Name: 신호 분석 및 바이오 마커 발견 하는 단일 셀에 대 한 형광 셀 바코드와 인 Cytometry (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 학습하세요 형광 세포 바코딩과 인산화 흐름 세포측정법을 이용한 단일 세포 신호 분석 및 바이오마커 발견 방법을. 이 기술은 신호 전달 이상과 약물 역학을 평가하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 교수 Kjetil Taskén의 실험실에서 실시 하 고 노르웨이 암 협회와 Stiftelsen 크리스티 앙 게르하르트 Jebsen에 의해 지원 되었다. 랜드 스크 론 요하네스와 마리 Enger 원고의 중요 한 독서에 대 한 인정 됩니다.

혈액 샘플은 모든 기증자 로부터 서 면된 동의 따라 접수 됐다. 연구는 의료 및 건강 연구 윤리의 남쪽-동쪽 노르웨이 지역 위원회에 의해 승인 되었다 하 고 인간의 피에 대 한 연구8헬싱키 선언 따라 실시 됐다.
참고: 1-3 단계 조직 문화 후드에서 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
1. 절연 CLL 환자 혈액 샘플에서 주변 혈액 단 셀 (PBMCs)
주의: 인간의 피는 Biosafety 수준 2에 대 한 규정에 따라 처리 되어야 합니다.
<ol><li>혈액 인산 염 버퍼 식 염 수와 1:1 희석 (PBS: 136.9 m NaCl, 2.7 m m KCl, 10.1 m m 나2HPO4 x 2 H2O, 1.8 m m KH2포4, pH 7.4 m) 및 50 mL 튜브 (30 mL/튜브)에 전송.</li>
	<li>신중 하 게 10 mL 피 펫을 사용 하 여 튜브의 하단에 10 mL 밀도 그라데이션 매체 (예, Lymphoprep)의 레이어.</li>
	<li>4 ° c.에 20 분 동안 800 x g에서 원심 분리기 PBMCs는 지금 밀도 그라데이션 중간 계층의 위에 볼 수 있습니다.</li>
	<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 두 개의 새로운 50 mL 튜브에 세포를 전송. PBS (튜브를 채우기) 두 번 씻어.</li>
	<li>350 x g 15 분 삭제는 상쾌한에 centrifuge 고 3 ml PBS의 resuspend.</li>
	<li>선호 하는 방법을 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>350 x g 5 분 삭제에 대 한에 셀은 상쾌한 원심. 참고: 1.8 3.2 단계는 선택적입니다. 3.3 단계에 직접 진행이 가능 하다.</li>
	<li>Resuspend 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 보충에 있는 세포 및 곳을 알아내는 튜브를 사용 하 여 적합 한 aliquots에 아래로 동결. 참고: DMSO는 세포에 독성이 있다. 셀 FBS/DMSO와 혼합 되어 한번에 빨리 작동. 셀 액체 질소에 긴 기간 저장된 될 수 있습니다.</li>
</ol>2. 셀의 해빙
<ol><li>신속 하 게 녹여 37 ° C 물 욕조에 셀. 참고: DMSO는 세포에 독성이 있다. 빨리 DMSO에 노출을 제한 하는 작업.</li>
	<li>셀 (RPMI 1640 추가 GlutaMAX 참조 테이블의 자료) 차가운 로스웰 파크 기념 연구소 매체의 10 mL을 한번 씻어.</li>
	<li>5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>Resuspend 나트륨 pyruvate, MEM 비필수 아미노산 및 페니실린/스 (지시에 따라 1 x 희석에 추가)와 10% 보충 RPMI 1640 매체에 셀 FBS. 작은 세포 배양 플라스 크에 세포를 전송 하 고 5% CO2, 보정 셀 수 있도록 1 시간 동안 37 ° C 배양 기에서 두고.</li>
</ol>3입니다. 셀의 준비
