Name: 성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 성인 쥐 중추신경계에 재조합 아데노 관련 바이러스를 직접 척수강 내 주입하는 기술을. 리도카인을 활용한 일시적 마비 점수로 바이러스 전달 효율을 평가하여 ALS 등 신경계 질환 유전자 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품 허베이 지방 부의 인적 자원 및 사회 보장 (CY201605)에서 부여와 자연 과학 재단의 허베이 성 (H2017206101)에서 교부 금에 의해 투자 되었다 그리고 우리는 Guangping가 오, AAV에 대 한 제공에 대 한 박사에 게 매우 감사 이 연구는.

FVB/뉴저지 쥐 허베이 신경과 키 실험실의 동물 시설에서 자란 했다. 모든 마우스 실험에 의해 두 번째 병원의 허베이 의료 대학 윤리 위원회 승인 되었고 실험실 동물 관리 과학과의 인민 공화국의 기술에 의해의 규정에 따라 실시 중국입니다.
1. 20 %Lidocaine 염 산 염 재고 솔루션의 준비
<ol><li>Lidocaine 염 산 염의 2 세대의 무게. 부드럽게 살 균 물과 소용돌이의 5-6 mL를 추가 합니다. 멸 균 물 10 mL의 총 볼륨을 증가.</li>
	<li>1.2 0.2 미크론 필터를 통해 재고 솔루션을 필터링 합니다. 약 수 재고 솔루션, 1.5 mL microcentrifuge 당 1 mL 튜브, 및 씰링 필름으로 그것을 봉인. 4 ° c.에 게</li>
</ol>2. 깨어 있는 마우스에 직접 Intrathecal AAV 배달
<ol><li>70% 에탄올과 멸 균 거 즈를 사용 하 여 작업 영역을 닦 고 표 1에서 설명한 대로 필요한 용품을 준비.</li>
	<li>살 균 200 µ L microcentrifuge 튜브에 rAAVrh10 재고 솔루션 (5 x 1012 게놈 사본/mL)의 95 µ L을 추가 하 여 복잡 한 AAVrh.10/1% lidocaine 염 산 염의 100 µ L를 준비 하 고 20 %lidocaine 염 산 염 재고 솔루션의 5 µ L를 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 잘 섞는다. 다음, 얼음 (4 ° C)에 바이러스 솔루션을 저장 합니다. 참고: 8 µ L 마우스4 당 사용 됩니다.</li>
	<li>
주입을 위한 AAV 솔루션 주사기 준비
	<ol>
<li>해밀턴 주사기 27 G 바늘 및 주사기에 체적 규모와 바늘의 경사진 끝 25 µ L를 조립.</li>
		<li>주사기로 부드럽게 바이러스 솔루션의 4 x 1010 게놈 사본 8 µ L를 그립니다. 공기 방울을 제거 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스를 준비 참고: 남성 또는 여성 FVB/뉴저지 쥐 (30-70 일)이이 연구에 사용 되었다. IT 분사 후드에서 운영 했다.<ol>
<li>70% 에탄올과 후드에 작업 영역을 소독. 후드에서 발생 하기 쉬운 위치에 bedpiece에 깨어 마우스 (남성 또는 여성, 30-70 일, 13-20 g 체중)을 넣어. 마우스를 진정 하 고 물린 피하기 위해 멸 균 거 즈와 상체를 커버.</li>
		<li>다른 쪽에 한 쪽과 집게/중간 손가락에 엄지는 골반 거 들에 적절 하 고 단단히 창과 하 여 동물을 해결. 엄지와 집게손가락으로 긴장 된 양측 골반 거 들 사이의 피부 유지. 부드럽게 손바닥으로 동물의 상체에 개최.</li>
		<li>양측 골반 거 들 사이 그것의 뒤에 모피를 면도 다음 요오드 화 기반 스크럽과 70% 에탄올과 피부 표면에 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intrathecal 주입12
	<ol>
<li>L6 L5 척추 공간을 나타내기 위해 손톱으로 들여쓰기를 누르고 엄지 또는 검지로 다른 손의 양측 골반 거 들 사이 중간 선 따라 척추 공간 느낌 (주사 사이트를 찾습니다).</li>
		<li>약간 하며 부드럽게 회전 하는 꼬리의 척추의 중간을 나타냅니다. (단계 2.3.1에서에서 언급) 주입 전에 동물의 머리 쪽으로 바늘 경사를 조정 합니다.</li>
		<li>동물 단단히 고정 하는 척추의 중간을 따라 바늘을 정렬 되었는지 확인 합니다.</li>
		<li>부드럽게 하 고 수직으로 바늘을 삽입 (또는 약간 70-80 ° 기울기) 들여쓰기와 계속 중앙 화살 평면에서 주사기의 교차로에서. 뼈, 연결할 때 천천히 약 30 ° 각도 줄이기 위해 다음 척추 공간에 바늘을 풀. 참고: 분명 갑자기 꼬리 영화 intradural 공간에 성공적인 항목의 표시 이다. 일단 바늘 척추 공간 입력, 바늘 팁 단단히 채워 느낄 것 이다. 27 G 니 들이이 연구에 사용 된 쥐 쥐 하지에 그것 배달에 적합 합니다.</li>
