Name: 생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 학습하세요 생체 외에서 티로시나제 활성 및 멜라닌 함량을 정량화하는 방법을 B16-F10 멜라닌세포를 이용하여. 이 기법은 기능성 화장품 개발과 항멜라닌 생성 연구에 신속하고 효과적인 결과를 제공합니다.

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이 작품은 한국 연구소의 계획과 기술 음식, 농업 및 임업 (IPET) 농업, 음식, 및 농촌 업무 (MAFRA 투자 농업-한국 기술 개발 프로그램을 통해에 대 한 평가 의해 지원 되었다 ) (116159-02-2-WT011) BK21 플러스, 고려 대학교 생명 공학 및 생명 과학의 학교.

1. 매체, 화합물, 및 시 약의 준비
<ol><li>B16F10 성장 전체 매체를 준비 합니다. 보충 Dulbecco의 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 (해충)이 글의 중간 (DMEM) 수정.<ol>
<li>완전 한 매체의 500 mL을 FBS와 1 패 멸 균된 유리병에 해충의 5 mL 50 mL와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)의 445 mL를 혼합 한다. 부드럽게 혼합 후 새로운 소독된 유리 병을 4 ° c.에 다음 저장소 0.2 µ m 병 상위 필터를 통해 매체 필터링 주의: 모든 셀 문화 기술은 미생물 안전 무 균을 보장 하기 위해 무 균 기술을 사용 하 여 캐비닛에 이루어져야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포의 용 해 버퍼 준비: 0.1% 트라이 톤 X-100 (v/v) 버퍼 pH 7.5 (pH 조정 HCl)를 포함 하는 20 m m Tris (hydroxymethyl) aminomethane. 3 개월 동안이 버퍼를 사용할 수 있습니다 (RT) 실내 온도에 저장 될 때. Protease 억제제 사용 하기 바로 전에 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>Tyrosinase 억제 물 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 1 M NaH2포4 (이수소) 및 1 M 나2HPO4 (염기) 재고 솔루션을 준비 합니다. 나2HPO4 의 0.1 M 나트륨 인산 염 버퍼 (pH 6.8)의 최종 볼륨을 준비가 NaH2포4 의 53.7 mL 46.3 mL를 혼합.<ol>
<li>6.8에 마지막 해결책의 pH H2o. 조정 1 l (최종 볼륨) 결과 혼합물을 희석. 이 버퍼는 1 달 동안 사용할 수 있습니다 4 ° c.에 저장 될 때</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tyrosinase 기판 솔루션 준비: tyrosinase 억제 물 분석 결과 버퍼에 녹아 있는 0.1 %3, 4-dihydroxy-L-페닐알라닌 (DOPA, w/v) (1.3 단계 참조). 주의: 사용 하는 동안 얼음에 계속.</li>
	<li>100 U/mL 버섯 tyrosinase를 준비. Tyrosinase 억제 물 분석 결과 버퍼에서 동결 건조 된 버섯 tyrosinase 해산. 2 개월 동안이 솔루션을 사용할 수 있습니다 – 20 ° c.에 저장 될 때 버섯 tyrosinase 활동 뿐만 아니라 세포 tyrosinase 활동 셀 재료의 계산 됩니다. 주의:이 솔루션은 피할 수 있습니다 동결 및 해 동을 반복 따라서 동결 전에 aliquoted. 계속 사용 하는 동안 얼음에 솔루션.</li>
	<li>1 N NaOH 솔루션을 준비 합니다. 그리고 무게 부피 플라스 크에 NaOH의 4 g을 100 mL의 증류수에 용 해.</li>
	<li>고정 솔루션 (10% 포 르 말린)를 준비 합니다. 희석 증류수의 73 mL와 함께 37% 포름알데히드의 27 mL. 신선한 매일을 준비 합니다.</li>
	<li>암모니아 실버 재고 솔루션을 준비 합니다. 5 mL 부피 플라스 크에 10% 실버 질산염 솔루션의 준비. 침전은 완전히 용 해 될 때까지 dropwise, 수산화 암모늄 솔루션을 추가 합니다. 200 μ의 실버 질산염 용액 (10%)를 추가 합니다. 솔루션은 약간 흐린 될 것입니다. 주의: 접촉 및 흡입을 피하십시오. 사용 하 여 증기 두건.</li>
	<li>암모니아 실버 작업 솔루션을 준비 합니다. 7.5 mL 증류수와 암모니아 실버 재고 솔루션의 2.5 mL를 희석. 한 번 사용 하 고 삭제. 주의: 접촉 및 흡입을 피하십시오. 사용 하 여 증기 두건.</li>