<ol><li>선호 하는 방법을 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 세포를 전송 및 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>1% 보충 RPMI 1640 매체 (단계 2.2)에 셀 resuspend 더 이상 50 x 106 셀/ml FBS.</li>
	<li>96 잘 V 하단 플레이트에 웰 스에 세포 현 탁 액의 필요한 금액을 전송 합니다. 참고: 우물의 수 테스트 조건의 수에 해당 합니다. 자극 시간 코스에 대 한 샘플에서 단일 잘 그려집니다. 시간-포인트 + 죽은 볼륨의 50 µ L 당 50 µ L 샘플을 계산 합니다. (한 흠 없는 샘플 + 바코드 염료 당 하나의 샘플) 보상 컨트롤에 대 한 샘플을 저장 합니다.</li>
	<li>37 ° C를 미리가 열된 물 욕조에 96 잘 접시를 전송. 10 분에 대 한 셀을 휴식.</li>
</ol>4. 자극과 셀의 고정
참고: (즉, 하지 무 균) 실험실 벤치에 4-8 단계를 수행 합니다.
주의: 수정 버퍼의 주요 성분입니다 독성 paraformaldehyde (흡입 및 피부 접촉). 관심을가지고 처리 합니다.
<ol><li>고정 버퍼의 60 µ L 96 잘 V 하단 플레이트를 준비 나 잘 샘플 당 당. 37 ° C 물 목욕에 남겨 주세요. 참고: 셀: 수정 버퍼 1:1 이어야 한다. 37 ° C에 증발을 허용 하기 위하여 수정 버퍼는 처음에 풍부 하 게.</li>
	<li>필요에 따라 셀 자극 하기 전에 마약을 취급 합니다.</li>
	<li>50 µ L 컨트롤 샘플 수정 접시에 전송 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>필요에 따라 셀에 10 µ g/mL 안티-IgM를 추가 하 여 자극 시간 과정을 시작 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>각 시간 점에서 50 µ L 샘플 수정 접시에 전송. 아래로 pipetting으로 혼합. 참고: 안티-IgM 유도 일반적으로 일찍 시작 신호 (분).</li>
	<li>마지막 샘플 추가 된 후 10 분 동안 37 ° C에서 수정 접시를 남겨 주세요.</li>
</ol>5. 형광 셀 바코드 (FCB)
참고: 바코드 시 약의 목록은 표 1 을 참조 하십시오.
<ol><li>고정된 셀 3 워시 x PBS (우물을 채우기).</li>
	<li>5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>시 약 바코드와 96 잘 V-아래 접시를 준비 합니다. 피펫으로 5 µ L 조합 얼룩 얼룩 매트릭스, 예를 들어, 그림 1B에서 다음 모든 샘플 하는 데 필요한 수에 잘 당 각 바코드 시 약의. 각 샘플은 다른 바코드 농도의 독특한 조합이 있을 것 이다.</li>
	<li>PBS 및 바코드 접시에 전송의 190 µ L 셀 resuspend 철저 하 게 혼합. 참고: 각 바코드 시 약 사용 높은 최종 농도와 하나의 보상 샘플을 얼룩 그리고 한 흠 없는 샘플 저장.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 20 분에 대 한 셀을 둡니다.</li>
	<li>씻으십시오 스테인드 셀 2 흐름 세척 (PBS, 1 %FBS, 0.09% 나트륨 아 지 드)와 x (우물 채워).</li>
	<li>5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>셀에 흐름 세척의 190 µ L을 추가 하 고 결합 한 15 mL 튜브에 바코드 샘플. 별도 1.7 mL 튜브 각 보상 제어 전송.</li>
	<li>5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
</ol>6. 세포내 항 원 얼룩에 대 한 Permeabilization 셀
주의: 페름 버퍼 III의 주요 성분이 이다 메탄올 독성 (흡입 및 피부 접촉)과 연. 관심을가지고 처리 합니다.
<ol><li>15 mL 튜브에 파 마 버퍼 III의 2 개 mL를 전송. 그래서 사용 시 얼음은-20 ° C에 둡니다. 참고: 페름 버퍼 실험의 시작에서-20 ° C에서 남아 있을 수 있습니다.</li>