		<li>벡터 솔루션 (2.2 단계에서 언급 한)을 주입. 타이머를 시작 하 고 마친 후 1 µ L/4 미 유지 바늘 약 1 분의 속도 벡터 솔루션의 8 µ L를 주사 배달. 누수를 방지 하려면 부드러운 회전 바늘을 철회 한다.</li>
		<li>4사출 품질 평가 하기 위해 배달 후 즉시 마우스의 일시적인 약점 사지를 점수. 참고: 표준4는 다음과 같습니다. 점수 0: 없음 약점; 1 점수: 걸음 걸이 이상; 없이 뒷 다리 사지의 약점을 마이너 2 점수: 분명 한 걸음 걸이 이상;으로 뒷 다리 사지의 약점을 적당 한 3 점수: 완료; 뒷 다리 사지의 마비 4 점수: 뒷 다리 사지의 마비, 호흡 곤란, 그리고 포어 사지;의 온건한 약점 완료 5 점수: 완전 한 모든 4 개의 사지의 마비 및 호흡 분명 곤란.</li>
		<li>마비에서 회복을 위한 감 금 소에 다시 마우스를 이동 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
정리
	<ol>
<li>메 마른 물 1 mL 주사기를 플러시. 실험실 공급을 정렬 하 고 압력가 마로 소독 살 균에 대 한 모든 비 일회용 재료를 수집 합니다. 70% 에탄올과 벤치를 청소.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 조직 Immunohistochemical 얼룩을 위한 준비
<ol><li>
조직 컬렉션
	<ol>
<li>복 주입 깊이 3 %chloral 하이드 레이트 (0.1 mL/10 g)와 21 일 후 주입에 쥐를 anesthetize.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 0.01 M PBS (NaCl 147 m m;의 20 mL와 함께 transcardially perfuse NaH2포4 1.9 m m; K2HPO4 8.1 m m, pH 7.4) 첫째, 다음 4% 얼음 paraformaldehyde (0.01 M PBS)에서 펌프 (1 분, 9 분 다음 5 mL/min 10 mL/min). 주의: Paraformaldehyde은 발암 성 독성. 장갑을 착용 하는 동안 연기 후드에만 처리 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
척수와 뇌의 해 부
	<ol>
<li>주사기 바늘, 거품 상자 덮개에서 발생 하기 쉬운 위치에 사지와 각 동물의 머리를 해결 다음 제거 하 고가 위로 천 골을 머리에서 피부를 제거.</li>
		<li>두개골과 뇌, 시 가로 라인의 중간 경로 함께 잘라 다음 각 측에 두개골을 열고, 눈 사이 두개골을 클립 합니다.</li>
		<li>핀셋으로 후 두 뼈를 들어올린 안과 위 양측 척추 운하를 엽니다. 양쪽에 있는 갈비뼈에서 잘라내어 신중 하 게 척추의 위쪽 절반을 제거.</li>
		<li>곡선된 핀셋으로 두뇌를 들어올린 두개골 기지의 신경을 절단 하는 다 다음 뇌와 척수를 신중 하 게 해 부 합니다. 후에 24 h에 대 한 4 %paraformaldehyde 조직 수정 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조직 조각의 준비
	<ol>
<li>Cryoprotect 뇌와 경 추 및 요 추 척수 30% 자당 해결책에서 4 ° c.에서 하룻밤 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물에 조직을 포함 하 고 액체 질소로 빨리 동결.</li>
		<li>25 µ m는 cryostat를 사용 하 여 조직을 잘라 고 사용 4 ° C에서 0.01 M PBS에 냉동된 섹션을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. Immunohistochemistry
<ol><li>10 분의 1% H2O2 에 부동성 섹션을 pretreat 다음 10 분 품 5% 혈 청 및 1 시간에 대 한 PBS에 0.3% 비 이온 세제 차단 솔루션에 대 한 PBS에 세척 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 하룻밤 해당 기본 항 체와 슬라이스를 품 어 PBST에 섹션을 세척 (0.2 %PBS 트윈 20) 30 분 (3 시간 10 분 동안 각).</li>
	<li>(3 시간 10 분 동안 각) 30 분 동안 1 h. PBST에 세척에 대 한 실 온에서 해당 biotin 이차 항 체와 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>40 분, 복잡 한 선호도 biotin 과산화 효소와 섹션을 품 어 그리고 achromogenic 에이전트와 얼룩. 슬라이드에 섹션을 탑재 하 고 제대로 건조.</li>
	<li>슬라이드 5 분 무수 에탄올과 자일 렌 10 분에 담가 다음 설치 매체와 함께 슬라이드를 밀봉 합니다. 마지막으로, 100 배, 200, 및 400 x 배율에는 전 하 결합 소자 (CCD)를 갖춘 현미경 슬라이드 이미지.</li>
</ol>