	<li>금 0.1% 염화를 준비 합니다. 골드 10% 염화 물의 1 mL를 준비 하 고 부피 플라스 크에 증류수의 99 mL를 추가 합니다. 신선한 매일을 준비 합니다.</li>
	<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 준비 합니다. 8 g의 NaCl, KCl, 0.2 g 1.44 g Na2HPO4 의 KH2포4 증류수 800 ml에서의 0.24 g을 추가 합니다. HCl. Dilute 증류수 1 l (최종 볼륨) 결과 혼합물과 7.4에 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>증류수에 용 해 하는 5% (w/v) 나트륨 thiosulfate 솔루션을 준비 합니다.</li>
</ol>2. 세포 배양 및 치료
<ol><li>상업적으로 이용 가능한 B16F10 세포를 사용 합니다. 완전 한 매체에서 B16F10 세포를 유지 합니다. 습도에 셀 문화 플라스 크를 계속 5% CO2 분위기 인큐베이터에서 37 ° c.</li>
	<li>테스트 화합물, 억제제 긍정적인 통제, 및 부정적인 제어 샘플을 준비 합니다.<ol>
<li>적절 한 용 매에 있는 시험 화합물을 디졸브. 이중 증 류 물에서 물 녹는 화합물을 디졸브. 적절 한 유기 용 매, 예물 불용 성 화합물을 분해., DMSO.</li>
		<li>여기, 사용 알 부 틴 테스트 화합물 또는 부정적인 통제와 비교 된 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위해 긍정적인 컨트롤로 이중 증 류 물 (125 μ g/mL)에 녹. 부정적인 통제 (차량 처리 제어) 사용 하 여 솔루션 또는 테스트 샘플, 예를 들어, 이중 증 류 물, DMSO, 사용 버퍼 에탄올.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 시드 및 치료<ol>
<li>5 × 104 씨 B16F10 세포 세포/완전 한 매체를 사용 하 여 24-잘 배양 배지에서 잘 하 고 24 h에 대 한 CO2 배양 기에서 품 어. 부 화, 후 완전 한 매체 발음.</li>
		<li>DMEM 매체 (FBS와 1% 페니실린/스) 없이 테스트 화합물, 억제제 컨트롤 또는 72 h. 검사 세포는 현미경 아래 모든 24 h에 대 한 CO2 배양 기에서 부정적인 컨트롤을 포함 하는 셀을 품 어. 이 단계 후 추가 실험을 위한 단계 3-5로 이동 합니다. 주의: 시험 물질과 DMEM 매체의 혼합 0.2 μ m 필터를 통해 필터링 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 세포 Tyrosinase 활동 측정
<ol><li>2 단계에서에서 설명 하는 방법을 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 차가운 PBS의 300 μ로 두 번 셀 린스.</li>
	<li>얼음에 셀 문화 접시를 놓습니다. 300 μ의 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 5 분 동안 품 어. 다음 세포 lysate 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 수집 하 고 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 lysate를 전송할.</li>
	<li>14500 rpm 2 셀 균질 화기와 세포 lysate를 균질 s, 세포내 tyrosinase를 얼음에 3 번. 균질 화기에 대 한 최적의 상태로 관련을 사용 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 12000 × g 에서 10 분 동안 centrifuge 고 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 표면에 뜨는 전송. 사용 하는 동안 얼음에 계속.</li>
	<li>96-잘 분명 폴리스 티 렌 microplate에는 상쾌한의 70 μ를 전송.</li>
	<li>Tyrosinase 기판 (DOPA) 96-잘 분명 폴리스 티 렌 microplate에를 포함 하는 솔루션의 140 μ를 추가 하 고, 부드럽게, 동요 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>옵션, 추가 100 U/mL 버섯 tyrosinase 솔루션의 70 μ 각 잘 하 고 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>475의 파장에서 tyrosinase 활동 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.</li>
