분리 하 여 제거는 상쾌한 DNA를 씻어.</li>
		<li>부드럽게, 500 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 m m EDTA, pH 8.0)를 사용 하 여 DNA elute 그리고 1.5 mL 튜브에 DNA를 전송.</li>
		<li>두 번 페 놀을 사용 하 여 DNA를 추출: 10 분에 대 한 8000 g에서 원심 분리 하 여 클로 프롬.</li>
		<li>0.7 x 볼륨 소 프로 파 놀과 침전. 거꾸로 튜브, 부드럽게 내려와 10 분 동안 8000 x g에서 원심 회전 하 여 혼합.</li>
		<li>한 번 70% 에탄올으로 씻어, 테의 200 µ L에서 resuspend. DNA 농도 측정 하 고 12.5 µ g aliquots에-20 ° C에서 저장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
<ol><li>Biotinylated oligonucleotides phosphorylate를 (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-비오 틴-3') 출신의 왼쪽된 끝에 보완 λ DNA, oligonucleotides ddH2O, 1 µ L의 리가 버퍼, x 10의 7.5 µ L, T4 PNK의 0.5 µ L의 1 µ L (100 µ M)를 추가. 3 h 37 ° C에서 반응을 품 어.</li>
	<li>Λ-ARS317 phosphorylate, λ-ARS317의 12.5 µ g, 3 µ L 리가 버퍼 x 10의 추가, T4 PNK ddH2O 30 µ L의 총 볼륨의 1 µ L 3 h 37 ° C에서 반응을 품 어.</li>
	<li>Λ-ARS317와 oligonucleotides anneal, phosphorylated oligonucleotides의 0.5 µ L, ddH2O, phosphorylated λ-ARS317 관에 10 × 리가 버퍼의 25 µ L의 195 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 거꾸로 설정 하 여 혼합 하 고 65 ° C 블록 히터, 고 하자 블록에 33 ° C 아래에 샘플 쿨 5 분 턴에서 품 어.</li>
	<li>Λ-ARS317와 oligonucleotides 선, T4 DNA 리가의 1 µ L와 ATP (200 m m)의 0.63 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 거꾸로 설정 하 여 혼합 하 고 하룻밤 실 온에 2 시간 또는 4 ° C에서 품 어. 1 개월에 4 ° C에서 저장 합니다. 참고: 헤어 지는 DNA를 방지 하려면 모든 혼합 단계 할 수 하 여 부드럽게 튜브 거꾸로, 펫을 사용 하 여 혼합 하는 대신.</li>
</ol>3. Coverslip 청소 및 기능화
<ol><li>청소 하는 Coverslip<ol>
<li>4 착 색 항아리 (5 coverslips/병)에 장소 20 coverslips 에탄올, 30 분 동안 sonicate 고 초순 H2O 3 시간 coverslips를 헹 굴.</li>
		<li>1 M 수산화 칼륨 (KOH), 30 분 동안 sonicate 고 초순 H2O 3 시간 coverslips를 헹 굴. 에탄올 및 코 쥡니다 한 번 반복 합니다.</li>
		<li>30 분 동안, 아세톤과 sonicate 고 다음 초순 H2O 철저 하 게 린스 (3 번 이상). 참고: 아세톤 제거 해야 합니다 철저 하 게 rinsing 초순 H2O, 여 때 실수로 고생 솔루션 (아세톤) 등 유기 용 매 혼합 폭발이 발생할 수 있기 때문에14.</li>
		<li>피 라 솔루션에는 coverslips를 배치 (H2의 3:1 혼합 등4 과 30% H2O2)와 1 시간 동안 95 ° C에 품 어. 참고: 피 솔루션은 높은 활력과 침식, 그래서 신중 하 게 사용. 준비할 때 피 솔루션, 500 mL 유리 비 커에 H2O2 의 50 mL를 먼저 추가 하 고 그래서 H2의 150 mL를 추가 합니다4 비 커에 천천히.</li>
		<li>5 번 초순 H2O coverslips를 헹 구 십시오. 다음 각 coverslip 초순 H2O 3 비 커 가득 초순 H2O를 사용 하 여 철저 하 게 세척 하 고 건조 coverslip는 coverslip의 가장자리에서 종이 사용 하 여. 얼룩 항아리에는 coverslip를 놓고 30 분 동안 coverslip 110 ° C 오븐에서 철저 하 게 건조 합니다.<ol>