<ol><li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).</li>
<li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22001604">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li>
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<li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li>
<li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li>
<li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1%28G93A%29+Mice+and+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K%2FAkt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

기술적으로, 깨어 있는 쥐의 IT 주입 하는 동안 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 적절 한 제스처 및 회사 전체 작업을 통해 쥐의 관리는 배달 하기 위해 필수. 둘째, 그것은 저항 없이 너무 깊게 삽입 하거나 동물 부상 또는 절곡 바늘 팁의 경우 강력한 저항에서 강제로 삽입 하지 필요한 가장 어려운 포인트 바늘 팁과 척추 공간을 느낌입니다. 셋째, lidocaine 인해 일시적인 마비 제공 하지만 객관적인 지표로 그것에 대 한 사출 품질, 더 많은 연습 일관 되 고 성공적인 결과 달성 하기 위해 필요 합니다.
이 보고서에서 AAV, lidocaine 역할 IT 주입 성공의 정도 대 한 지표로 서, 유전자 치료의 효율성에 대 한 예측으로의 배달을 위해 깨어 마우스에 직접 intrathecal 주입 방법을 개발 했습니다. 실험적인 직접 요 추 찔린 처음 에이전트, 특히 마 취약, 진통 및 마 취, 척수에 전달 하기 위해 사용 그리고 CNS 질병에 대 한 유전자 치료에 매우 권...

