분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법 Microcystis aeruginosa의) 유동 세포 계측법을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 유세포 분석 및 분자 프로브를 사용하여 시아노박테리아의 생리학적 상태를 효과적으로 분석할 수 있는 프로토콜을 만드는 방법을 보여주는 것입니다. 이 프로토콜은 미생물 군집의 세포 생리학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 최적화된 형광 프로브 프로토콜이 개별 세포 수준에서 시아노박테리아의 생리학적 상태를 실시간으로 구별할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 본머스 대학의 세포 분석 실험실에서 일하는 박사 과정 학생인 David Hartnell입니다. 실험을 시작하기 전에 빈 용혈 튜브를 샘플 주입 프로브에 놓습니다. 블로그 해제를 클릭합니다.

그런 다음 다시 플러시하여 유세포 분석 세척 프로세스를 시작합니다. 백 플러시가 끝나면 2ml의 초순수 여과수가 들어 있는 새 용혈 튜브를 샘플 주입 프로브(SIP)에 로드하고 시간 제한을 10-15분으로 설정하고 유체 속도를 고속으로 설정합니다. 그런 다음 새 데이터 셀을 선택하고 관련 형광 및 광 산란 임계값을 설정하여 배경 소음을 줄입니다.

그런 다음 실행을 클릭합니다. 초당 총 이벤트 수가 제조업체의 권장 사항보다 작지 않은 경우 2ml의 오염 제거 용액을 2분 동안 빠르게 실행합니다. 그리고 백 플러시 및 초순수 물 플러싱 단계를 반복합니다.

1차 녹농균 단일배양을 준비하기 위해 250ml 비이커에 250ml 비이커에 250ml의 초순수 여과수를 혼합하여 섭씨 120도에서 20분 동안 고압멸균합니다. 배양액이 높은 정상 상태 밀도에 있을 때 와류를 통해 2ml의 세포를 분해합니다. 그런 다음 샘플 주입 프로브 아래에서 셀을 옮깁니다.

광학 현미경으로 세포가 고르게 분산되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 유세포 분석기 소프트웨어에서 히스토그램 플롯을 선택하여 전방 광 산란 데이터를 기록합니다. 그리고 로그를 클릭하여 x축의 로그 스케일로 데이터를 봅니다.

별도의 출력에서 다른 로그 축 히스토그램을 설정하여 M.aeruginosa 세포의 자연 형광을 기록합니다. 다음으로, 피코시아닌을 자극할 수 있는 광원과 그 결과로 생성된 형광에서 방출을 필터링할 수 있는 검출기를 선택합니다. 최고 해상도로 기록하려면 대상 유기체의 코어 크기에 가장 가까운 설정을 선택하십시오.

그리고 상대적으로 느린 유속을 설정합니다. 데이터를 수집하기 전에 전자 배경 잡음 또는 세포 샘플 파편으로 인한 광 산란 및 형광 신호를 차단하기 위한 임계값을 설정합니다. 그런 다음 새 데이터 셀을 선택합니다.

로그 스케일에서 전방 및 측면 산점도 매개변수가 있는 밀도 플롯을 생성하고 run을 클릭합니다. 이제 전방 광 산란 및 자연 형광 게이트를 전방 산란 데이터에 적용하여 낮은 수준의 산란 신호를 제외하고 더 높은 상대 형광 피코시아닌 신호만 포함합니다. 그런 다음 샘플이 완료될 때까지 이벤트를 수집하고 데이터를 사용하여 초기 세포 수를 확인합니다.

분자 프로브 세포 흡수를 최적화하려면 이전에 준비된 단일 배양의 절반을 데드 컨트롤을 생성하기에 적합한 조건에 노출시킵니다. 샘플 마이크로 환경의 변화를 확인하여 배양물의 사멸을 확인합니다. 그런 다음 방금 보여준 것처럼 군체 형성을 세분화합니다.

다음으로, 녹색 및 주황색 핵산 프로브의 형광을 기록할 수 있는 검출기와 함께 488나노미터 레이저를 선택합니다. 그리고 640나노미터 레이저는 각각의 검출기를 통해 피코시아닌 신호를 기록합니다. 새 데이터 시트에서 전방 및 측면 산란 매개변수가 있는 밀도 플롯을 설정합니다.