	<li>각 샘플의 단백질 농도를 tyrosinase 활동 정상화. Bradford 분석 실험에 의해 각 샘플의 단백질 농도 측정 합니다.</li>
</ol>4. 멜 라 닌 함량을 측정
<ol><li>2 단계에에서 설명 된 메서드를 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 차가운 PBS의 300 μ로 두 번 셀 린스.</li>
	<li>얼음에 셀 문화 접시를 놓습니다. 300 μ의 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 5 분 동안 품 어. 다음 세포 lysate 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 수집 하 고 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 lysate를 전송할.</li>
	<li>4 ° c.에 12000 × g 에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>새로운 튜브 정규화에 대 한 측정 총 단백질 농도 상쾌한 전송. Bradford 분석 실험에 의해 각 샘플의 단백질 농도 측정 합니다.</li>
	<li>각 펠 릿에 300 μ 1 N NaOH의 추가 하 고 1 시간에 60 ° C에서 품 어.</li>
	<li>녹은 솔루션 4 ° c.에 12000 × g 에서 10 분 원심</li>
	<li>96-잘 microplate에는 상쾌한의 200 μ를 전송.</li>
	<li>400의 파장에서 멜 라 닌 내용을 측정 nm.</li>
	<li>멜 라 닌 콘텐츠 단백질 농도를 정상화.</li>
</ol>5. 폰 타나-마 송 얼룩
<ol><li>폰 타나-마 송 얼룩<ol>
<li>셀 차가운 PBS의 300 μ로 두 번 씻는 다.</li>
		<li>각 잘을 10% 포 르 말린의 200 μ를 추가 하 고 1 시간 4 ° c.에 대 한 품 어</li>
		<li>증류수로 씻어.</li>
		<li>200 μ의 미리 데워 진 암모니아 솔루션 작업을 추가 하 고 37 ° C에 또는 셀 색깔에 황색/갈색 될 때까지 1 시간에 품 어. 주의: 58-60 ° C 물 욕조에 갓 혼합된 암모니아 실버 작업 솔루션 놓고 온도 equilibrate를 위한 충분 한 시간을 허용 합니다.</li>
		<li>암모니아 실버 솔루션 작업을 제거 하 고 증류수로 헹 구 십시오.</li>
		<li>증류수를 제거 합니다. 금 0.1% 염화의 200 μ를 추가 하 고 실시간에 2 분 동안 품 어</li>
		<li>0.1% 골드 염화 솔루션을 제거 하 고 증류수로 헹 구 십시오.</li>
		<li>증류수를 제거 합니다. 나트륨 thiosulfate 솔루션 (5%, w/v)의 200 μ를 추가 하 고 2 분 동안 품 어.</li>
		<li>나트륨 thiosulfate 솔루션을 제거 하 고 증류수로 헹 구 십시오.</li>
		<li>증류수를 제거 합니다. 핵 빠른 레드의 200 μ를 추가 하 고 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>핵 빠른 붉은 색을 제거 하 고 수돗물으로 씻어.</li>
		<li>수돗물을 제거 하 고 관찰 하는 현미경으로 얼룩진된 셀.</li>
	</ol>
</li>
	<li>폰 타나-마 송 (임계값 분석 사용 하 여 ImageJ) 얼룩 참고: ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 분석 절차의 예는 보충 자료에 표시 됩니다.<ol>
<li>ImageJ 프로그램을 엽니다.</li>
		<li>파일을 선택 | 오픈 | 현미경 이미지.</li>
		<li>이미지 선택 | 조정 | 임계값 색상.
</li>
		<li>폰 타나-마 송 물 면적 측정, 밝기 매개 변수 바는 0으로 설정 하 고는 모든 스테인드 셀 (검정 또는 진한 갈색) 포함 됩니다 지점을 찾기 위해 밝기 막대를 조정 합니다.</li>
		<li>선택 분석 | 입자 분석. 분석 입자 창에서 요약 상자를 확인 하 고 확인을 누릅니다. 요약 결과 얻을 하 고 스프레드시트에 붙여 넣습니다. 참고 설명 결과 상자 매개 변수는 다음과 같습니다.: 각 이미지의 슬라이스: 이름 카운트: 스테인드 셀 수 계산된 셀의 총 면적: 총 면적 평균 크기: 총 면적/수 % 지역: 스테인드 영역/총 면적 × 100%; 총 면적 자동으로 계산 됩니다.</li>
		<li>상대적 계산 지역 전체 면적의 값을 사용 하 여 멜 라 닌으로 물. 상대 멜 라 닌 스테인드 영역 (%) = 제어 × 100, 즉, 의 테스트 샘플/평균 전체 면적의 총 세포질 영역의 값
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 공개 보고 있다.