AAV 몇 가지 부작용, CNS 변환에 장기적이 고 광범위 한 유전자 발현을 중재할 수 및 따라서 루 경화 증 (ALS), 헌팅턴의를 포함 하 여 CNS 질병을 치료 하는 유전자 치료에 대 한 가장 유망한 차량 중 하나 되고있다 (HD) 질병, Alzheimer의 질병 (광고), lysosomal 저장 질병 (LSD), Gaucher 질환 (GD), 그리고 신경 ceroid lipofuscinosis (NCL)1 현재, 이상의 100 AAV serotypes 인간과 동물에서 분리 되었습니다. 이러한 가운데, 적어도 12 전 임상에서 사용 되 고 AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 같은 유전자 벡터를 사용 하는 가장 일반적으로 포함 하는 임상 시험, rAAVrh.8, 및 rAAVrh.10,12,3,4, 5,6.
다른 CNS 질병 때문에 다양 한 영향을 받는 CNS 영역 및 세포 유형 다른 AAV 배달 전략 필요합니다. CNS 영역 및 셀 AAV transduce 수 종류는 serotype에 따라 전달 방법 뿐만 아니라. 예를 들어 rAAVrh10 transduce 주로 조직의 정 맥 주사 (IV)에 의해 전달 하는 때 이다 그것은 신경 및 명과 intrathecal 주입4,7에 의해 전달 될 때 불리고 반면에 표시 되었습니다. 또한, 실질 주입 결과 사출 사이트의 부근을 로컬 변환 반면 intraventricular 통해 뇌 척추 액체 (CSF)에 주입 또는 intrathecal 주입 결과 광범위 한 CNS 변환8 . 연구는 또한 신경 장애에서 AAV 전달 유전자 치료의 치료 힘에 의해 증명 그것 관리9,,1011. ALS 같은 CNS의 넓은 영역에 영향을 주는 질병에 CSF에 intrathecal 주입 체계 배달 방법4,10에 비해 낮은 복용량으로 질병에 의해 시달리는 대부분 영역을 커버 하 표시 되었습니다. 최근 연구는 또한 ALS laminectomy 및 intrathecal catheterization4와 관련 된 잠재적인 부상 방지에 대 한 마우스 모델에서 AAV를 주입 하는 허리 빵 꾸를 사용할 수 있습니다 나타났습니다.
실험적인 직접 요 추 찔린 에이전트, 특히 마 취약, 진통 및 188512,13마 취 척수에 전달 하 처음 사용 되었다. 이 보고서에서 우리 허리 빵 꾸 1 %lidocaine 염 산 염는 지역 아 미드 파생 취 평가 하 고 사출 품질 모니터링 주입 솔루션에서의 도움으로 성인 쥐에 주입 방법으로 그것을 설명 합니다. 반면 실패 한 주사는이 동작을 보여주지 않았다 성공적인 주사 일시적인 마비 lidocaine 유도 의해 표를 했다. 우리는 주입 효율을 예측할 수 있도록 다섯 등급 중 하나로 과도 약점의 수준을 분류. 마지막으로, 우리는 rAAVrh10 변환 수준 마비의 급료에 의해 예측 될 수 있습니다 보여줍니다. 따라서,이 intrathecal AAV 전달 방법 AAV 중재 CNS 질환의 실험적 치료를 위한 유전자 납품을 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>FVB / NJ 마우스</td><td>Charles River Laboratories 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>리도카인 염산염 일수화물</td><td>HEOWNS</td><td>73-78-9</td><td></td></tr><tr><td>AAV</td><td>매사추세츠 대학교 의과 대학</td><td></td><td></td>유전자 치료 센터의 바이러스 벡터 코어</tr><tr><td>25 &micro; 엘&nbsp; 해밀턴 주사기/27-30G 바늘</td><td>GASTIGHT</td><td>1702</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T 콤 폰</td>드 <td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>H 2O 2</td><td>SHUI HUAN PAI</td><td></td><td></td></tr> 170401 <tr><td>염소 세럼</td><td>Solarbio</td><td>S9070</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>LIFE SCIENCES</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 GFP</td><td>라이프 테크</td><td>G10362</td><td>1:333 희석</td></tr><tr><td>두 번째 항체 (염소 - 토끼)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>111-005-144</td><td>1 : 1,000 희석</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC REAGENT</td><td>Vector Lab</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td><td>Vector Lab</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vectorshield</td><td>H-1200</td><td></td>NaCl<td>을 사용한 형광 용 마운팅 배지</td></tr><tr><td></td><td>용 다 화학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH 2 PO < > 4&middot; 2H2O</td><td>Yong Da 화학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Yong Da Chemical</td><td>307699</td><td></td></tr><tr><td>접착 현미경 슬라이드</td><td>CITOGLAS</td><td>17083</td><td>25 mm x 75 mm</td></tr><tr><td>SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td><td>Electro Microscopy Siences</td><td>72236-60</td><td>24 mm x 60</td></tr><tr><td>mm 15 mL 원심분리기 튜브</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>96 well 세포 배양 클러스터</td><td>Coster</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 세포 배양 클러스터</td><td>Coster</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>WEN ZHI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Wei AN</td><td>05171112</td><td>8 cm x 10 cm x 12 cm</td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>Hong Da</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로튜브</td><td>플라즈믹</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peppet 팁</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centirifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Regerator</td><td>Haier</td><td>BCD-539WT</td><td></td></tr><tr><td>필터</td><td>MILLEX GP</td><td>R4PA42342</td><td></td></tr><tr><td>펌프</td><td>LongerPump</td><td>BT-100-2J/YZ1515X</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>냉동 마이크로 톰</td><td>Leica</td><td>CM1520</td><td></td></tr></tbody></table>