	<li>바코드 셀 인구 (15 mL 튜브)에 얼음 처럼 차가운 페름 버퍼의 1.5 mL 및 100 µ L를 추가할 각 보상 컨트롤 (1.7 mL 튜브) drop-wise 세포 덩어리 같이 피하려고 vortexing 동안.</li>
	<li>셀-80 ° c.에 직접 전송 최소 30 분 동안 둡니다. 참고: 그것은 시점에서 실험을 일시 중지 하는 자연입니다. 셀 파 마 버퍼에 저장 된 장기-80 ° c.에 수 있습니다.</li>
</ol>7. 항 체 얼룩이 지기
참고: 보고 인 특정 항 체의 목록 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
<ol><li>-80 ° C에서 얼음의 상자 셀을 전송.</li>
	<li>씻어 3 배 흐름 세척. 참고: 참조 셀 펠 릿을 초과에서 흐름 세척을 추가 하는 것이 중요 하다, 예를 들어, 각 보상 제어 흐름 세척 바코드 세포 인구를 1 mL의 3 개 mL를 추가.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>인 항 체 얼룩 당 세포 현 탁 액의 25 µ L를 수 있는 흐름 세척의 볼륨에 바코드 셀 인구 resuspend. 보상 제어 흐름 세척의 200 µ L에서 resuspend.</li>
	<li>96 잘 V 하단 플레이트에 얼룩에 대 한 항 체를 준비 합니다. 마지막 볼륨 50 µ L/잘 될 것입니다. 잘, 당 10 µ L, 표면 표식 15 µ L, 그리고 세포 현 탁 액의 25 µ L의 최종 볼륨을 흐름을 세척에 희석의 최종 볼륨을 흐름을 세척에 희석 인 특정 항 체를 추가 합니다. 참고: 항 체 희석 실험 전에 적정 한다. Isotype 컨트롤을 포함 합니다.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 30 분에 대 한 셀을 둡니다.</li>
	<li>씻으십시오 스테인드 셀 2 x 흐름 세척 (우물을 채우기).</li>
	<li>5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>셀의 흐름 워시 150 µ L에 resuspend</li>
</ol>8입니다. 보상 컨트롤의 준비
<ol><li>항 체 활용 된 형광 항 체 염색 법 병행에서에 대 한 보상 컨트롤을 준비 합니다. 공급 업체의 지침에 따라 보상 구슬을 사용 합니다.</li>
</ol>9. 교류 Cytometry 분석
참고: 실험은 교류 cytometer는 높은 처리량 샘플러 (HTS)와 함께 실행할 수 있습니다.
<ol><li>광 전 증폭 관 관 (PMT) 전압 흠 없는 컨트롤을 최적화 합니다.</li>
	<li>보상 제어를 실행 하 고 보상 매트릭스를 계산 합니다.</li>
	<li>샘플을 실행 합니다. 이벤트 비율이 악기 사양에 따라 해야 합니다.</li>
</ol>10. 게이팅 전략 및 데이터 분석
<ol><li>FlowJo 또는 Cytobank (https://cellmass.cytobank.org) 같은 흐름 cytometry 분석 소프트웨어에 실험에서 FCS 파일을 가져옵니다.</li>
	<li>제어 전략<ol>
<li>SSC-A 대 그려서 림프 톨을 선택 밀도 점 플롯에 FSC-A.</li>
		<li>세포를 표시 하 고 SSC-A 대 FSC-W. 그려서는 singlets를 선택</li>
		<li>단일 셀과 게이트 SSC-A 대 표면 마커 그려서 입력 하는 셀을 표시 합니다.</li>
		<li>SSC A 밀도 음모 대 태평양 블루 셀 유형 인구를 표시 하 고 그들의 태평양 파랑 얼룩 강도에 따라 다른 FCB 인구 선택 ( 그림 1A참조).</li>
		<li>인 항 체 채널 또는 있는 heatmap FCB 채널에 대 한 플롯 ( 그림 1A)를 참조 인 산화 이벤트 표시.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인-신호 인 신호 대 isotype 컨트롤의 MFI (중간 형광 강도)의 역 하이퍼볼릭 사인 (arcsinh)를 사용 하 여 계산 (기저 인 산화 수준 그림 1D참조), 또는 자극 대 의 unstimulated 세포 인구 ( 그림 1E참조).</li>
</ol>