그런 다음 각 molecular probe optical detector channel을 사용하여 하나의 히스토그램을 생성합니다. 피코시아닌 방출을 감지하기 위한 히스토그램 1개와 순방향 산란 이벤트를 감지하기 위한 히스토그램 1개, 모두 로그 스케일입니다. 다양한 농도와 배양 시간을 사용하여 시아노박테리아 샘플을 실행합니다.

전방 산란 히스토그램에 표적 유기체의 세포 크기에 대한 이벤트만 포함하도록 게이트를 만듭니다. 그리고 해당 형광 프로브 채널에 적용합니다. 다음으로, 형광 프로브 채널에서 히스토그램의 가장 높은 피크에 대해 또 다른 포함 소프트웨어 게이트를 만듭니다.

그런 다음 해당 positive probe fluorescence를 밀도 플롯에 게이트합니다. 형광 신호의 수를 사멸 대조 세포의 수와 비교하며, 여기서 비특이적 염색을 일으키지 않는 세포 핵 프로브 흡수율이 가장 높습니다. 내재적 또는 비특이적 세포 염색으로 인한 형광 간섭 중첩을 테스트하려면 50%의 살아있는 세포와 50%의 죽은 혼합 배양 데이터를 선택하십시오.

그리고 형광등을 제거하십시오. 피코시아닌 채널 히스토그램에 표적 유기체의 세포 크기에 대한 전방 산란 히스토그램만 포함하도록 게이트를 적용합니다. 가장 높은 피코시아닌 피크와 가장 낮은 피코시아닌 피크를 게이트하고 각각 live'와 dead로 표시합니다.

그런 다음 살아있는 피코시아닌과 죽은 피코시아닌 신호에 게이트를 별도로 적용합니다. 그리고 두 평균 파장을 모두 기록합니다. 프로토콜 감도를 측정하려면 positive dead molecular probe 형광의 평균 파장과 고유한 비특이적 라이브 신호의 비율을 조정합니다.

마지막으로, 비특이적 염색이 발생하지 않고 가장 많은 양의 죽은 세포가 염색된 최적화된 프로토콜을 선택합니다. 이 그래프에서는 지수 단계에서 M.aeruginosa 배치 배양의 세포 크기 및 내부 복잡성에 대한 대표적인 전방 및 측면 광 산란 출력이 표시됩니다. 게이팅은 전방 광 산란 출력의 특정 지점 사이의 데이터를 구체화하여 수행할 수 있습니다.

피코시아닌은 적색 광원에 의해 조사될 때 강력한 신호를 생성하며, 이는 관심 개체군을 추가로 게이트하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 순방향 광 산란 및 형광 신호에서 데이터를 원래 출력에서 최종 세포 계수를 위한 M.aeruginosa 샘플의 특정 데이터로 게이트할 수 있습니다. 살아있는 고착색과 데드 저착색의 대조군이 혼합되면 자동 형광의 감소하는 변화가 명확해집니다.

막이 손상된 세포에서 핵산 프로브는 유세포 분석으로 관찰할 수 있고 상피 형광 현미경 검사로 추가로 확인할 수 있는 추가 신호를 생성합니다. 살아 있는 세포와 죽은 세포 사이의 형광 구별은 0.05 및 0.5 마이크로몰 농도 사이의 시간에 따라 증가하지만 두 프로브 모두에서 1 및 100 마이크로몰 농도 사이에서는 감소합니다. 실제로, 녹색 핵산 프로브의 최적 농도는 0.5마이크로몰이며 배양 시간은 30분인 것으로 보입니다.

주황색 핵산 프로브의 경우 최적의 농도는 10분 배양을 위한 1마이크로몰입니다. 일단 마스터하면 각 분자 프로브에 대해 적절하게 수행되면 하루 만에 최적화를 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 프로브를 적절한 온도, pH 및 광 조건의 안정적인 환경에 보관해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 후 이 기술은 미생물학 분야의 연구자들이 식물성 플랑크톤의 군집 이질성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 동영상을 시청했다면 이제 유세포 분석 및 분자 프로브를 사용하여 세포 생리학을 평가하기 위한 최적의 프로토콜을 개발하는 방법을 잘 이해했을 것입니다. 분자 프로브 및 독성 유기체로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 P.P.E를 착용하고 COSHH 물질에 대한 완전한 이해와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.