<li>메탄올을 가진 coverslip 린스 고 얼룩 단지 110 ° C 오븐을 다시는 coverslip 철저 하 게 건조 합니다. 참고:는 coverslip 철저 하 게 건조 매우 중요 하다, 물19존재는 일단 항 가능한 표면 구조를 많이 있을 것 이다 때문에.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip 기능화<ol>
<li>실 란 솔루션의 70 mL을 추가 (93% 메탄올, 아세트산, % 및 2 %5 항) 각 항아리에 뚜껑을 나사와 하룻밤 실 온에서 항아리를 두고.</li>
		<li>워시와 3.1.5, 건조 오븐에서 그들을 배치 하는 대신 철저 하 게 질소 가스를 사용 하 여 coverslips를 제외 하 고 단계에 설명 된 대로 coverslips를 건조.</li>
		<li>0.1 m M 신선한 만든 NaHCO3 (pH 8.2) 1 mL에 150mg mPEG (methoxy-폴 리 에틸렌 글리콜)의 biotin-말뚝 (biotin-폴 리 에틸렌 글리콜)의 6 mg를 철저 하 게 분해. 17 다음 원심 분리기, 불용 성 못을 제거 하는 1 분 동안 000 x g. 참고: 갓 만든된 NaHCO3 은 준비; pH를 조정할 필요가 있다.</li>
		<li>상자에 silanized coverslips를 놓고 두 개의 작은 coverslips silanized coverslips의 두 끝 위에 넣어. 100 µ L silanized coverslip의 중앙에 못 솔루션의 플라스틱 그리고 다른 silanized coverslip 상단에 배치.</li>
		<li>습기가 유지 상자에 일부 초순 h 조2O를 추가 하 고 어둠 속에서 적어도 3 h 말뚝 솔루션 coverslips를 품 어. 야간 보육도 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>Coverslip 쌍을 분리 하 고 기능성된 표면 얼굴 유지, 린스 초순 h 조2O를 사용 하 여 광범위 하 게, coverslips 질소 가스와 함께 그들을 건조.</li>
		<li>표시 마커 펜, 기능성된 측면 얼굴, 상자에 넣어에 저장 하는 상자 진공 desiccator 1 개월 유지를 사용 하 여 모서리 중 하나에 coverslips의 기능성된 측면.</li>
		<li>긴 시간 동안에 coverslips를 저장 하 한 coverslip 모자에 1 개의 구멍을 뚫고 50 mL 튜브에 다음 비닐 봉지에 튜브를 넣어 놓고 진공 실러를 사용 하 여 가방을 봉인 합니다. 이 방법에서는, coverslips는 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 약 3 개월.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 흐름 셀 조립
<ol><li>양면 테이프 (30 m m × 12 m m)는 주먹을 사용 하 여 조각의 센터에서 15 m m × 2 m m 채널을 절단.</li>
	<li>양면 테이프의 종이 쪽을 벗기십시오 고 두 개의 구멍을 유리 슬라이드에 붙여 넣습니다. 기포 제거를 누릅니다. 우리의 경험을 바탕으로, 그것은 쉽게 양면 테이프의 플라스틱 측면 보다 종이 쪽을 벗 하 여 기포를 제거 하.</li>
	<li>4 기능성된 coverslip (60 m m × 24 m m)를 잘라 조각 (30 × 12 mm) 다이아몬드로 만들어진 유리를 사용 하 여 학자, 하 고 질소 가스를 사용 하 여 파편을 제거. 기능성 유지 해야 측면 얼굴.</li>
	<li>이중 면 테이프의 플라스틱 면을 벗기십시오 고 기능성된 coverslip에 슬라이드를 붙여 넣습니다. 기포는 coverslip와 테이프를 제거 하려면을 살짝 누릅니다. 철저 하 게 공기 방울을 제거 버퍼 했다 그것으로 펌핑 하는 동안 누출에서 흐름 세포를 보호할 수 있습니다.</li>
	<li>입구와 출구 배관에 삽입 작은, 큰 구멍, 각각. 에폭시를 사용 하 여 튜브를 수정 합니다.</li>
	<li>Streptavidin (0.2 mg/mL)의 20 µ L 주사기를 사용 하 여 수동으로 흐름 세포로 펌프 하 고 10 분 동안 RT에서 품 어. 블로킹 버퍼10 streptavidin, 대체 흐름 세포로 펌프 그리고 실내 온도에서 보관.</li>
</ol>5. 단일 분자 시각화