우리는 교양된 melanocytes을 사용 하 여 테스트의 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위한 프로토콜을 제시. 대표 결과 알 부 틴, 저해 tyrosinase 활동 및 셀룰러 멜 라 닌 콘텐츠 tyrosinase 억제 물의 hypopigmentation 효과를 보여주었다. 이러한 메서드는 안티 melanogenic 활동 연구에 널리 사용 됩니다. 이 분석 실험을 사용 하 여, 또한 성공적으로 확인 했습니다 melanogenesis B16F10 세포에 억제 효과 과거에는 여러 가지 생리 활성 화합물 10 년9,10,,1112, 13 , 14.
<p cla...

멜 라 닌은 생리학, 병리학, 피부, 눈, 뇌1등 여러 장기의 독성에 중요 한 역할을 한다. 멜 라 닌의 주요 기능 사진 심사 및 생 화 확 적인 효과가 있습니다. 멜 라 닌 근처-적외선과 보이는 빛으로 자외선 (UV) 방사선, 짧은 파장의 빛;에서 증가 흡수 속도와 흡수 따라서, 멜 라 닌 가시광선 이나 자외선 방사선2로 인 한 손상 으로부터 조직을 보호 합니다. 멜 라 닌은 항 산화 및 금속과 다른 독성 화학 물질;에 대 한 선호도 따라서, 그것은 산화 화학 스트레스3에서 조직을 보호할 수 있습니다. 그러나, 멜 라 닌의 과도 한 생산 피부 문제를 발생합니다.
피부와 홍 채에 있는 melanin의 품질과 수량은 아이리스와 피부 색깔의 가장 중요 한 결정 요인. 개인은 다른 피부 색깔 기본 설정; 있을 수 있습니다. 다른 더 가벼운 피부 색깔을 선호 하는 동안 일부 검게 그을린된 피부를 선호 합니다. 이러한 소비자 프로 파일에 따라 hypopigmentation 화장품 선호 피부 색상4에 대 한 개별 시장을 만족 시키기 위해 개발 되었습니다. 따라서, hypopigmentation 및 안티 melanogenic 활동의 연구 모두 과학적으로 그리고 실제적으로 중요 하다.
Melanogenesis는 멜 라 닌 생 합성 효소 및 자발적인 화학 반응을 melanocytes에 일련의 복잡 한 프로세스입니다. 한 melanocyte 약 36 keratinocytes 둘러싸여 있으며 melanocytes 이웃 keratinocytes 그들의 제품을 배포 하는 멜 라 닌 합성 공장. 피부에 멜 라 닌을 생산 하 고 melanocytes의 melanosomal 구획에 저장 dendrites 통해 표 피에에서 인접 keratinocytes에 수송 된다.
L-티로신 melanogenesis 및 효소 tyrosinase 초기 기판 catalyzes L-티로신 그리고 dopaquinone로 3, 4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)으로 변환 하는 두 개의 연속 반응을 제공 합니다. 이러한 반응 속도 제한 단계 melanogenesis5,6에 있습니다. 따라서, hypopigmentation 활동 세포 tyrosinase 활동을 직접 평가 하 여 먼저 측정할 수 있습니다. 이렇게 하려면 melanocyte 추출 tyrosinase를 포함 하는 인 큐베이 팅 DOPA와 및 dopaquinone 샘플에서 475에 분 광 광도 법으로 측정 될 수 있다 nm. 값은 샘플, 및 컨트롤에 비해 적은 dopaquinone 형성에 hypopigmentation 활동 결과와 물질의 단백질 농도 의해 정규화 됩니다.
둘째, hypopigmentation 활동 교양된 melanocytes에 멜 라 닌을 직접 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 시험 체와 세포 치료, 후 멜 라 닌 알칼리 조건 하에서 추출 되 고 멜 라 닌 콘텐츠 400 분 광 광도 법으로 정량 nm. Hypopigmentation 에이전트 컨트롤7보다 더 낮은 melanin 내용을 발생 합니다.
마지막으로, hypopigmentation 활동 폰 타나-마 송 melanin 얼룩 및 후속 이미지 분석 하 여 측정할 수 있습니다. 폰 타나-마 송 얼룩에 멜 라 닌과 립을 보이는 검은 금속 상태로 암모니아-실버 질산염을 줄일 하 고 미세한 이미지 셀의 검정 영역은 멜 라 닌의 양을 나타내며.