<ol><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+reverse-phase+protein+arrays+as+pharmacodynamic+assays+for+functional+proteomics%2C+biomarker+discovery%2C+and+drug+development+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer.</a> Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).</li>
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<li>Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+for+cancer+with+next-generation+functional+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 상관이 있다.

인 cytometry 단 세포에 있는 단백질 인 산화 수준을 측정 하는 강력한 기술입니다. 때문에 항 체와 얼룩에 의존 하는 방법, 인 cytometry 항 체 여부에 의해 제한 됩니다. 또한, 신뢰할 수 있는 결과 얻으려면, 모든 항 체 적정와 있어야 사용 하기 전에 확인 합니다. 인 특정 항 체의 적정에 대 한 자세한 프로토콜 되었습니다12설명 되어. 패널 디자인, 신호 대 잡음 비율의 배려가 중요 합니다. 제시 등 모든 인 항 체 알 렉 사 Fluor 647을 활용 했다. 이 fluorophore 종종 낮은 대 와 사이 최적의 미분 인 단백질의 높은 수준을 제공합니다. 또한, 인 단백질에 대 한 단 하나의 색상을 사용 하 여 다른 채널 것입니다 남아 있을 무료 FCB 및 표면 마커 얼룩. 이 패널 디자인 인 채널에 다른 일을 줄일 수 있습니다. 모든 인-항 체 같은 fluorophore를 활용 함으로써 데이터 분석 간소화 됩니다.
<p class="jove_...