<ol><li>532 nm 레이저와 640 nm 레이저를 사용 하 여 동시 여기 빨간색과 형광 현미경 테스트 슬라이드 # 1에서 a 5와 빨강의 초점 맞춤 얻을. 듀얼 파장 광학 (참조 테이블의 재료)를 분할 이미지를 생산.</li>
	<li>흐름 세포를 현미경에 놓고 10 mL 스프링 자동된 주입/철수 프로그래밍 가능 펌프에 설치 된 더 이상 배관 연결 콘센트 배관 연결. 참고: 주사기를 흐름 셀의 입구 배관에서 버퍼를 인출 하는 방법 아래에 언급 하는 흐름 셀으로 버퍼를 펌핑.</li>
	<li>공기를 신속 하 게 제거 하 여 흐름 셀에 버퍼 차단이 되었는지 확인 흐름 셀에 500 µ L/min에서 블로킹 버퍼를 펌프. 그리고 흐름 세포에 200 µ L/min에서 블로킹 버퍼를 펌프 콘센트 튜브 입구 배관 및 흐름 셀에서 기포를 완전히 제거를 플립. 참고: 모든 버퍼 흐름 셀으로 펌핑 해야 될 degassed 진공 desiccator에 사용 하기 전에 적어도 15 분 동안.</li>
	<li>블로킹 버퍼의 80 µ L로 biotinylated λ-ARS317 DNA의 0.5 µ L을 추가 하 고 2 분 25 µ L/min 흐름 셀에 펌프. 다음 50 µ L/분의 속도로 차단 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 λ-ARS317 DNA 플러시.</li>
	<li>흐름 세포에 블로킹 버퍼를 제거 하 50 µ L/min의 속도로 버퍼10 바인딩 200 µ L 펌프.</li>
	<li>0.2 µ L streptavidin 입히는 Qdot705 (1 µ M)의 추가 및 biotinylated 오크의 0.2 µ L (1.2 µ M) 튜브로 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 다음 버퍼 튜브에 바인딩 20 µ L을 추가 하 고 얼음에 놓습니다. 오크 Qdot705 의 최종 농도 약 10 nM.</li>
	<li>2 µ L 오크 Qdot705 의 추가 (10 nM), DTT (100 m m), 바인딩 버퍼의 96 µ L로 ATP (200 m m)의 1 µ L의 1 µ L. 오크 Qdot705 의 최종 농도 0.2 nM.</li>
	<li>흐름 셀에 10 µ L/min의 속도로 0.2 nM 오크 Qdot705 의 20 µ L를 펌프. 100 µ L/min의 속도로 바인딩 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 과도 한 오크 Qdot705 의 밖으로 플러시. 다음 100 µ L/min의 속도로 DNA 기판 얼룩 흐름 셀으로 30 nM SYTOX 오렌지 펌프 바인딩 버퍼.</li>
	<li>오크 Qdot705 신호를 자극 하 고 SYTOX 오렌지 스테인드 DNA 신호 각각 405 nm 레이저와 532 nm 레이저를 사용 하 여. 쿼드-밴드 대역 통과 필터 (FF01-446/510/581/703-25)를 사용 하 여 100 µ L/min 흐름으로 신호를 동시에 관찰 하 고 프레임 당 100 ms와 EM CCD로 이미지를 기록 합니다. 다양 한 분야에서 20 이미지 스택을 수집 합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>캘리포니아 대학교 샌 프란 시스 코 박사 론 베일의 연구소에 의해 개발 된 이미지 플러그인 (OI_cut_RGBmerge)를 기반으로 하는 새로운 플러그인, 스스로 의해 수정 되는 피지 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 자르기.<ol>
<li>이미지 (512 × 512 픽셀)의 스택 이미지 (256 × 256 픽셀)의 2 개 더미로 자르기. 하나는 532 nm 레이저 흥미로운 결과, 그리고 다른 한 405 nm 레이저 흥미로운 결과.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피지-이미지-스택-Z 프로젝트 (평균 강도)를 사용 하 여 61 순차적인 이미지를 처리 합니다.</li>
	<li>측정 길이 (LDNA) DNA와 dna의 DNA에 오크 Qdot705 (L오크) 바인딩 사이트에서 거리의 끝을 수동으로 곁.</li>
	<li>L오크/LDNA 의 결과 계산을 사용 하 여 excel r, 부트스트랩 메서드를 사용 하 여 데이터를 분석 그리고 히스토그램을 생성, 가우스 배급에 맞게.</li>
</ol>