Hypopigmentation 에이전트 보통 제공 일관 되 고 비교 결과이 세 가지 방법으로는 물질의 활동 올바른지 확인 합니다. 또는, 그것은 주요 유전자와 단백질 melanogenesis hypopigmentation 활동을 조사 하는 시험 물질에 대 한 응답에서에 식을 측정 하기 유용할 수 있습니다. Tyrosinase, 뿐만 아니라 tyrosinase 관련 (TRP-1) 단백질과 dopachrome tautomerase (TRP-2) melanogenesis8에 중요 한 효소는. 녹음 방송 요인 microphthalmia 관련 된 전사 요소 (MITF) melanogenesis는 유전자/단백질 식 레벨의 정량화에 마스터 레 귤 레이 터 또는 발기인 활동 분석 결과 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td><td>Sigma</td><td>D9628</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄 용액</td><td>Sigma</td><td>#320145</td><td></td></tr><tr><td>Arbutin</td><td>Fluka</td><td>#10960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>포르말린</td><td>야쿠리 순수 화학#</td><td>16223</td><td>37%</td></tr><tr><td>염화 금</td><td>미국 MasterTech</td><td>AHG0226</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>HCl</td><td>삼춘 화학</td><td>H0255</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>바이오 베이직 캐나다 Inc.</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>#60218</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>#3817-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Duksan pure chemicals</td><td>#81</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear fast red</td><td>Merck</td><td>100121</td><td>5% aluminum in Nuclear fast red 0.1% 황산.</td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신 용액</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>질산은</td><td>Duksan Pure Chemicals</td><td>#900</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)</td><td>J.T. Baker</td><td>#3817-01</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성(Na2HPO4)</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>티오황산나트륨 펜타하이드레이트</td><td>Duksan Pure Chemicals</td><td>#2163</td><td></td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸)아미노메탄</td><td>바이오 베이직 캐나다</td><td>TB0196</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>유니온 카바이드</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>버섯산 티로시나아제</td><td>시그마</td><td>T3824</td><td>25 KU</td></tr></tbody></table>

