Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Single-cell RNA sequencing is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van transcriptieprofielen van cellen, met name in heterogeen weefsel, zoals het centrale zenuwstelsel. Dit protocol biedt een methode voor het isoleren van kernen voor single-nucleus RNA sequencing. Door het gebruik van kernen in plaats van cellen, kan deze methode worden toegepast op moeilijk te scheiden weefsels, evenals bevroren weefsel.

Bovendien kan deze methode worden toegepast om celtypespecifieke veranderingen in cellen na ziekte of letsel te bestuderen. Begin deze procedure met muis euthanasie, zoals beschreven in het tekstprotocol. Maak vervolgens een incisie langs de lengte van het lichaam om de binnenorganen bloot te leggen.

Ontmanten de muis door het trekken van de binnenste organen uit de lichaamsholte met behulp van tangen. Gebruik geen papieren handdoeken om het gebied schoon te maken of om organen te verwijderen, omdat dit verontreinigingen kan introduceren. Snijd met een schaar de wervelkolom tussen de L2- en L3-rugwervels.

Om het ruggenmerg uit te werpen, past een drie milliliter spuit met ijskoude PBS met een 25 meter 1/4 inch naald. Plaats de punt van de naald in het sacrale uiteinde van de wervelkolom. Gebruik twee vingers om de wervels knijpen om een strakke afdichting rond het puntje van de naald te creëren, en druk op de zuiger om het ruggenmerg rostrally uitwerpen.

Plaats het ruggenmerg in een petrischaaltje met ijskoude PBS. Als alleen het lendengedeelte van het koord nodig is, trim dan de sacrale en thoracale gedeelten van het ruggenmerg weg. Op dit punt, bevries het weefsel en bewaar op min 80 graden Celsius, of onmiddellijk te gebruiken voor een wasmiddel mechanische cel lysis zoals hier beschreven, of hypotonische mechanische lysis zoals beschreven in het tekstprotocol.

Om wasmiddelmechanische cellyse te bepalen, plaatst u het lumbale ruggenmerg in een voorgekoelde Dounce-homogenisator en voegt u 500 microliters voorgekoelde wasmiddellysebuffer toe. Dounce met vijf slagen van de losse stamper, A, en vervolgens vijf tot 10 slagen van de strakke stamper, B.Vermijd het opheffen van de homogenisator buiten de lyse oplossing tussen slagen, en vermijd de invoering van bellen. Nu, plaats een 40 micron zeef over een voorgekoelde 50 milliliter conische buis en voorwet met een milliliter lage sacharose buffer.

Voeg een milliliter lage sacharosebuffer toe aan de Dounce-homogenisator die de ruwe kernen in de lysebuffer bevat, en meng voorzichtig door twee tot drie keer te pipetten. Geef de ruwe kernen prep over de 40-micron zeef, in de voorgekoelde 50 milliliter conische buis. Geef een extra een milliliter lage sacharose buffer over de 40 micron zeef, waardoor het uiteindelijke volume tot drie milliliter van de lage sacharose buffer en 500 microliters van de lyse buffer.

Herhaal deze stappen als u meerdere snoeren combineert, koeling in dezelfde conische buis. Dan, centrifuge het monster op 3200 keer G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Zodra de centrifugatie is voltooid, decanteren de supernatant.

We schorten het palet op met behulp van drie milliliter lage sacharose buffer. Draai voorzichtig om de pellet van de muur te verwijderen om de resuspensie te vergemakkelijken. Nadat u het monster twee minuten op ijs hebt laten zitten, brengt u de suspensie over naar een Oak Ridge-buis.

Met behulp van de homogenisator bij het instellen van een, homogeniseren de kernen in lage sacharose buffer voor 15 tot 30 seconden, het houden van het monster op ijs. Gebruik vervolgens een serologische pipet om 12,5 milliliter dichtheidssucrosebuffer te leggen, onder het lage sacharosebufferhogeen, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bel ontstaat die de dichtheidslagen verstoort. Centrifugeren de buizen op 3200 keer G, gedurende 20 minuten op vier graden Celsius.

Zodra de centrifugatie is voltooid, onmiddellijk decanteren de supernatant in een flicking beweging. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om onmiddellijk verwijderen van de Oak Ridge buis uit de centrifuge, en snel decanteren de supernatant. Met behulp van 100 microliter tot een milliliter resuspensieoplossing, schorten we de kernen op die op de muur blijven.

Vermijd de myeline frons die blijft bij de wasmiddel gebaseerde voorbereiding. Als u deze stappen niet snel doet, kan dit resulteren in een preparaat van kernen met overtolligcellair puin, of myeline, dat downstream single-nucleus RNA-sequencing kan belemmeren. Filtreer de kernen door een zeef van 30 tot 35 micron porie en verzamel in een voorgekoelde buis.

Bepaal de opbrengst van de kernen, met behulp van een hemocytometer om kernen onder een doelstelling van 10 x te tellen, voordat u overgaat tot RNA-sequencing met één kern, zoals beschreven in het tekstprotocol. Helder veld en epifluorescentie beelden van kernen, geïsoleerd met behulp van het wasmiddel mechanische lyse protocol, worden getoond op 10 x. Deze kernen worden op een onbevooroordeelde manier geïsoleerd, waardoor de studie van endogene genexpressieprofielen op het niveau van een enkele cel mogelijk is.

Hier getoond, is een representatieve tSNE plot van single-nucleus RNA sequencing, van een muis lumbale ruggenmerg, met behulp van een massaal parallelle druppel inkapseling platform. Kernen geïsoleerd van vers of bevroren weefsel kunnen worden gebruikt voor sequencing op zowel commerciële als academische platforms. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om transcriptieprofielen op eencellig niveau te verkennen, met behulp van moeilijk te scheiden weefsels, zoals het ruggenmerg, of zelfs bevroren weefsel, zoals biobankmateriaal.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om de hoeveelheid tijd tussen euthanasie en cellulaire lyse te verminderen. Verder is het belangrijk om bellen geïntroduceerd in oplossingen van cellulaire lyse tot resuspensie te minimaliseren, en om petkernen met zorg te kopen. Na deze procedure kunnen kernen worden gebruikt voor alternatieve toepassingen, zoals facs sortering, om specifieke celtypen te isoleren.