인 cytometry는 단일 셀 해상도 단백질 인 산화 수준을 분석 하는 데 사용 됩니다. 방법의 전반적인 목표는 지정 된 조건에서 세포 신호 패턴을 지도. Cytometry multiparameter 용량을 이용 하 여 여러 신호 전달 경로 말 초 혈액 등 다른 유형의 세포 인구의 다른 하위 집합에 동시에 분석할 수 있습니다. 이러한 특성에는 다른 항 체 기반 기술 immunohistochemistry, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 단백질 배열 등 역 위상 단백질 배열 (RPPA)1에 비해 이점을 제공합니다. 인 cytometry 형광 세포 바코드 (FCB)를 함께 혼합, 스테인드 하 수 단일 샘플2분석 개별 셀 샘플 형광 염료의 독특한 서명으로 표시 됩니다 즉 결합 될 수 있다. 이 항 체 소비 감소, 제어 및 치료 샘플의 조합을 통해 데이터 안정성을 증가 하 고 수집의 속도 향상 시킵니다. 결합 된 FCB 인구 다음 작은 샘플을 나누어 하 고 최대 35 가지 인 특정 항 체, 시작 물자의 양에 따라 물 들일 수 있습니다. 대형 프로 파일링 실험, 표준 cytometer 하드웨어로 실행할 수 있습니다. 인 cytometry 만성 림프모구 백혈병 (CLL)3,,45, 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함 한 여러 혈액 암에서 환자 샘플에서 통로 신호 하는 프로 파일에 적용 된 6 과 비 Hodgkin 림프 종7. 인 cytometry 따라서 신호 차 특성, 식별 및 바이오 마커, 유효성 평가 하 pharmacodynamics 강력한 접근 이다.
여기, 인 cytometry에 의해 CLL 환자 샘플의 분석을 위해 최적화 된 프로토콜 (그림 1A) 제공 됩니다. 기저 신호 특성화, 안티-IgM/B 세포 수용 체 자극 및 약 섭 동 예 표시 됩니다. FCB 매트릭스에 대 한 자세한 설명이 제공 됩니다. 프로토콜은 쉽게 다른 현 탁 액 셀 형식에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270169</td><td>세포 배양 배지에 첨가</td></tr>물 <tr><td>피루브산 나트륨</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td> 첨가제 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>세포 배양 배지에 첨가제</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS</td><td>1114547</td><td>밀도 구배 매체</td></tr><tr><td>Anti-IgM</td><td>Southern Biotech</td><td>2022-01</td><td>B 세포 수용체 BD</td></tr><tr><td>Phosflow Fix Buffer I</td><td>BD</td><td>557870</td><td>고정 완충액</td></tr><tr><td>BD Phosflow Perm Buffer III</td><td>BD</td><td>558050</td><td>Permeabilization buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 5-TFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A30005</td><td>바코드 시약</td></tr><tr><td>퍼시픽 블루 숙시니미딜 에스테르</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10163</td><td>바코드 시약</td></tr><tr><td>퍼시픽 오렌지 숙시니미딜 에스테르, 트리에틸암모늄 염</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P30253</td><td>바코드 시약</td></tr><tr><td>보상 비드</td><td>사용자에 의해 정의됨</td><td></td><td>올바른 종 반응성</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>user</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well V-bottom plates</td><td>Defined by user</td><td></td><td>flow Cytometer</td></tr><tr><td>Centrifuges</td><td>Defined by user</td><td></td><td>Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates용</td></tr><tr><td>수조</td><td>사용자에 의해 정의됨</td><td></td><td>온도 조절</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>사용자에 의해 정의됨</td><td></td><td>HTS(High Throughput Sampler) 포함</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Antigen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT (pS473)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4075</td><td>Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Sk&aring; nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>ATF-2 (pT71)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8398</td><td>Clone: F-1 참고: Sk&aring; nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>BLNK (pY84)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558443</td><td>Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY223)/Itk (pY180)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>564846</td><td>Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY551)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558129</td><td>Clone: 24a/btk (Y551)&nbsp; 참고문헌: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>Btk (pY551)/Itk (pY511)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558134</td><td>Clone: 24a/BTK (Y551)&nbsp; Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>CD3&zeta; (pY142)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558489</td><td>Clone: K25-407.69 Reference: Sk&aring; nland et al., 2014, CD2 및 CD28을 통한 T 세포 공동 자극;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Histone H3 (pS10)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9716</td><td>Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>I&kappa; B&알파;</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5743</td><td>Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>LAT (pY171)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558518</td><td>Clone: I58-1169 Reference: Sk&aring; nland et al., 2014, CD2 및 CD28을 통한 T-세포 공동 자극;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Lck (pY505)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558577</td><td>Clone: 4/LCK-Y505&nbsp; 참고문헌: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>MEK1 (pS298)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>560043</td><td>Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9 (10) : 9273-9284 Sk &aring; nland et al., 2014, CD2 및 CD28을 통한 T-세포 공동 자극;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>NF-&kappa; B p65 (pS529)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558422</td><td>Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>NF-&카파; B p65 (pS536)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4887</td><td>Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>p38 MAPK (pT180/Y182)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4552</td><td>Clone: 28B10 참조: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (pT202/Y204)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4375</td><td>Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Sk&aring; nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p53 (pS15)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS20)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS37)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS46)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS392)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>PLC&gamma; 2 (pY759)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558498</td><td>Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Rb (pS807/pS811)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558590</td><td>Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothellip;, 동맥경화 혈전 Vasc Biol, 33(2):E47-55</td></tr><tr><td>S6-Ribos. Prot. (pS235/236)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4851</td><td>Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SAPK/JNK (pT183/Y185)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9257</td><td>Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>SLP76 (pY128)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558438</td><td>Clone: J141-668.36.58&nbsp; 참조: Sk&aring; nland et al., 2014, CD2 및 CD28을 통한 T-세포 공동 자극;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>STAT1 (pY701)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612597</td><td>Clone: 4a&nbsp; Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT3 (pY705)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557815</td><td>Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>STAT4 (pY693)</td><td>Zymed/ThermoFisher Scientific</td><td>71-7900</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, 유세포 분석에 의한 세포 내 인산화 STAT-4 검출, Clin Immunol, 100(3): 270-6</td></tr><tr><td>STAT5 (pY694)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612599</td><td>Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT6 (pY641)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612601</td><td>Clone: 18/P-Stat6 참고문헌: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SYK (pY525/Y526)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>12081</td><td>Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, 비장 티로신 키나아제 억제제 감소&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>ZAP70/SYK (pY319/Y352)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557817</td><td>Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Sk&aring; nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, 피, 129(6): 759-770</td></tr></tbody></table>