생체 외에서 hypopigmentation 활동의 정량화

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

이 연구는 생체 외에서 hypopigmentation 활동의 정량화에 대 한 실험실 방법을 선물 한다. Melanocytes에 주요 안료 멜 라 닌은 여러 세포와 환경 요인에 대 한 응답에서 합성 됩니다. 멜 라 닌 자외선 손상 으로부터 피부 세포를 보호 하지만, 또한 생물 및 생 화 확 적인 기능을가지고. 과도 한 생산 또는 축적 melanocytes에 멜 라 닌의 주 근 깨, 검 버섯, melasma, 사마귀 등 피부 문제를 일으킬 수 있습니다. 따라서, hypopigmentation 에이전트 melanogenesis 제어 임상 또는 화장품 요구와 개인에서 중요 하다. 멜 라 닌은 주로 외부 영향 melanogenesis 라는 복잡 한 생 화 확 적인 과정에 내재 성 요인, 호르몬, 염증, 나이, 등 자외선 빛 노출 melanocytes melanosomes에 합성 됩니다. 우리는 화학 물질 또는 melanocytes에 자연 물질의 hypopigmentation 활동을 결정 하는 세 가지 방법을 설명: 1) 셀룰러 tyrosinase 활동 및 2) 멜 라 닌 콘텐츠 및 이미지 3) 얼룩과 측량 셀룰러 멜 라 닌의 측정 분석입니다.
Melanogenesis에서 tyrosinase L-티로신 그리고 dopaquinone로 3, 4-dihydroxyphenylalanine (l 아미노산의 일종)으로 변환 하는 속도 제한 단계 catalyzes. 따라서 tyrosinase의 저해는 기본 hypopigmentation 메커니즘입니다. 교양된 melanocytes에 tyrosinase 활동 기판으로 아미노산의 일종을 추가 하 고 dopaquinone 생산 분 광 광도 법으로 측정 하 여 측정할 수 있습니다. Melanogenesis 또한 멜 라 닌 콘텐츠를 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 포함 하는 멜 라 닌 세포 일부는 NaOH와 함께 추출 되 고 멜 라 닌 spectrophotometrically 계량. 마지막으로, 멜 라 닌 콘텐츠 폰 타나-마 송 멜 라 닌의 얼룩이 다음 이미지 분석에 의해 측정할 수 있습니다. 이러한 생체 외 분석 실험의 결과 항상 복제 될 수 없다 인간의 피부에, 비록 이러한 메서드는 널리 특히 잠재적인 hypopigmentation 활동을 식별 하는 초기 단계로 melanogenesis 연구에 사용. 이 방법 또한 melanocyte 활동, 성장과 분화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 세 가지 다른 방법으로 일관 된 결과 효과의 유효성을 확인합니다.

알 부 틴, 안티-melanogenic의 hypopigmentation 활동에 대 한 대표적인 결과 화합물, B16F10 melanocytes 다음과 같습니다. 그림 1A 는 그 알 부 틴은 크게 차량 처리 제어에 비해 세포 tyrosinase 활동 억제를 보여 줍니다. 마찬가지로, 알 부 틴과 자극된 세포의 멜 라 닌 콘텐츠 컨트롤 (그림 1B)에 비해 감소 크게 되었다. 셀 폰 타나-마 송 얼룩과 얼룩의 현미경 이미지 그림 1C에 표시 됩니다. 알 부 틴 치료 컨트롤에 비해 검은 안료의 영역을 감소.
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체 외 화학 물질의 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위한 세 가지 실험 방법 설명: 1) 셀룰러 tyrosinase 활동과 2) 멜 라 닌 콘텐츠, 및 3) 멜 라 닌 세포의 멜 라 닌 얼룩 및 이미지 분석에 의해 측정의 정량화.

