분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법

본 실험 절차의 전반적인 목적은 유세포 분석법(flow cytometry)과 분자 프로브를 사용하여 남조류의 생리적 상태를 효과적으로 분석할 수 있는 프로토콜 작성 방법을 제시하는 것입니다. 이 프로토콜은 미생물 군집의 세포 생리에 관한 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 절차의 주요 장점은 최적화된 형광 프로브 프로토콜을 통해 개별 세포 수준에서 남조류의 생리적 상태를 실시간으로 구분할 수 있다는 점입니다.

본 절차의 시연은 본머스 대학교(Bournemouth University)의 사이토메트리 실험실에서 근무하는 박사 과정 학생인 David Hartnell이 진행합니다. 실험을 시작하기 전, 빈 용혈 튜브를 시료 주입 프로브 위에 놓으십시오. 'unclog'를 클릭하십시오.

그 다음, 유세포 분석 세척 과정을 시작하기 위해 역세척을 수행합니다. 역세척이 끝나면 2 mL의 초순수 여과수가 담긴 새로운 용혈 튜브를 시료 주입 프로브(SIP)에 장착하고, 시간 제한을 10~15분으로, 유체 속도를 '빠름'으로 설정합니다. 이어서 새로운 데이터 셀을 선택하고, 배경 소음을 줄이기 위해 관련 형광 및 광산란 임계값을 설정합니다.

그런 다음 실행(run)을 클릭하십시오. 초당 총 이벤트 수가 제조업체의 권장 사항보다 적지 않은 경우, 오염 제거 용액 2 mL를 빠르게 2분 동안 흘려보내십시오. 그리고 백플러시(back flush) 및 초순수 세척 단계를 반복하십시오.

M.aeruginosa 1차 단일 배양액을 준비하려면, 250mL 비커에 초순수 여과수 98mL와 조류 배지 2mL를 혼합하여 120°C에서 20분 동안 오토클레이브하십시오. 배양액이 높은 정상 상태 밀도에 도달하면, 볼텍싱을 통해 세포 2mL를 분산시킵니다. 그 후 세포를 시료 주입 프로브 아래로 옮깁니다.

광학 현미경으로 세포가 균일하게 분산되었는지 확인하십시오. 그런 다음 유세포 분석기 소프트웨어에서 히스토그램 플롯을 선택하여 전방 산란광(forward light scatter) 데이터를 기록하십시오. 그리고 log를 클릭하여 x축의 데이터를 로그 스케일로 확인하십시오.

별도의 출력 창에서, M.aeruginosa 세포의 자연 형광을 기록하기 위해 또 다른 로그 축 히스토그램을 설정하십시오. 다음으로, 피코시아닌을 들뜨게 할 수 있는 광원과 결과적으로 발생하는 형광의 방출광을 필터링할 수 있는 검출기를 선택하십시오. 최고 해상도로 기록하려면 대상 생물체의 코어 크기에 가장 가까운 설정을 선택하십시오.

그리고 유속을 비교적 느리게 설정하십시오. 데이터를 획득하기 전, 전자적 배경 소음이나 세포 시료 부스러기로 인해 발생하는 광산란 및 형광 신호를 제거하기 위해 게이트 임계값을 설정하십시오. 그런 다음 새로운 데이터 셀을 선택하십시오.

전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터를 로그 스케일로 설정하여 밀도 도표(density plot)를 생성하고 실행을 클릭합니다. 이제 전방 산란 및 자연 형광 게이트를 전방 및 측방 산란 데이터에 적용하여 낮은 수준의 산란 신호는 제외하고, 상대적으로 높은 피코시아닌(phycocyanin) 형광 신호만을 포함하도록 합니다. 그 후 샘플 분석이 완료될 때까지 이벤트를 수집하고, 해당 데이터를 사용하여 초기 세포 수를 결정합니다.

분자 프로브의 세포 흡수를 최적화하기 위해, 이전에 준비한 단일 배양액의 절반을 사멸 대조군 생성에 적절한 조건에 노출시킵니다. 배양액의 사멸을 확인하기 위해 시료 미세환경의 변화를 점검하십시오. 그 후, 방금 시연한 것과 같이 콜로니 형성을 해리합니다.

다음으로, 녹색 및 오렌지색 핵산 프로브의 형광을 기록할 수 있는 검출기와 함께 488-nanometer 레이저를 선택하십시오. 그리고 각각의 검출기를 통해 피코시아닌 신호를 기록하기 위해 640-nanometer 레이저를 선택하십시오. 새로운 데이터 시트에서 전방 및 측방 산란 매개변수를 사용하여 밀도 도표를 설정하십시오.

