Mikrofokus-Röntgen-CT (microCT) Bildgebung von Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) und Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Micro CT wurde aufgrund ihrer Vielfalt in der Morphologie nicht weit verbreitet auf wirbellose Meerestiere angewendet. Unsere Methode ermöglicht eine einfache Montage von Proben in jedem Winkel, der für seine Morphologie geeignet ist. Es kann mit gängigen Materialien wie Wasser, Ton und Röhren durchgeführt werden, und gegebenenfalls proben mit einer Vielzahl von Formen, von einem langen Wurm bis zu einer runden Kugel.

Demonstriert wird das Verfahren von Akiteru Maeno, einem Techniker am National Institute of Genetics, Japan. Zu Beginn 0,5% Agarose vorbereiten, indem Sie 500 Milligramm Agarose in 100 Milliliter destilliertes Wasser in einem 250-Milliliter-Konuskolben auflösen und den Kolben in einer Mikrowelle mit einer Leistung von 800 Watt auflösen, um etwa ein bis drei Minuten zu erhitzen. Kühlen Sie den Kolben bei Raumtemperatur ab.

Um große Proben zu montieren, die nicht in eine 1000-Mikroliter-Mikropipette-Blauspitze passen, wie A.equina, legen Sie zuerst die gebeizte Probe in eine 60-Millimeter-Schale mit destilliertem Wasser, um übermäßige Färbungslösung von der Oberfläche abzuwaschen. In einem 50-Milliliter-Rohr, vorsichtig gießen Fünf Milliliter 0,5%Agarose ohne Blasen zu machen. Legen Sie die Röhre auf Eis, um die Agarose zu härten.

Dann 20 Milliliter 0,5%Agarose in die Röhre geben, auf Eis legen, bis die Agarose zu härten beginnt, und zangen Sie Zangen, um die Probe in die Agarose zu platzieren. Passen Sie die Position der Probe so an, dass ihre Körperachse vertikal ist. Die Agarose auf Eis härten.

Legen Sie Ton auf die microCT-Montagebühne und stellen Sie das 50-Milliliter-Rohr auf den Ton. Um kleine Proben, die in eine 1000-Mikroliter-Mikropipette-Blauspitze wie Harmothoe sp. und X.japonica passen, zu montieren, dekantieren Sie die gebeizte Probe in eine 60-Millimeter-Schale ohne Zange.

Mit Ringpinzette die Proben vorsichtig in eine weitere 60-Millimeter-Schale mit destilliertem Wasser zu übertragen, um übermäßige Färbelösung von der Oberfläche abzuwaschen. Als nächstes 100 Mikroliter 0,5%Agarose in eine 1000-Mikroliter-Mikropipette-Blauspitze aufstellen und auf Eis legen, um zu härten. Beim Umgang mit Harmothoe sp.

1000 Mikroliter 0,5%Agarose in den Agarose-Stecker in der Spitze geben. Verwenden Sie eine Ringpinzette, um Harmothoe sp. von der 60-Millimeter-Schale sanft in die Agaroselösung in der Spitze zu übertragen.

Mit einer Petiolatenadel oder einer Präzisionspinzette die Position und Ausrichtung der Harmothoe sp. so einstellen, dass die Chaetae nicht unnatürlich gebogen werden. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind, und legen Sie dann die Spitze auf Eis, um die Agarose zu härten.

Wenn Sie zerbrechliche Proben wie X.japonica behandeln, verwenden Sie eine Mikropipette, um 1000 Mikroliter destilliertes Wasser mit dem gehärteten Agarose-Stecker in die blaue Spitze einzutragen. Positionieren Sie die X.Japonica im destillierten Wasser so, dass sie zwischen den Wänden der Spitze stabil ist. Für kleinere Proben kann eine 200-Mikroliter-Mikropipette-Gelbspitze verwendet werden.