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

이 방법은 항 멜라노겐성 활동을 가진 기능성 화장품 및 피부제의 개발에 도움이 될 수 있다. 그것은 수행해야하고 결과를 신속하게 얻을 수있다. 또한, 이 방법은 연구자에게 유용할 수 있으며, 이들은 효과 나 화합물을 식별하거나 조사하거나 antimelanogenic 또는 프로멜라노겐성 활동을 조사하려는 사람들에게 유용할 수 있다.티로시나아제 활성을 측정하기 위해 B16-F10 멜라니시드제를 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 완전한 배지에서 24웰 플레이트 농도의 웰당 5배 10~4번째 세포로 시드하는 것으로 시작한다. 다음 날, 갓 준비된 테스트 화합물 및 억제제 또는 음의 제어로 보충된 DMEM으로 각 우물의 상체를 교체하고 플레이트를 인큐베이터로 72시간 동안 반납한다. 치료가 끝나면 우물을 두 번 헹구고 300 마이크로리터의 차가운 PBs를 잘 헹구고 접시를 얼음 위에 놓습니다.다음으로 셀 스크레이퍼를 사용하여 각 웰에 300 마이크로리터의 용해 버퍼를 추가하여 5분 후에 셀 용액을 수집합니다. 결과 세포 입자 현탁액을 개별 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 전달합니다. 그리고 세포 간 티로시나아제를 방출하기 위해 얼음에 14, 500 rpm에서 2 초 동안 3 번 용해.원심분리에 의해 세포 파편을 펠렛하고 얼음에 개별 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 슈퍼 네이션을 전송합니다. 명확한 96 개의 잘 폴리스티렌 마이크로 플레이트의 개별 우물에 각 수퍼티의 70 마이크로 리터를 할당하고 140 개의 미세 리터의 티로시나제 기판 용액을 각 수퍼 나탄에 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 잘 내용을 혼합합니다.그런 다음 접시를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 그리고 마이크로 플레이트 판독기에서 475 나노미터에서 티로시나제 활성을 측정합니다. 치료된 세포의 리세이트를 수집한 후 세포의 멜라닌 함량을 측정하기 위해 입증하였다.원심분리로 용액을 수집하고 수퍼네이션을 새로운 튜브로 옮긴다. 각 펠릿에 일반 수산화 나트륨 300마이크로리터를 섭씨 60도에서 1시간 배양합니다. 이어서 용존 셀 현탁액의 원심분리.그런 다음 슈퍼나티의 200 마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 옮기합니다. 그리고 400 나노미터 파장에서 마이크로 플레이트 판독기의 멜라닌 함량을 측정합니다. 폰타나-마슨 스테닝의 경우, 300 마이크로리터의 콜드 PBs로 처리된 세포를 두 번 세척하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 10%의 미공식적으로 200마이크로리터로 세포를 고정합니다.증류수로 두꺼운 세포를 헹구고 58~68도의 마이크로리터 200개를 각 우물에 암모니아칼 실버 작업 용액을 추가합니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하거나 세포가 황갈색이 될 때까지. 증류수로 얼룩진 세포를 헹구고 실온에서 0.1%의 금염화물로 2분 배양합니다.금 염화물 처리 된 세포를 증류수로 헹구고 세포에 200 마이크로 리터의 나트륨 티오툴페이트 용액을 추가하십시오. 2 분 후에 세포를 다시 헹구십시오. 그리고 5 분 동안 잘 당 핵 고속 적색의 200 마이크로 리터로 세포를 레이블.그런 다음 빛 현미경으로 이미징하기 전에 수돗물로 얼룩진 세포를 씻으릅니다. 임계값 분석의 경우 이미지 J에서 이미지를 열고 이미지를 선택하고 이미지, 조정 및 색상 임계값을 선택합니다. 폰타나 매슨으로 염색된 영역을 측정하기 위해 밝기 매개변수 막대를 0으로 설정하고 모든 검은색 또는 갈색 스테인드 셀이 포함된 지점으로 밝기를 조정합니다.파티클 분석 및 분석을 선택하고 파티클 분석 창에서 요약 상자를 확인한 다음 확인을 클릭하여 결과의 요약을 얻고 데이터를 스프레드시트에 복사하고 붙여넣습니다. Arbutin 처리는 대조군 차량 처리 세포에 비해 세포 티로시나제 활성을 현저하게 억제합니다. 마찬가지로 Arbutin으로 자극된 세포의 멜라닌 함량은 대조군에 비해 현저히 감소된다.세포는 치료 단 사이에서 형태학적으로 유사하더라도, Arbutin는 대조군 처리된 세포에 비해 검은 색소의 면적을 감소시다. 이 방법은 복합 라이브러리를 사용하여 스크리닝하는 데 유용합니다. 신속하게 테스트할 샘플의 수백 이상이 있습니다.또한이 방법은 멜라노발생과 관련된 메커니즘을 조사하는 데사용할 수 있습니다. 생리 활성 후보 화합물이 확인 된 후, 생물학적 메커니즘 또는 상업적 응용 프로그램의 연구에 대한 자신의 증언.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

방법은 hypoxia - 국소 빈혈 신생아의 생화 학적 마커를 측정하는 설명되어 있습니다. 접근 방식은 고압 액체 크로마 토그래피 (HPLC)와 가스 크로마 토그래피 질량 분석계 (GC / MS)를 사용합니다.