성인 쥐에 있는 재조합 형 adeno 관련 바이러스의 직접 intrathecal 주입

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Adeno 관련 바이러스 (AAV)의 Intrathecal (IT) 주사는 CNS에 CNS 유전자 치료의 안전, noninvasiveness, 그리고 우수한 전달 효능 덕에 상당한 관심을 받고 있다. 이전 연구는 관리 그것에 의해 신경 장애에서 AAV 전달 유전자 치료의 치료 효능 입증. 그러나, 작은 동물에서 IT 관리의 기술적 제한으로 인해 예측할 수 없는 실패의 높은 속도 보고 되었습니다. 여기, 우리는 주입 솔루션으로 1 %lidocaine 염 산을 추가 하 여 작은 동물에 허리 빵 꾸의 성공 정도 나타내는 점수 시스템 설립. 우리는 추가 주입 다음 과도 함의 정도 AAV의 변환 효율을 예측할 수 있습니다 보여줍니다. 따라서,이 IT 주입 방법 CNS의 넓은 영역을 괴롭히다 CNS 질병 마우스 모델에서 치료 실험을 최적화 하기 위해 사용할 수 있습니다.

마우스 과도 약점의 다른도 바로 뒤 AAV 솔루션의 주사로 intrathecal 주입의 다양 한 품질 1 %lidocaine 염 산 염 보였다. 시스템에 따라 반 양적 5 학년 점수 우리는 설립, 우리 AAV의 변환 패턴에에서 테스트 쥐 lidocaine 유도 사지 약점의 다른도로 (점수 0, n = 2; 1, n 점수 = 1; 4, n 점수 = 4; 점수 5, n = 3). 척수의 EGFP immunostaining 보였다 중 "없음" 또는 "작은 0를 득점 하는 쥐의 요 추 척수에 전달, 마우스 1, 점수에 약간 향상 된 변환 및 강력 하 고 광범위 한 transductions 마우스 4 또는 5 (그림 1A) 점수. 우리 계량 GFP 과도 사지 약점 (그림 1B)의 다양 한 학위를 표시 하는 그 쥐의...

여기에 우리가 작은 동물에 게 효율적인 adeno 관련 바이러스 전달 되도록 하 여 중앙에서 변환 효율 예측 점수 시스템 구축 바이러스 솔루션에서 1 %lidocaine 염 산 염을 사용 하 여 직접 intrathecal 사출 기법 제시 lidocaine에 의해 유도 된 과도 함의 정도 따라 신경 시스템.

