Name: Coxsackievirus A16에 대하여 항바이러스 후보의 확인을 위한 바이러스 성 입력 분석 및 분자 도킹 분석의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 학습하세요 Coxsackievirus A16 바이러스 성 입력 억제제 후보를 확인하는 방법을 배우세요. 시간별 추가 분석과 분자 도킹 기법을 활용하여 항바이러스 소분자 물질을 발견하는 체계적인 접근법을 익히세요.

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저자는 분자 도킹기술 지원을 위해 오스틴에 있는 텍사스 대학에 조슈아 베컴 박사에게 감사하고 있습니다. 이 연구는 부분적으로 대만 의 과학 기술부 (MOST107-2320-B-037-037-002에서 C.-J.L. 및 L.-T.L.에 대한 자금 지원으로 지원되었습니다. MOST106-2320-B-038-021 및 MOST107-2320-B-038-034-MY3- L.-T.L.)

참고: 모든 세포 배양 및 바이러스 감염은 취급되는 견본의 생물 안전 수준에 적합한 인증된 생물 안전 성 후드에서 수행되어야 합니다. CVA16 감염을 효율적으로 차단하기 위해 관찰된 소분자 체불라그산(CHLA) 및 푸니타진(PUG)의2개의 탄닌 클래스는 후보 억제제의 예로 사용된다. 바이러스학 기술의 기본 원리, 바이러스 전파, 바이러스 적규기의 결정, 및 플라크 형성 단위(PFU) 또는 감염의 복합성(MOI)의 개념에 대해, 판독기는 참조10을참조한다.
1. 세포 배양, 바이러스 준비, 화합물 준비 및 화합물 세포 독성
<ol><li>인간 횡문근육종(RD) 세포는 CVA16감염(11)에허용되는 숙주 세포이다. D세포를 10mL의 DMEM(DMEM)으로 10% 태아 소 혈청(FBS), 200 U/mL 페니실린 G, 200 μg/mL 스트렙토마이신, 및 T-75 플라스크에서 0.5 μg/mL 암포테리신 B를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서.</li>
	<li>RD 세포에서 바이러스를 전파하여 CVA16을 준비하고 PFU / mL에서 바이러스 성 적기를 결정합니다. 최적화된 프로토콜의 경우참조 11을참조하십시오.</li>
	<li>각각의 용매를 사용하여 시험 화합물 및 대조군을 준비합니다: 예를 들어, 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 CHLA 및 PUG를 용해시다. 모든 감염 단계에 대해, 기저 배지는 DMEM 플러스 2% FBS 및 항생제로 구성되었다. 참고: 시험 화합물 처리에서 DMSO의 최종 농도는 실험에서 0.25% 이하; 0.25% DMSO는 비교를 위한 분석에서 음성 대조군 치료제로서 포함된다.</li>
	<li>XTT와 같은 시약을 결정하는 세포 생존능력을 이용하여 RD 세포상에서 시험 화합물의 세포 독성 분석((2,3-bis[2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐]-5-페닐아미노)-카보닐]-2H-테트라졸리움 수산화화물)를 수행한다. 자세한 프로토콜은참조 12를참조하십시오. 제조업체의 프로토콜에 따라 GraphPad 프리즘과 같은 분석 소프트웨어를 사용하여 테스트 화합물의 세포 독성 농도를 결정합니다. 세포 생존율에 유의하지 않는 약물 농도 (≥95% 생존 가능 세포)는 연구의 나머지 부분에 사용된다.</li>
</ol>2. 약물 첨가 시
<ol><li>
바이러스 감염 (전처리) 전에 숙주 세포에 약물의 영향을 평가하기 위해
	<ol>
<li>2 x 105 세포 / 웰의 파종 밀도에서 12 웰 플레이트의 종자 RD 세포. 단층을 얻기 위해 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.</li>
		<li>1 시간 또는 4 시간 동안 기저 매부 부피의 1 mL에서 비 세포 독성 농도 (단계 1.4에서 결정)에서 테스트 화합물로 RD 세포를 치료하십시오.</li>
		<li>기저 배지에 바이러스 의 50 PFU / 웰을 추가하기 전에 PBS의 1-2 mL로 세포를 씻어 (접종의 최종 부피는 300 μL입니다) 1 시간마다 플레이트를 15 분마다 바위.</li>