<ol><li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 선물이 Qdot 표시 된 단백질 및 흐름 셀에서 TIRFM는을 사용 하 여 site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 관찰 하는 프로토콜. 필요한 단계는 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름-세포 준비, 및 단일 분자 이미징 사이트 수정 포함 됩니다. 주목 해야 한다 두 가지 요점을 확인 하 고 있습니다. 첫째, λ DNA와 관련 된 단계, 예를 들어, 어떤 가능한 손상 감소를 부드럽게 조작 해야 모든 반복적으로 아래로 pipetting으로 혼합을 피하. 둘째,는 coverslip 충분히 깨끗 하 고는 배경 잡음을 최소화 되도록 매우 중요 하다. Coverslip 청소 및 기능화 과정 물, 초순 수준에 도달 해야 하며 공기 먼지 무료. Coverslip 기능화 및 흐름 셀 조립 깨끗 한 벤치에서 실시 하는 것이 낫다.
단백질 DNA 상호 작용을 공부에 대 한 단일 분자 분석 실험,...

단백질 및 DNA 사이 상호 작용, DNA 복제, DNA 수리, 전사 등 많은 복잡 한 생물 학적 과정에 필수적입니다. 기존의 접근 이러한 프로세스의 속성에 빛을 발산가, 비록 많은 키 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 최근, 급속 하 게 발전 한 분자 기술로 메커니즘의 일부 해결된1,2,3되었습니다.
주로 단백질 DNA 상호 작용을 실시간으로 시각화에 단일 분자 형광 현미경 검사 법의 응용 프로그램의 형광 탐지 및 형광 프로브 개발에 따라 달라 집니다. 단일 분자 연구를 위해 그것은 형광 탐지 시스템은 주로 상업적으로 사용할 수 있기 때문에 적합 한 형광 프로브 관심사의 단백질을 분류 하는 것이 중요.
형광 단백질 분자 생물학에 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 낮은 형광 밝기 및 photobleaching에 대 한 안정성 많은 단일 분자 분석에 응용 프로그램을 제한합니다. 양자 점 (Qdots)는 작은 발광 나노 입자4. 그들의 독특한 광 속성으로 인해 Qdots은 10-20 배 더 밝다 고 몇 천 배 더 많은 안정 보다 널리 사용 되는 유기 염료5. 또한, Qdots 있다 큰 Stokes shift (여기 및 방출 봉우리의 위치 사이의 차이)5. 따라서, Qdots 동안 양적 분석에서 이용 될 수 없습니다 오랜 관찰 (시간 분) 및 높은 신호 대 잡음 비율, 이미지의 수집에 대 한 사용할 수 있습니다.
날짜 하려면, site-specifically Qdots와 대상 단백질을 분류 하는 방법은 두 가지: Qdot 활용 된 주 또는 보조 항 체6,,78;의 원조로 또는 대상 단백질 Qdots와 직접, biotin와 streptavidin9,10,11,,1213사이 강한 상호 작용을 기반으로 라벨. Qdots Streptavidin 입히는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리의 최근 연구에서 site-specifically biotinylated 단백질을 높은 효율으로 신진 효 모에 BirA Avi 태그 단백질의 공동 overexpression에 의해 정화 되었다 vivo에서10. 다음 하 고 단일 분자 분석 실험14,15,,1617최적화, 단일 분자 수준의 사용에 Qdot 표시 된 단백질 및 DNA 사이 상호 작용 관찰 TIRFM10.
여기, 우리가 선택한 신진 관심사의 우리의 단백질으로 원래 인식 복잡 한 (오크)을 구체적으로 인식 하 고 자율적으로 복제 시퀀스 (ARS)에 바인딩할 수, 효 모. 다음 프로토콜 TIRFM를 사용 하 여 Qdot 표시 된 오크 ARS와의 상호 작용을 시각화 하는 단계별 절차를 제공 합니다. Site-specifically 수정된 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름 셀 어셈블리 및 단일 분자 이미징의 준비는 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>람다 DNA</td><td>뉴 잉글랜드 Biolabs</td><td>N3011</td><td>저장소 25 &mu; L 분취량은 -20 &ordm;C입니다.</td></tr><tr><td>XhoI 효소</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0694</td><td></td></tr><tr><td>신속 융합 클로닝 키트</td><td>Biotool</td><td>B22611</td><td></td></tr><tr><td>MaxPlax Lambda Packaging Extracts</td><td></td><td>Epicentre MP5110</td><td>Bacterial strain LE392MP 이 이 패키지에 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., 주식 회사</td><td>10013092</td><td>모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>베이징 화학 작품</td><td>N/A</td><td>모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NZ-amine</td><td>Amresco</td><td>J853-250G</td><td></td></tr><tr><td>카사미노산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Beyotime</td><td>ST483</td><td></td></tr><tr><td>자기 교반 장치</td><td>IKA</td><td>KMO2 basic</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Eppendorf tube</td><td>Eppendorf</td><td>30122151</td><td>15 mL, sterile, bulk, 500pcs</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>SIGMA</td><td>D5319-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>0706-100MG</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제, T4 DNA 리가제, 반응 완충액 (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22266882</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sinopharm 화학 시약 유한 공사</td><td>10009259</td><td></td></tr><tr><td>수산화 칼륨 (KOH)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>306568-100G</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>열 피셔 사이언티픽</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sinopharm 화학 시약 유한 공사</td><td>80120891</td><td>황산</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sinopharm 화학 시약 10011218</td><td></td><td>30% 과산화수소</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>V900798</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>mPEG (메톡시-폴리에틸렌 글리콜)</td><td>리산</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>비오틴-PEG (비오틴-폴리에틸렌 글리콜)</td><td>Lysan</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>진공 건조기</td><td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td><td>IPC250-1</td><td></td></tr><tr><td>진공 실러</td><td>MAGIC SEAL</td><td>WP300</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 팁 유리 스크라이브</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>70036</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>세일 브랜드</td><td>7101</td><td></td></tr><tr><td>입구 튜브</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/2</td><td>내경 0.38mm, 외경 1.09mm.</td></tr><tr><td>출구 튜빙</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/4</td><td>내경 0.76mm, 외경 1.22mm.</td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL620001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>에폭시</td><td>LEAFTOP</td><td>9005</td><td>5분 에폭시</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>주입/철수 프로그래밍 가능한 펌프</td><td>Harvard 장치</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>532nm 레이저</td><td>Coherent</td><td>사파이어 -532-50</td><td></td></tr><tr><td>640 nm 레이저</td><td>Coherent</td><td>OBIS-640-100</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>W-View Gemini Imaging 분할 광학</td><td>Hamamatsu photonics K.K.</td><td>A12801-01</td><td></td></tr><tr><td>TIRF 조명 시스템</td><td>올림푸스</td><td>IX2-RFAEVA2</td><td></td></tr><tr><td>60&times; TIRF 대물렌즈</td><td>올림푸스</td><td>APON60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>쿼드 에지 레이저 이색성 빔스플리터</td><td>Semrock</td><td>Di01-R405/488/ 532/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>쿼드 밴드 대역 통과 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/ 581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF649-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터</td><td>크로마 기술 Corp</td><td>ET585/65m</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET665lp</td><td></td></tr><tr><td>FocalCheck 형광, 현미경 테스트 슬라이드 #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F36909</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX 오렌지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Streptavidin Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10163MP</td><td>Store 4 &ordm에서; C, 얼지 마십시오.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Amresco</td><td>0220-25G</td><td>200 mM ATP 용액을 준비하고, ddH2O를 사용하여 pH를 7.0으로 조정하고, 10 &mu; L 분취량은 -20 &ordm;C입니다.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Amresco</td><td>M109-5G</td><td>ddH2O를 사용하여 1M 용액을 준비하고 10 &mu를 저장합니다. l -20 &ordm;C에서 부분 표본.</td></tr></tbody></table>

qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 site-specifically 수정된 λ dna 사이 상호 작용을 시각화

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

형광 현미경 검사 법 단일 분자 수준에서 복잡 한 생물 학적 과정의 메커니즘을 해 부에 큰 기여를 했다. 단일 분자 DNA 단백질 상호 작용을 공부에 대 한 분석에서 고려에 대 한 두 가지 중요 한 요소는: 쉽게 관찰 하 고 적합 한 형광 프로브는 단백질을 라벨에 대 한 충분 한 길이와 DNA 기질. 48.5 kb λ DNA DNA 기판에 대 한 좋은 후보입니다. 양자 점 (Qdots), 형광 프로브 클래스로 장기간 관찰 (시간 분)와 높은 품질 이미지 수집 수 있습니다. 이 논문에서는, site-specifically 수정된 λ DNA를 준비 하 고 라벨 streptavidin 입히는 Qdots와 대상 단백질을 포함 하는 단일 분자 수준에서 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜 선물이. 개념 증명에 대 한 우리 오크 (복잡 한 원산지 인정) 신진 효 모에 관심사의 단백질으로 선택한 TIRFM 사용 하는 ARS (자동으로 복제 시퀀스)와 상호 작용을 시각화 합니다. 다른 형광 프로브에 비해, Qdots photobleaching에 대 한 그것의 높은 안정성 때문에 단일 분자 연구에 분명 한 이점이 있다 하지만이 속성 양적 분석에 응용 프로그램 제한에 주목 한다.

Qdot 표시 된 오크는 ARS의 상호작용을 시각화 하려면 우리가 먼저 λ-ARS317 DNA 기판 건설. ARS317를 포함 하는 DNA 조각 통합 되었다 Xho에 내가 사이트 (33.5 kb) 네이티브 λ DNA의 동종 재결합 (그림 1A). 재결합 제품 추출 물을 사용 하 여 패키지 된 고 포장된 살 균 소 입자 파운드 플레이트 (그림 1B)에 경작 되었다. 긍정적인 살 균 소 패 PCR에 의해 상영 되었고 (그림 1C)을 시퀀싱에 의해 확인. Λ-ARS317 DNA는 액체 lysates (그림 1D)에서 순화 되었다.
단일 분자 ...

여기, 선물이 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) site-specifically 수정된 λ DNA 기판 및 양자 점 단백질 분류를 사용 하 여 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜.

Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

이 방법은 DNA 복제, 유전자 복구 및 염색체 구조 유지와 같은 DNA 단백질 상호 작용의 단일 분자 이미징 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 변형된 람다 DNA 높은 콜라겐을 얻은 다음 표지된 단백질을 신속하게 치료할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 플로우 셀 조립 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.커버 슬립을 청소하려면 4 개의 염색 병에 20 개의 커버 슬립을 넣고 에탄올을 붓고 에탄올에서 30 분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 커버슬립을 초순수로 세 번 헹굽니다. 다음으로, 1몰 수산화칼륨으로 커버슬립을 30분 동안 초음파 처리하고 초순수로 커버슬립을 세 번 헹굽니다.그런 다음 에탄올과 수산화 칼륨 초음파 처리를 한 번 반복합니다. 커버슬립을 아세톤으로 30분 동안 초음파 처리한 다음 초순수로 완전히 헹굽니다. 이제 커버슬립을 Piranha 용액에 넣고 섭씨 95도에서 1시간 동안 배양합니다.배양 후에는 초순수로 커버슬립을 5회 헹굽니다. 그런 다음 각 커버슬립을 초순수로 광범위하게 세척합니다. 종이를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 말리고 커버슬립을 염색 용기에 넣습니다.커버슬립을 섭씨 110도의 오븐에서 완전히 말리십시오. 이제 커버슬립을 메탄올로 헹구고 염색 용기를 섭씨 110도 오븐에 다시 넣어 커버슬립을 건조시킵니다. 커버슬립 기능화를 수행하려면 각 용기에 70ml의 실란 용액을 넣고 뚜껑을 조인 다음 용기를 실온에서 밤새 그대로 두십시오.초순수를 채운 세 개의 비커를 사용하여 커버슬립을 세척합니다. 질소 가스를 사용하여 커버슬립을 완전히 건조시킵니다. 메톡시-PEG 150mg과 비오틴-PEG 6mg을 갓 준비한 0.1몰 중탄산나트륨 1ml에 녹입니다.17, 불용성 나무못을 제거하는 1 분 동안 000 시간 g에 분리기. 이제 실란화된 커버슬립 중앙에 100마이크로리터의 PEG 용액을 피펫팅하고 상단에 다른 실란화된 커버슬립을 놓습니다. PEG 용액으로 커버슬립을 어둠 속에서 최소 3시간 동안 배양합니다.커버슬립 쌍을 분리하고 기능화된 표면이 위를 향하도록 합니다. 초순수를 사용하여 커버슬립을 광범위하게 헹구고 질소 가스로 건조시킵니다. 이제 마커 펜을 사용하여 모서리 중 하나에 있는 커버슬립의 기능화된 면을 표시합니다.캡에 하나의 구멍이 뚫린 50밀리리터 튜브에 커버슬립 하나를 넣습니다. 튜브를 비닐 봉지에 넣고 진공 밀봉기를 사용하여 봉지를 밀봉한 다음 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 플로우 셀(flow cell)을 조립하려면 펀처를 사용하여 양면 테이프 조각의 중앙에 있는 채널을 자릅니다.양면 테이프의 종이 면을 떼어내고 두 개의 구멍이 있는 유리 면에 붙입니다. 양면 테이프의 플라스틱 면보다 종이 면을 벗겨내면 기포를 제거하는 것이 더 쉽습니다. 테이프를 눌러 기포를 제거합니다.그런 다음 다이아몬드 팁 유리 스크라이브를 사용하여 기능화된 커버슬립을 4조각으로 자르고 기능화된 면이 위로 향하게 유지하여 질소 가스를 사용하여 파편을 제거합니다. 양면 테이프의 플라스틱 면을 떼어내고 기능화된 커버슬립에 슬라이드를 붙입니다. 부드럽게 눌러 커버슬립과 테이프 사이의 기포를 제거합니다.기포를 철저히 제거하면 버퍼가 펌핑되는 동안 플로우 셀이 누출되는 것을 방지할 수 있습니다. 이제 입구 튜브를 작은 구멍에 삽입하고 출구 튜브를 큰 구멍에 삽입합니다. 에폭시를 사용하여 튜브를 고정합니다.