In diesem Fall verwenden Sie 30 Mikroliter Agarose für den Stecker, und fügen Sie 200 Mikroliter Agarose oder destilliertes Wasser hinzu. Als nächstes schneiden Sie die Spitze von einer neuen, 1000-Mikroliter-Mikropipette-Blauspitze ab und stecken Sie die Spitze der gesteckten Spitze in die neue Spitze. Legen Sie Ton auf die microCT-Montagebühne und stellen Sie die Spitzen mit der Probe innen auf den Ton.

Schalten Sie den Röntgenstrahl sofort nach der Montage der Proben bei 80 Kilovolt und 100 Mikroamps ein. Bewegen Sie beim Beobachten des Röntgenübertragungsbildes die Bühne so, dass die gesamte Probe durch Anklicken der X- und Z-Achsentasten und durch manuelles Anpassen des Y-Achsenknopfes auf der Montagebühne sichtbar ist. Passen Sie die Kontrastbedingungen des Bildes so an, dass die inneren Strukturen beobachtet werden können.

Passen Sie die Ausrichtung der Probe an, indem Sie den Winkel des Rohres im Ton ändern. Drehen Sie die Bühne um 90 Grad, indem Sie die Rotationsachse auf 90 setzen und auf die Schaltfläche Relative Bewegung klicken. Führen Sie das gleiche Manöver viermal durch, um eine vollständige Drehung durchzuführen.

Schalten Sie den Röntgenstrahl jedes Mal, wenn die Probentür geöffnet wird, manuell aus, es sei denn, das System schaltet ihn automatisch aus. Klicken Sie nun auf die Z-Achsen-Taste und passen Sie den y-Achsenknopf manuell an, um die Montagestufe so zu bewegen, dass sich die Probe in der Mitte der Ansicht befindet. Drehen Sie die Bühne um 90 Grad und stellen Sie die Probe erneut in die Mitte ein.

Drehen Sie die Bühne noch dreimal um 90 Grad, und passen Sie sie nach Bedarf an, um sicherzustellen, dass sich die Probe aus allen Richtungen in der Mitte der Ansicht befindet. Klicken Sie als Nächstes auf die X-Achsen-Schaltfläche, um die Bühne entlang der x-Achse in Richtung der Röntgenstrahlquelle zu bewegen, um die Probe zu vergrößern, und passen Sie sie nach Bedarf an, sodass sie nur in die Ansicht passt. Drehen Sie die Bühne und passen Sie nach Bedarf an, um sicherzustellen, dass das Beispiel aus allen Richtungen in die Ansicht passt.

Passen Sie die Scanbedingungen an, und starten Sie dann mit dem Scannen. In diesem Experiment wurde die MikroCT-Bildgebung an Actinia equina, Harmothoe sp. und Xenoturbella japonica nach der Färbung mit 25%Lugols Lösung durchgeführt.

Die Färbung verbesserte erfolgreich den Kontrast der inneren Strukturen in allen Proben und ermöglichte Beobachtungen von inneren Weichteilen. Dieses Verfahren ist auch bei äußeren Schäden auf empfindliche Proben anwendbar, wie die X.japonica-Probe mit stark beschädigter Epidermis zeigt. Für Harmothoe sp wurde ein einziger hochauflösender Datensatz eines ganzen Exemplars rekonstruiert.

und X.japonica aus mehreren Scans, die an verschiedenen, aber überlappenden Teilen der Probe durchgeführt wurden. Stellen Sie sicher, dass Sie die Probe in der Röhre oder Spitze einstellen und das Rohr oder die Spitze in das microCT einkleben, damit es sich während des Scannens nicht bewegt. Die aus diesem Verfahren gewonnenen Daten können für 3D-Bildrekonstruktionen verwendet werden, so dass der Forscher sowohl die interne als auch die externe Morphologie der Probe vollständig verstehen kann.

Alle microCT-Systeme verwenden Röntgenstrahlen, aber die Besonderheiten können von System zu System unterschiedlich sein, also stellen Sie bitte sicher, dass Sie die Anweisungen jedes Systems genau befolgen.