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

이 방법은 ALS와 같은 중추 신경계 질환의 실험 적 치료를 위해 작은 동물을 깨우는 아데노 관련 바이러스 성 바이러스 성 트랜스게놈의 효율적인 장내 전달을 용이하게한다. 이 방법의 주요 장점은 바이러스 용액이 성공적인 주입 후 일시적인 마비를 유도하는 1 % 리도카인 염산염을 포함한다는 것입니다. 이 방법은 인트라더칼 자동화 상황의 성공을 판단하기위한 시각적 지표를 제공하지만, 전달의 성공률을 개선하기위한 충분한 연습이 필요합니다.시술을 시작하기 전에 27 게이지 바늘을 25 마이크로리터 해밀턴 주사기에 부착하고 바늘의 경부 팁을 주사기의 체적 스케일과 정렬합니다. 그런 다음 조심스럽게 거품을 피하기 위해 주의, 주사기에 바이러스 용액의 10 게놈 사본에 4 x 10의 8 마이크로 리터를로드합니다. 다음으로, 12~30일 생후 12~30그램의 마우스를 침대 조각에 생리용 후드에 배치하고 상체를 멸균 거즈로 덮어 마우스를 진정시키고 물린 것을 피한다.한쪽에 엄지 손가락으로 골반 거들 위에 마우스를 단단히 잡고 다른 쪽의 집게 손가락과 중간 손가락은 엄지 손가락과 집게 손가락으로 팽팽한 양골 골반 거들 사이의 피부를 유지합니다. 그런 다음 양측 골반 거들 사이에 털을 면도하고 요오드 기반 스크럽과 70 %의 에탄올로 노출된 피부를 살균하십시오. 아데노 관련 바이러스 용액의 직접 내트라테칼 전달을 위해, 양측 골반 거들 사이의 중간선을 따라 무척추 동물 공간을 만지고 손톱을 사용하여 피부내들여 들여쓰기를 우울하게 하여 L5 ~ L6 추간판을 나타냅니다.꼬리의 베이스를 약간 부드럽게 회전하여 척추의 중간선을 드러내고 바늘의 벨을 동물의 머리쪽으로 조정합니다. 마우스가 제자리에 단단히 고정되어 있는 가운데, 척추의 중간선을 따라 바늘을 정렬하고 바늘을 들여쓰기의 중앙에 부드럽게 수직으로 삽입하여 주사기를 중앙 각선 평면에 보관합니다. 바늘이 뼈와 접촉하면 각도를 약 30도로 천천히 줄이고 바늘을 추간판으로 미끄러지게 합니다.갑작스런 꼬리 영화는 막막 공간에 성공적으로 진입하는 신호입니다. 바늘이 추간판에 들어가면 팁이 단단히 고정된 느낌이 듭니다. 벡터 용액을 주입하고, 1분 동안 막장 공간 내에서 바늘을 유지한다.그런 다음 누출을 최소화하기 위해 회전으로 바늘을 천천히 철회합니다. 즉시 주사 품질을 평가하고 마비에서 회복을 위해 케이지에 마우스를 반환 마우스 사지의 일시적인 약점을 점수. 적절한 실험적 엔드포인트에서 주입된 마우스의 팔다리와 머리를 폼 박스 커버의 경향이 있는 위치에 고정하고 가위를 사용하여 머리에서 사골까지 피부를 제거하고 제거합니다.눈 사이에 두개골을 잘라 두개골의 중간선과 소뇌 위의 수평 선을 따라 잘라 양쪽에 두개골을 엽니 다. 핀셋을 사용하여 후두 뼈를 제거하고 안과 가위를 사용하여 양간 척추 운하를 엽니다. 