Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

여기, 선물이 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) site-specifically 수정된 λ DNA 기판 및 양자 점 단백질 분류를 사용 하 여 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜.

이 방법은 DNA 복제, 유전자 복구 및 염색체 구조 유지와 같은 DNA 단백질 상호 작용의 단일 분자 이미징 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 변형된 람다 DNA 높은 콜라겐을 얻은 다음 표지된 단백질을 신속하게 치료할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 플로우 셀 조립 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

커버 슬립을 청소하려면 4 개의 염색 병에 20 개의 커버 슬립을 넣고 에탄올을 붓고 에탄올에서 30 분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 커버슬립을 초순수로 세 번 헹굽니다. 다음으로, 1몰 수산화칼륨으로 커버슬립을 30분 동안 초음파 처리하고 초순수로 커버슬립을 세 번 헹굽니다.

그런 다음 에탄올과 수산화 칼륨 초음파 처리를 한 번 반복합니다. 커버슬립을 아세톤으로 30분 동안 초음파 처리한 다음 초순수로 완전히 헹굽니다. 이제 커버슬립을 Piranha 용액에 넣고 섭씨 95도에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후에는 초순수로 커버슬립을 5회 헹굽니다. 그런 다음 각 커버슬립을 초순수로 광범위하게 세척합니다. 종이를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 말리고 커버슬립을 염색 용기에 넣습니다.

커버슬립을 섭씨 110도의 오븐에서 완전히 말리십시오. 이제 커버슬립을 메탄올로 헹구고 염색 용기를 섭씨 110도 오븐에 다시 넣어 커버슬립을 건조시킵니다. 커버슬립 기능화를 수행하려면 각 용기에 70ml의 실란 용액을 넣고 뚜껑을 조인 다음 용기를 실온에서 밤새 그대로 두십시오.

초순수를 채운 세 개의 비커를 사용하여 커버슬립을 세척합니다. 질소 가스를 사용하여 커버슬립을 완전히 건조시킵니다. 메톡시-PEG 150mg과 비오틴-PEG 6mg을 갓 준비한 0.1몰 중탄산나트륨 1ml에 녹입니다.

17, 불용성 나무못을 제거하는 1 분 동안 000 시간 g에 분리기. 이제 실란화된 커버슬립 중앙에 100마이크로리터의 PEG 용액을 피펫팅하고 상단에 다른 실란화된 커버슬립을 놓습니다. PEG 용액으로 커버슬립을 어둠 속에서 최소 3시간 동안 배양합니다.

커버슬립 쌍을 분리하고 기능화된 표면이 위를 향하도록 합니다. 초순수를 사용하여 커버슬립을 광범위하게 헹구고 질소 가스로 건조시킵니다. 이제 마커 펜을 사용하여 모서리 중 하나에 있는 커버슬립의 기능화된 면을 표시합니다.

캡에 하나의 구멍이 뚫린 50밀리리터 튜브에 커버슬립 하나를 넣습니다. 튜브를 비닐 봉지에 넣고 진공 밀봉기를 사용하여 봉지를 밀봉한 다음 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 플로우 셀(flow cell)을 조립하려면 펀처를 사용하여 양면 테이프 조각의 중앙에 있는 채널을 자릅니다.

양면 테이프의 종이 면을 떼어내고 두 개의 구멍이 있는 유리 면에 붙입니다. 양면 테이프의 플라스틱 면보다 종이 면을 벗겨내면 기포를 제거하는 것이 더 쉽습니다. 테이프를 눌러 기포를 제거합니다.

그런 다음 다이아몬드 팁 유리 스크라이브를 사용하여 기능화된 커버슬립을 4조각으로 자르고 기능화된 면이 위로 향하게 유지하여 질소 가스를 사용하여 파편을 제거합니다. 양면 테이프의 플라스틱 면을 떼어내고 기능화된 커버슬립에 슬라이드를 붙입니다. 부드럽게 눌러 커버슬립과 테이프 사이의 기포를 제거합니다.