신생아 Hypoxia의 생화 학적 측정

광역학 요법(PDT)은 폐암 치료를 위한 비침습적 비수술적 방법입니다. 광감작제는 종양 조직에 선택적으로 축적되어 산소와 적절한 파장의 빛이 있는 상태에서 종양 세포를 사멸시킵니다. 이 프로토콜 비디오에서는 PDT 기반 방법을 사용하여 폐암 세포에서 잠재적인 광감작제의 광독성 가능성을 평가합니다.

체외 광독성 분석법: 폐암 세포에서 광감작제의 광독성 가능성을 평가하기 위한 PDT 기반 방법

이 비디오는 인간의 피부를 모방한 마우스 모델인 인간화 마우스 모델에서 UV 감도를 측정하는 방법을 설명합니다. 우리는 피부에 홍반 또는 부종을 유발할 수 있는 UV 방사선의 최소 홍반량(MED)을 결정합니다. 이 방법은 자외선 민감성을 줄이는 데 사용되는 약물의 효능을 알아내는 데 도움이 될 수 있습니다.

최소 홍반성 선량 분석: 마우스 모델에서 UV 감도를 측정하는 방법

표피의 멜라닌은 공정한 피부가 자외선에 민감한 인간의 쥐 모델 포스 콜린의 국소 응용 프로그램에 의해 유도된다. 최소 홍반 량 (MED) 분석에 의해 측정 된 강력한 UV-매개 성 염증 (자외선)으로부터 보호 어둡게 피부 표피에있는 캠프 수준의 약리학적인 조작.

인간 답게 된 마우스 모델에서 표피 멜라닌 및 보호에 대하여 햇볕의 약물 유도

이 논문은 TIVA 배지에 Y-27632를 첨가하면 성인 피부 조직에서 멜라닌세포의 수율을 크게 증가시킬 수 있다고 보고합니다.

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이 프로토콜은 이러한 화합물의 전임상 스크리닝에 사용할 수 있는 광전환 가능한 항암 펩타이드의 평가를 위해 채택된 일련의 실험을 제시합니다. 여기에는 2D 및 3D 세포 배양에서의 세포 독성 평가, 생체 외 (모델 조직) 광이성질화 효율 평가 및 생체 내 효능이 포함됩니다.

광제어 생물학적 활성 화합물의 시험관 내 및 생체 내 평가 - 암 광약리학을 위한 잠재적 약물 후보

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눈의 망막 색소 상피층에 영향을 미치는 퇴행성 안구 질환은 단일 유전자 및 다유전자 기원을 가지고 있습니다. 여러 질병 모델과 소프트웨어 응용 프로그램인 LipidUNet이 질병의 메커니즘과 잠재적인 치료 개입을 연구하기 위해 개발되었습니다.

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의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

여기에 우리가 직접 스파이크에 추가에 따라 다른 샘플에서 이동 RNA의 상대적 수준 또는 다른 짧은 RNA를 비교 하는 방법 뿐만 아니라 순화 된 대장균 RNA에서 레벨을 충전 하는 전송 RNA를 측정 하는 방법 제시 셀 참조 유전자 표현입니다.

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

학습하세요 생체 외에서 티로시나제 활성 및 멜라닌 함량을 정량화하는 방법을 B16-F10 멜라닌세포를 이용하여. 이 기법은 기능성 화장품 개발과 항멜라닌 생성 연구에 신속하고 효과적인 결과를 제공합니다.

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

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