양쪽에 갈비뼈를 자르고 척추의 상부 부분을 조심스럽게 제거합니다.구부러진 핀셋을 사용하여 뇌를 들어 올리고 두개골 베이스의 신경을 끊습니다. 그런 다음 뇌와 척수 전체를 조심스럽게 추출하고 24 시간 동안 4 %의 파라 포름 알데히드에서 조직을 수정합니다. 고정 기간이 끝나면 냉동고는 뇌와 자궁 경부 및 요추 척수를 섭씨 4도에서 밤새 30 % 자당 용액으로 보호하고 액체 질소에서 동결하기 전에 최적의 절삭 온도 화합물에 포함시합니다.그런 다음 저온을 사용하여 각 조직의 25 마이크로미터 두께의 섹션을 얻고 냉동 섹션을 섭씨 4도에서 0.01 mm PBS로 저장합니다. 조직의 면역 조직 화학 적 분석을 위해, 10 분 동안 1 %의 과산화수소와 무료 부동 섹션을 퇴각한 다음 PBS에서 10 분 세척하십시오. 다음으로 PBS에서 5%의 혈청과 0.3%의 비이온 세제를 함유한 블로킹 용액에 샘플을 증식한 다음, 적절한 1차 항체를 사용한 섭씨 4도에서 하룻밤 라벨을 부착한다.다음 날, PBS 플러스 트위엔에서 3 10 분 세척으로 섹션을 세척하고 마지막 세척 후 1 시간 동안 실온에서 적절한 바이오티니드 이차 항체로 슬라이드를 배양한다. 인큐베이션이 끝나면, 방금 시연된 대로 신선한 PBST에서 섹션을 3번 세척하고 40분 동안 무한대 비오틴 peroxidase 복합체로 샘플을 배양한 다음 적절한 염색제로 염색합니다. 표지된 부분을 유리 현미경 슬라이드에 장착하고 장착 된 섹션이 완전히 건조되면 5 분 동안 무수 에탄올에 슬라이드를 담그십시오.다음으로 슬라이드를 자일렌에 10분 간 담그고 적절한 장착 매체로 밀봉합니다. 그런 다음 100, 200 및 400 배율의 충전 결합 장치가 장착 된 가벼운 현미경으로 슬라이드를 이미지합니다. 자궁 경부 및 요추 척수 조직 섹션의 eGFP 면역 염색은 약점 점수 0, 약점 점수 1의 마우스에 약간 향상된 트랜스덕션을 가진 마우스의 요추 척수에서 거의 또는 전혀 트랜스포팅을 제시하고, 약점 점수가 4 또는 5인 마우스에서 강하고 광범위한 트랜스덕션을 나타낸다.다양한 정도의 과도 사지 약화를 나타내는 마우스로부터 척수 조직 단면의 GFP 염색 강도의 정량화는 바이러스 용액 주입 후 약점의 심각성이 척수 전도의 정도와 밀접한 상관관계를 나타낸다. 뇌에서, 강력한 eGFP 신호는 후각 전구, 등쪽 전두엽 피질, 전염기류 및 해마의 CA3 영역, 소뇌 피질 및 뇌줄기의 한계 영역에서 검출되며, 얼굴 핵, 코로이드 신경전증 및 에펜디말 상피 세포를 포함한다. 전방 혼의 운동 뉴런은 또한 척수의 다른 수준에서 강하게 전해됩니다.더욱이, 피질에서, 피라미드 세포를 포함하는 GFP 양성 뉴런은 마이크로글리아, 성상세포 및 올리고덴드로시드를 포함하는 각종 신경교 세포 모형뿐만 아니라 검출됩니다. 이 기술은 신경학 필드에 있는 연구원이 중추 신경계 질병에 작은 깨어 있는 동물에 있는 직접적인 장내 납품의 치료 효력을 탐구하는 가능하게 합니다.