신호 분석 및 바이오 마커 발견 하는 단일 셀에 대 한 형광 셀 바코드와 인 cytometry

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

벗어난 셀 신호 암 개발 및 진행에 중심 역할을 하고있다. 가장 새로운 표적으로 한 치료는 실제로 단백질 및 단백질 기능에서 감독과 셀 신호 착오 따라서 맞춤된 치료 옵션을 나타내는 생체 역할 수 있습니다. DNA와 RNA 분석, 반대로 변화 단백질 활동에 보다 효율적으로 기본 약물 감도 및 저항 메커니즘을 평가할 수 있다. 인 cytometry 단백질 인 산화 이벤트는 세포 수준에서 다른 항 체 기반 접근에서이 메서드를 구별 하는 중요 한 기능을 측정 하는 강력한 기술입니다. 메서드는 여러 신호 전달 단백질의 동시 분석에 대 한 수 있습니다. 형광 세포 바코드와 함께, 짧은 시간에 표준 cytometer 하드웨어에 의해 더 큰 매체-높은 처리량 데이터 집합을 취득 수 있습니다. 인 cytometry 응용 프로그램 기본 생물학의 연구와 임상 연구에서, 신호 분석, 바이오 마커 발견과 pharmacodynamics의 평가 포함 하 여 있다. 여기, 자세한 실험 프로토콜의 예를 들어 만성 림프모구 백혈병 세포를 사용 하 여 순화 된 말 초 혈액 단 세포 인 흐름 분석을 위해 제공 됩니다.

인 흐름 cytometry 프로토콜의 주요 단계는 그림 1A에 설명 됩니다. 제시 예에서 CLL 세포 4 희석에 바코드 시 약 태평양 블루와 스테인드 했다. 3 차원 바코드 그림 1B에서 볼 수 있듯이 3 barcoding 염료를 결합 하 여 수행할 수 있습니다. 개별 샘플은 다음 후속 게이팅 각 바코드 시 약 대 SSC-A (그림 1C)에 의해 deconvoluted. 바코드 시 약에 대 한 자세한 정보는 표 1에 나열 됩니다.
여기에 설명 된 절차에 따라 인 단백질 레벨 B 세포 CLL 환자와 다양 한 조건3일반 ...

여기, 세포 수준에서 단백질 인 산화 이벤트의 중간-높은 처리량 분석을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 인 cytometry 신호 차 특성, 식별 바이오 마커, 유효성을 검사 하 고 pharmacodynamics를 평가 하는 강력한 접근 이다.