기포를 철저히 제거하면 버퍼가 펌핑되는 동안 플로우 셀이 누출되는 것을 방지할 수 있습니다. 이제 입구 튜브를 작은 구멍에 삽입하고 출구 튜브를 큰 구멍에 삽입합니다. 에폭시를 사용하여 튜브를 고정합니다.

주사기를 사용하여 밀리리터당 0.2mg의 Streptavidin 20마이크로리터를 플로우 셀로 수동으로 펌핑하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 블로킹 버퍼를 플로우 셀로 펌핑하여 Streptavidin을 대체하고 실온에서 유지합니다. 532 나노미터 레이저와 640 나노미터 레이저를 사용한 동시 여기(excitation)를 통해 형광 현미경 테스트 슬라이드 1번에서 A5를 사용하여 적색과 근적외선의 초점 정렬을 얻습니다.

splitting optics로 이중 파장 이미지를 생성합니다. 플로우 셀을 현미경에 놓고 배출 튜브를 자동 주입 인출 프로그래밍 가능 펌프에 설치된 10ml 스프링에 연결된 더 긴 튜브에 연결합니다. 블로킹 버퍼를 주입하고 배출구 튜브를 뒤집어 플로우 셀(flow cell)의 기포를 제거합니다.

0.5마이크로리터의 비오틴화된 람다-ARS317 DNA를 80마이크로리터의 차단 완충액에 추가합니다. 준비된 혼합물을 2분 동안 분당 25마이크로리터의 속도로 플로우 셀(flow cell)로 펌핑합니다. 그런 다음 분당 50마이크로리터의 속도로 200마이크로리터의 차단 버퍼를 사용하여 lambda-ARS317 DNA를 플러시합니다.

이제 분당 50마이크로리터의 속도로 200마이크로리터의 결합 버퍼를 펌핑하여 플로우 셀에서 차단 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 2마이크로리터의 ORC-Qdot705, 1마이크로리터의 DTT 및 1마이크로리터의 ATP를 96마이크로리터의 결합 완충액에 추가합니다. ORC-Qdot705의 최종 농도는 0.2 나노몰입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 결합 완충액을 펌핑한 후 준비된 ORC-Qdot705 용액 20마이크로리터를 분당 10마이크로리터의 속도로 플로우 셀로 펌핑합니다. 분당 100마이크로리터의 속도로 200마이크로리터의 결합 버퍼를 사용하여 과도한 ORC-Qdot705를 씻어냅니다. 그런 다음 30나노몰 SYTOX Orange가 포함된 결합 버퍼를 플로우 셀에 펌핑하여 분당 100마이크로리터의 속도로 DNA 기질을 염색합니다.

마지막으로 405 나노미터 레이저를 사용하여 ORC-Qdot705 신호를 여기하고 532 나노미터 레이저를 사용하여 SYTOX 오렌지 염색 DNA 신호를 여기합니다. 쿼드 밴드 대역 통과 필터를 사용하여 분당 100마이크로리터의 흐름으로 신호를 동시에 관찰합니다. 프레임당 100밀리초로 EMCCD로 이미지를 기록합니다.

lambda-ARS317 DNA 기질의 그림이 여기에 나와 있습니다. Qdot705 표지 ORC는 405 나노미터 레이저에 의해 여기되었습니다. SYTOX 오렌지 염색 DNA는 532 나노미터 레이저에 의해 여기되었습니다.

병합된 결과는 Qdot705 표지 ORC가 ARS317에서 결합함을 시사합니다. lambda-ARS317 DNA에 대한 ORC 결합 분포 결과는 ORC가 ARS317에서 높은 농도로 결합한다는 것을 보여줍니다. 이 절차에 따라 단백질-단백질 상호 작용 및 단백질 역학에 관한 추가 질문에 답하기 위해 단일 분자 FRET와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 단일 분자 형광 이미징 분야의 연구자들이 DNA 복제 및 DNA 복구 in vitro의 재구성 시스템에서 DNA 단백질 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. Piranha 솔루션으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 안면 보호 마스크 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.