direct-intrathecal-injection-recombinant-adeno-associated-viruses

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서 우리는 시각 피질의 뉴런과 glia의 형광 라벨에 대한 AAV 벡터의 intracranial 주사를 제시한다.

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

출처: Li, D., et al. 성인 마우스에서 재조합 아데노 관련 바이러스의 직접 척수강내 주사. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 깨어 있는 마우스의 뇌척수액(CSF)에 아데노 관련 바이러스(AAV)를 척수강내 주사하는 절차를 보여주며 주사기 준비, 척추 정렬 및 정확한 바늘 삽입을 다룹니다. 이 방법은 표적 유전자 전달을 검증하여 CNS 치료의 잠재력을 뒷받침합니다.

중추신경계 질환 치료를 위한 마우스 모델에서 바이러스의 척수강내 전달

출처:Pourshafie, N., et al. 설치류의 신경근 질환을 치료하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 9를 사용한 MicroRNA의 전신 전달. J. Vis. Exp. (2018).이 비디오에서 척수 및 구근 근위축증 또는 SBMA 영향을 받은 마우스는 치료용 microRNA를 암호화하는 플라스미드를 운반하는 재조합 AAV(아데노 관련 벡터) 벡터의 꼬리 정맥 주사를 받습니다. 벡터는 돌연변이 AR(안드로겐 수용체)-mRNA(메신저 리보핵산)에 결합하여 분해를 유발하는 마이크로RNA를 생성합니다. 이는 독성 단백질 축적을 줄이고 신경근 기능을 개선하는 데 도움이 됩니다.

척추 및 구근 근위축 마우스 모델에서 재조합 아데노 관련 벡터 주입

출처: Grames, MS, et al. 쥐에게 아데노 관련 바이러스의 정맥 투여 방법 및 팁 및 중추신경계 형질도입 평가. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 쥐에서 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV)의 꼬리 정맥 주사를 보여줍니다. 외측 꼬리 정맥에 주입된 후 바이러스는 혈류로 들어가 심장을 순환한 후 뇌에 도달하여 뉴런으로 들어가 신경 치료 응용을 위한 표적 단백질 생산을 촉진합니다.

 쥐 모델에서 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터의 정맥 투여 

여기서 우리는 신생아 마우스 뇌에 아데노 관련 바이러스를 뇌실 내 주입하여 광범위한 신경 세포 전달을 위한 기술을 보여줍니다.  이 방법은 바이러스로 전달된 transgenes의 평생 발현을 달성하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

본 연구의 목적은 성인 생쥐에서 새로운 subpial 유전자 전달 기술을 사용하여 척수 adeno-associated virus 9 (AAV9) 매개 유전자 전달의 효능과 안전성을 개발하고 검증하는 것이었다.

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

본 프로토콜은 유전자 편집 및 약물 전달을 위해 신생아 마우스에서 척수강내 주사를 수행하기 위한 단계별 지침을 설명합니다.

게놈 편집 및 약물 전달을 위한 신생아 마우스의 척수강내 주사

어린 쥐의 요추 수조에 주사를 놓는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 접근법은 유전자 치료 벡터의 척수강내 전달에 사용되어 왔지만, 이 접근법은 세포 및 약물을 포함한 다양한 치료제에 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

여기에서는 성체 마우스에서 아데노 관련 바이러스(AAV)를 체계적으로 투여하기 위해 마우스 측면 꼬리 정맥 주입에 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한 AAV transduction을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

성체 마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스의 일관된 전달

요추 척추내 주사는 중추 신경계에 유전자 요법을 전달하기 위한 번역적으로 관련된 투여 경로를 나타냅니다. 신생아, 청소년 및 성인 마우스와 쥐의 요추 척추 내 주사에 대한 이 포괄적이고 표준화된 프로토콜은 연구자들이 전임상 유전자 치료 연구에 이 기술을 채택하도록 안내하는 것을 목표로 합니다.

마우스와 쥐에서 중추 신경계 표적화를 위한 유전자 치료 벡터의 요추 내 주입

지주막하 바이러스 주입을 사용하는 아데노 관련 바이러스의 광범위한 전달을 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 이 방법은 표재층에서 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입을 보장할 뿐만 아니라 비선택적 프로모터를 사용하는 경우에도 5층 피라미드 뉴런에서 전이유전자의 선택적 발현을 초래합니다.

AAV2의 지주막하 주입에 의한 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입

배우세요 성인 쥐 중추신경계에 재조합 아데노 관련 바이러스를 직접 척수강 내 주입하는 기술을. 리도카인을 활용한 일시적 마비 점수로 바이러스 전달 효율을 평가하여 ALS 등 신경계 질환 유전자 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

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