신호 분석 및 바이오 마커 발견 하는 단일 셀에 대 한 형광 셀 바코드와 인 Cytometry

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

이 방법은 세포 생물학 및 면역학의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있는 어떻게 다른 자극 또는 약에 의해 영향을 받는 신호 통로는 어떻게? 이 기술의 주요 장점은 중간에서 높은 처리량 방식으로 단일 세포 신호 분석을 수행할 수 있다는 것입니다. 보충 된 RPMI 16/40 배지에서 세포를 다시 중단 한 후 필요한 양의 셀 서스펜션을 96 웰 V-바닥 플레이트의 우물로 전송합니다.접시를 예열된 섭씨 37도의 수조로 옮기고 10분 동안 휴식을 취하십시오. 그런 다음 고정 버퍼 60 마이크로리터를 새로운 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가하여 수정 판을 설정합니다. 이 접시를 섭씨 37도 의 수조에 놓습니다.50 마이크로리터 제어 샘플을 플레이트로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 선택적으로, 셀에 밀리리터 안티 IgM당 10 마이크로리터를 추가하여 시뮬레이션 시간 과정을 시작하고 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다. 50 마이크로리터 샘플을 각 시점에서 수정 플레이트에 옮기고 각 샘플을 첨가할 때 혼합합니다.마지막 샘플을 추가 한 후, 10 분 동안 수조에 픽스 플레이트를 둡니다. 먼저 PBS로 셀을 세 번 씻으시다. 5분 동안 500회 G로 플레이트를 원심분리하고 상판을 폐기합니다.다음으로, 각 바코딩 시약의 5개의 마이크로리터를 각 음료로 파이프하여 각 시료를 염색하는 데 필요한 우물수를 채우는 바코딩 시약으로 새로운 96개의 V-bottom 플레이트를 준비합니다. 고정 된 세포 판에서, PBS의 190 마이크로 리터와 각 잘 세포를 다시 중단. 그런 다음 각 셀웰을 바코딩 플레이트에 상응하는 우물로 옮기고 각각을 잘 혼합합니다.접시를 실온에서 20 분 동안 어둠 속에서 쉬게하십시오. 5분 동안 500회 G로 플레이트를 원심분리하고 상판을 폐기합니다. 그 후, 유동 세척으로 각각 두 번 잘 셀을 씻으라.그런 다음 190 마이크로리터의 유량 세척을 각 셀 웰에 추가합니다. 바코드된 모든 샘플을 15밀리리터 튜브에 결합하고 각 보상 제어를 별도의 1.7 밀리리터 튜브로 전송합니다. 5분간 500회 G의 원심분리기와 상부전을 폐기합니다.시작하려면 파마 버퍼 3의 밀리리터 2밀리리터를 15 밀리리터 튜브로 옮긴다. 영하 20도에 보관하므로 사용하면 얼음이 차가워집니다. 준비가 되면, 세포 응집을 피하기 위해 소용돌이를 치면서 바코드 세포 인구를 포함하는 15 밀리리터 튜브에 1.5 밀리리터의 얼음 차가운 파마 버퍼를 넣습니다.각 보상 컨트롤에 100 마이크로리터의 얼음 냉파 파마 버퍼를 동일한 방식으로 추가합니다. 최소 30분 동안 셀을 영하 80도의 냉동고로 즉시 옮춥시다. 항원 염색을 시작할 준비가 되면 냉동고에서 세포를 제거하고 얼음 상자로 옮긴다.흐르는 세척을 초과하여 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. 세포를 500배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 상체를 버리고 바코드 세포 집단을 유량 세척의 부피에 다시 일시 중단하는 등 인-항체 얼룩당 세포 현탁액의 25 마이크로리터가 존재한다.200 마이크로리터의 플로우 워시에서 보상 제어를 다시 일시 중단합니다. 염색을 위한 항체 준비를 시작하려면, 신선한 96 웰 V-바닥 플레이트의 각 웰에, 유동 세척에서 희석된 인 특정 항체의 10 마이크로리터를 추가하십시오. 표면 마커 15 마이크로리터를 추가하여 유동 세척으로 희석되고 25 마이크로리터의 셀 서스펜션을 각 웰에 추가하여 웰당 50 마이크로리터의 최종 부피를 허용합니다.어두운 실온에서 세포가 30 분 동안 쉬게하십시오. 그 후, 스테인드 셀을 유동 세척으로 두 번 씻으시다. 5분 동안 500배 G의 원심분리기.상체를 버리고 150 마이크로리터의 유량 세척에서 세포를 다시 중단하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 흐름 세포 분석작업을 수행합니다. 제시된 프로토콜에서 3차원 바코딩은 3개의 바코딩 염료를 결합하여 수행됩니다.개별 샘플은 각 바코딩 시약과 측면 분산 영역에 대한 후속 게이팅에 의해 컨볼러우트됩니다. 기저 및 자극 유도 된 인산화 수준 20 B 세포 수용체의 하류 신호 분자는 다음 CLL 환자및 다양한 조건하에서 정상적인 제어에서 B 세포에서 특징지어집니다. stat3 인 티로신 705는 크게 규제된 것으로 보입니다.세포는 B 세포 수용체 통로를 통해 유도된 신호 수차를 확인하기 위해 최대 30분 동안 항-IgM으로 자극된다. 돌연변이되지 않은 IGVH를 가진 환자로부터 CLL 세포가 항IgM 자극에 대한 민감도를 증가시키면서, AKT 인스포어 세린(473)에 대해서만 통계적으로 유의하다. 세포는 그 때 PI 3-키나제 델타 억제제 idelalisib에 노출되어 비정상적인 AKT pS473 신호가 반전될 수 있는지 테스트한다.여기에 나타난 바와 같이, 비정상적인 수준은 CLL 세포에서 비정상적인 신호를 정상화하기 위해 키나아제 억제제가 적용될 수 있음을 보여주는 농도 의존적 방식으로 치료 시 현저히 감소된다. 이 절차를 시도하기 전에 바코딩 시약 및 항체를 적재하고 선택한 표면 마커가 고정 및 투과성 시약과 호환되는지 확인하는 것이 중요합니다. 세포는 인광 분석을 위한 현탁액에 있어야 하며, 여전히 프로토콜은 전체 트립치네이션과 같은 단일 세포 현탁액을 얻기 위한 절차 에 따라 비정상적인 세포 또는 조직에 적응될 수 있다.