주사기를 사용하여 밀리리터당 0.2mg의 Streptavidin 20마이크로리터를 플로우 셀로 수동으로 펌핑하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 블로킹 버퍼를 플로우 셀로 펌핑하여 Streptavidin을 대체하고 실온에서 유지합니다. 532 나노미터 레이저와 640 나노미터 레이저를 사용한 동시 여기(excitation)를 통해 형광 현미경 테스트 슬라이드 1번에서 A5를 사용하여 적색과 근적외선의 초점 정렬을 얻습니다.splitting optics로 이중 파장 이미지를 생성합니다. 플로우 셀을 현미경에 놓고 배출 튜브를 자동 주입 인출 프로그래밍 가능 펌프에 설치된 10ml 스프링에 연결된 더 긴 튜브에 연결합니다. 블로킹 버퍼를 주입하고 배출구 튜브를 뒤집어 플로우 셀(flow cell)의 기포를 제거합니다.0.5마이크로리터의 비오틴화된 람다-ARS317 DNA를 80마이크로리터의 차단 완충액에 추가합니다. 준비된 혼합물을 2분 동안 분당 25마이크로리터의 속도로 플로우 셀(flow cell)로 펌핑합니다. 그런 다음 분당 50마이크로리터의 속도로 200마이크로리터의 차단 버퍼를 사용하여 lambda-ARS317 DNA를 플러시합니다.이제 분당 50마이크로리터의 속도로 200마이크로리터의 결합 버퍼를 펌핑하여 플로우 셀에서 차단 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 2마이크로리터의 ORC-Qdot705, 1마이크로리터의 DTT 및 1마이크로리터의 ATP를 96마이크로리터의 결합 완충액에 추가합니다. ORC-Qdot705의 최종 농도는 0.2 나노몰입니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 결합 완충액을 펌핑한 후 준비된 ORC-Qdot705 용액 20마이크로리터를 분당 10마이크로리터의 속도로 플로우 셀로 펌핑합니다. 분당 100마이크로리터의 속도로 200마이크로리터의 결합 버퍼를 사용하여 과도한 ORC-Qdot705를 씻어냅니다. 그런 다음 30나노몰 SYTOX Orange가 포함된 결합 버퍼를 플로우 셀에 펌핑하여 분당 100마이크로리터의 속도로 DNA 기질을 염색합니다.마지막으로 405 나노미터 레이저를 사용하여 ORC-Qdot705 신호를 여기하고 532 나노미터 레이저를 사용하여 SYTOX 오렌지 염색 DNA 신호를 여기합니다. 쿼드 밴드 대역 통과 필터를 사용하여 분당 100마이크로리터의 흐름으로 신호를 동시에 관찰합니다. 프레임당 100밀리초로 EMCCD로 이미지를 기록합니다.lambda-ARS317 DNA 기질의 그림이 여기에 나와 있습니다. Qdot705 표지 ORC는 405 나노미터 레이저에 의해 여기되었습니다. SYTOX 오렌지 염색 DNA는 532 나노미터 레이저에 의해 여기되었습니다.병합된 결과는 Qdot705 표지 ORC가 ARS317에서 결합함을 시사합니다. lambda-ARS317 DNA에 대한 ORC 결합 분포 결과는 ORC가 ARS317에서 높은 농도로 결합한다는 것을 보여줍니다. 이 절차에 따라 단백질-단백질 상호 작용 및 단백질 역학에 관한 추가 질문에 답하기 위해 단일 분자 FRET와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 단일 분자 형광 이미징 분야의 연구자들이 DNA 복제 및 DNA 복구 in vitro의 재구성 시스템에서 DNA 단백질 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. Piranha 솔루션으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 안면 보호 마스크 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 미래의 핵산 기반 치료제를위한 균일한 및 사용자 정의 polyplexes보다 제어하고 합성을 제공하는 것으로 예상된다 고분자 전해질의 polyplexes의 형성을 조사하기 위해 nanophotonics (QD - 걱정)와 microfluidics의 소설과 강력한 통합을 제시한다.