그 다음, 각 분자 프로브 광학 검출기 채널을 사용하여 히스토그램을 생성하십시오. 피코시아닌 방출을 검출하기 위한 히스토그램 하나와 전방 산란 이벤트(forward scatter events)를 위한 히스토그램 하나를 모두 로그 스케일로 작성합니다. 다양한 농도와 배양 시간을 적용하여 남조류 샘플을 분석하십시오.

전방 산란(forward scatter) 히스토그램에서 표적 생물체의 세포 크기에 해당하는 이벤트만 포함하도록 게이트를 설정하십시오. 그리고 이를 해당 형광 프로브 채널에 적용하십시오. 다음으로, 형광 프로브 채널의 히스토그램에서 가장 높은 피크를 포함하는 또 다른 소프트웨어 게이트를 생성하십시오.

그 후 해당 양성 프로브 형광을 밀도 도표(density plot) 상에서 게이팅합니다. 형광 신호의 수를 사멸 대조군 세포의 수와 비교하여, 비특이적 염색을 일으키지 않으면서 세포 핵산 프로브 섭취 비율이 가장 높은 지점을 결정합니다. 내인성 또는 비특이적 세포 염색으로 인한 형광 간섭 중첩을 테스트하려면, 생존 세포 50%와 사멸 세포 50%가 혼합된 배양 데이터를 선택하십시오.

그런 다음 형광 게이트를 제거하십시오. 피코시아닌 채널 히스토그램에서 표적 생물체의 세포 크기에 해당하는 전방 산란 히스토그램만 포함하도록 게이트를 설정하십시오. 가장 높은 피코시아닌 피크와 가장 낮은 피코시아닌 피크에 게이트를 설정하고, 각각 '생존(live)' 및 '사멸(dead)'로 표시합니다.

그 다음, 살아있는 세포와 죽은 세포의 피코시아닌(phycocyanin) 신호에 각각 게이트를 적용합니다. 그리고 두 평균 파장을 기록합니다. 프로토콜의 민감도를 결정하기 위해, 양성인 죽은 세포 분자 프로브 형광의 평균 파장과 내인성 비특이적 살아있는 세포 신호의 비율을 계산합니다.

마지막으로, 비특이적 염색이 발생하지 않으면서 가장 많은 양의 사멸 세포가 염색된 최적화된 프로토콜을 선택하십시오. 이 그래프들에는 지수 성장기 M.aeruginosa 배치 배양액의 세포 크기와 내부 복잡성을 나타내는 대표적인 전방 및 측방 산란광 출력값이 표시되어 있습니다. 전방 산란광 출력값의 특정 지점 사이에서 데이터를 정밀하게 조정하여 게이팅을 수행할 수 있습니다.

피코시아닌(Phycocyanin)은 적색 광원과 반응할 때 강한 신호를 생성하며, 이는 관심 있는 세포군을 추가로 게이팅(gating)하는 데 사용될 수 있습니다. 전방 산란광(forward light scatter) 및 형광 신호를 이용하여, 초기 출력 데이터로부터 M.aeruginosa 샘플에 대한 특정 데이터를 게이팅함으로써 최종 세포 수를 산출할 수 있습니다. 색소 함량이 높은 살아있는 대조군과 색소 함량이 낮은 죽은 대조군을 혼합하면, 자가 형광(auto fluorescence)의 감소 추세가 명확하게 나타납니다.

막이 손상된 세포에서는 핵산 프로브가 추가 신호를 생성하며, 이는 유세포 분석법으로 관찰하고 형광 현미경으로 추가 확인이 가능합니다. 살아있는 세포와 죽은 세포 간의 형광 구별도는 0.05 $\mu\text{M}$에서 0.5 $\mu\text{M}$ 농도 사이에서는 시간이 지남에 따라 증가하지만, 두 프로브 모두 1 $\mu\text{M}$에서 100 $\mu\text{M}$ 농도 사이에서는 감소합니다. 실제로 녹색 핵산 프로브의 최적 농도는 30분의 배양 시간에서 0.5 $\mu\text{M}$인 것으로 나타납니다.

오렌지색 핵산 프로브의 경우, 10분간 배양했을 때의 최적 농도는 1 µM입니다. 숙련된 연구자가 적절하게 수행한다면, 각 분자 프로브에 대한 최적화는 하루 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 프로브를 적절한 온도, pH 및 빛 조건의 안정적인 환경에서 보관해야 함을 유념하는 것이 중요합니다.

이 기술은 개발 이후 미생물학 분야의 연구자들이 식물성 플랑크톤의 군집 이질성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 영상을 시청하신 후, 이제 여러분은 유세포 분석법(flow cytometry)과 분자 프로브(molecular probes)를 사용하여 세포 생리학을 평가하기 위한 최적의 프로토콜을 개발하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 분자 프로브 및 독성 생물을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 적절한 개인보호구(P.P.E) 착용과 COSHH 물질에 대한 완전한 숙지와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.