phospho-flow-cytometry-with-fluorescent-cell-barcoding-for-single

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

유전 공학 또는 큰 샘플 크기를 요구하지 않고, 고유의 단백질 - 단백질 상호 작용의 구분, 강력하고, 생화학 평가를 허용하는 IP - FCM 방식은 제공됩니다.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Bimolecular 형광 Complementation

세포주기 단계의 진행과 속도론의 추적 미묘한 변화는 Propidium 요오드화물의를 통해 BrdU 및 전체 게놈의 DNA의 염색법과 핵산의 대사 라벨링의 조합을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 방법은이를 차례로 세포주기의 진행에 영향을 미치는가 아닌 특정의 DNA 손상의 도입을 방지, 자전거 전지의 화학 동기화의 필요성을 방지합니다.

신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

이 비디오에서는 정량적 유세포 분석을 사용하여 단백질과 인공 인지질 소포 간의 상호 작용을 보여줍니다. 형광 표지된 단백질이 형광 표지된 인지질 소포에 결합하면 평균 형광 강도가 증가하며, 이러한 증가는 유세포 분석기에 의해 감지됩니다.

표지된 단백질-인지질 소포 상호작용을 연구하기 위한 정량적 유세포 분석

이 동영상은 별개의 세포 바코드를 위해 중금속 접합 항체를 사용하는 단일 세포 단백질체학 방법을 강조합니다. 그 후, 면역염색 및 질량 세포 분석법(mass cytometry)을 적용하여 인간 전혈 유래 면역 세포의 면역 표현형 및 기능적 변화를 평가합니다.

면역 세포의 표현형 및 기능적 특성화를 위한 바코드 분석

이분자 형광 보완의 유세포 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법을 제공합니다. 이 방법은 매핑 단백질 결합 부위와 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절하는 요인을 선별 적용 할 수 있습니다.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

녹색 형광 단백질 유전자가 발견된 이래로 형광 단백질은 분자 세포 생물학에 영향을 미쳤습니다. 이 프로토콜은 유전 공학을 통한 뚜렷한 형광 단백질의 발현이 개별 세포를 바코드로 만드는 데 어떻게 사용되는지 설명합니다. 이 절차를 통해 세포 혼합물에서 고유한 집단을 추적할 수 있으며, 이는 다중화 응용 분야에 이상적입니다.

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

Phosphoinositides는 상대적인 풍부 빠르게 다양한 자극에 대한 반응의 변화 지질 신호된다. 이 문서 추출 및 탈아 실화 다음 3 H-의 미오의 -inositol와 대사 라벨 세포에 의해 phosphoinositides의 풍부를 측정하는 방법을 설명합니다. 추출 글리세 inositides 후 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리하고, 섬광 유동에 의해 정량화된다.

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

PI (4,5) P (2)는 다양한 세포 기능을 조절하지만, 세포 세포막에서의 나노 조직 잘못 이해된다. 라벨 PI 플렉스 트린 상동 도메인에 융합 된 이중 색상 형광 프로브 (4,5) P (2)에 의해, 우리는 나노 미터 스케일에서 (4,5) P 원형질막 2 공간 분포를 PI를 연구하는 새로운 방법을 기술 .

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

여기에서, 우리는 세포 또는 마이크로베시클의 막과 단백질의 상호작용을 특성화하기 위한 일련의 방법을 기술한다.

정량적 유세포 분석기를 사용하여 형광 표지 단백질과 인공 인지질 마이크로베시클의 상호작용 분석

학습하세요 형광 세포 바코딩과 인산화 흐름 세포측정법을 이용한 단일 세포 신호 분석 및 바이오마커 발견 방법을. 이 기술은 신호 전달 이상과 약물 역학을 평가하는 데 활용됩니다.

신호 분석 및 바이오 마커 발견 하는 단일 셀에 대 한 형광 셀 바코드와 인 Cytometry

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