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

이 비디오는 단일 분자 이미징을 사용하여 특정 유전자 자리에서 DNA 분자의 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이러한 응축물은 LCD-LCD 및 LCD-DBD 상호 작용으로 인해 형성되며, 이를 통해 RNA 중합효소 II를 동원하고 유전자 전사를 향상시킬 수 있습니다.

DNA 커튼에서 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하기 위한 단일 분자 이미징

단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

정의된 길이의 포스포로티오에이트 DNA로부터 1가 표적 양자점(mQD)을 준비하기 위한 자세한 지침을 제공합니다. DNA 랩핑은 높은 수율로 이루어지므로 제품은 정제가 필요하지 않습니다. 당사는 SNAP 태그를 사용하여 mQD를 살아있는 세포 이미징 응용 분야에서 세포 표면 수용체로 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다.

생산 및 일가 양자점 타겟팅

전자 분광 이미징은 나노미터 해상도로 핵산과 단백질을 이미지화하고 구별할 수 있습니다. 이 시스템은 투과 전자 현미경 샘플에서 태그가 지정된 단백질을 특이적으로 라벨링할 수 있는 miniSOG 시스템과 결합할 수 있습니다. 이중 가닥 파단 복구 초점을 예로 들어 이러한 기술의 사용을 설명합니다.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

quantum-dot-labeled DNA와 total internal reflection fluorescence microcopy를 사용하여 unlabeled protein을 사용하면서 restriction endonucleases의 반응 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 이 단일 분자 기법을 사용하면 개별 단백질-DNA 상호 작용을 대규모로 다중화하여 관찰할 수 있으며, 데이터를 풀링하여 잘 채워진 체류 시간 분포를 생성할 수 있습니다.

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

이 프로토콜은 CMG helicase에 의한 DNA 풀림의 실시간 시각화를 위한 단일 분자 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. (1) DNA 기질 준비, (2) 형광 표지된 Drosophila melanogaster CMG helicase를 정제하는 방법, (3) 전반사 형광(TIRF) 현미경 검사를 위한 미세유체 플로우 셀을 준비하는 방법, (4) 단일 분자 DNA 풀기 분석에 대해 설명합니다.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

학습하세요 단일 분자 수준에서 DNA-단백질 상호작용을 시각화하는 TIRFM 기법을 활용한 방법입니다. 수정된 λ DNA와 퀀텀닷 표시 단백질을 사용하여 분자 역학을 연구할 수 있습니다.

Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

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