		<li>감염 후, PBS를 사용하여 단층을 다시 세척한 다음, 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 추가 배양을 위해 0.8% 메틸셀룰로오스를 함유하는 기저 매제 1 mL로 오버레이하였다.</li>
		<li>72시간 의 배양 후, 오버레이 매체를 제거하고 2 mL의 PBS를 사용하여 웰을 세척한다.</li>
		<li>15 분 동안 37 % 포름 알데히드의 0.5 mL를 사용하여 우물을 수정하십시오.</li>
		<li>상급체를 제거하고 PBS를 사용하여 다시 씻으십시오.</li>
		<li>0.5 mL의 0.5 mL의 크리스탈 바이올렛 용액을 사용 하 여 우물을 얼룩. 그런 다음 2 분 이내에 얼룩 용액을 제거하고 공기 건조하기 전에 부드러운 물 흐름으로 우물을 씻으십시오.</li>
		<li>백색광 상자에 접시를 놓아 바이러스 성 플라크를 계산합니다. 백분율 계산(%) CVA16 감염은 다음과 같다: (플라크 바이러스+약물/평균 # 플라크 바이러스+DMSO 대조군)× 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
약물과 바이러스를 동시에 추가하는 효과를 평가하기 위해 (공동 첨가)
	<ol>
<li>2 x 105 세포 / 웰의 파종 밀도에서 12 웰 플레이트의 종자 RD 세포. 단층을 얻기 위해 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.</li>
		<li>시험 화합물을 적절한 농도로 처리하고 CVA16의 50 PFU/well(접종물의 최종 부피는 300 μL)을 동시에 1시간 동안 15분마다 플레이트를 바위로 처리한다.</li>
		<li>PBS의 1 mL로 세포를 세척한 다음 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 추가 배양을 위해 0.8% 메틸셀룰로오스를 함유하는 기저 매액의 1-2 mL로 오버레이하였다.</li>
		<li>72시간 후 감염 후 크리스탈 바이올렛으로 바이러스 플라크를 염색하고 전술한 바와 같이 CVA16 감염을 확인한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
바이러스 입력 후 약물 치료 효과를 평가하기 위해 (감염 후)
	<ol>
<li>2 x 105 세포 / 웰의 파종 밀도에서 12 웰 플레이트의 종자 RD 세포. 단층을 얻기 위해 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.</li>
		<li>1 시간 동안 CVA16의 50 PFU / 웰 (접종의 최종 부피는 300 μL)으로 RD 세포를 접종하십시오.</li>
		<li>PBS의 1-2 mL로 우물을 세척하고 0.8 % 메틸 셀룰로오스와 테스트 화합물의 적절한 농도를 포함하는 기저 매체로 세포를 오버레이.</li>
		<li>크리스탈 바이올렛으로 바이러스 플라크를 염색하고 72 시간 후 감염 후 카운트및 위에서 설명한 % CVA16 감염 배양을 결정합니다. 참고: 세포를 들어 올리지 않도록 모든 PBS를 부드럽게 시정하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 유세포 분석 기반 결합 분석
<ol><li>2 x 105 세포 / 웰의 파종 밀도에서 12 웰 플레이트의 종자 RD 세포. 단층을 달성하기 위해 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.</li>
	<li>세포 단층을 4°C에서 1시간 동안 미리 식힙니다.</li>
	<li>4°C에서 3시간 동안 시험 화합물의 존재 및 부재 시에 CVA16(MOI=100)으로 RD 세포를 감염시켰다. 참고: 얼음에 바이러스 접종을 수행하고 4 °C 냉장고에서 이어지는 배양을 수행하여 4 °C에서 온도를 유지하여 바이러스 결합을 허용하지만 진입하지 않습니다.</li>
	<li>바이러스 접종을 제거하고 얼음 차가운 PBS 1-2 mL로 한 번 씻으하십시오.</li>
	<li>세포를 수집하고 얼음 차가운 유동 세포 분석 버퍼 (1x PBS + 2 % FBS)에서 다시 중단하기 전에 얼음 - 차가운 해리 버퍼 1 mL을 얼음 의 얼음 해리 버퍼를 3 분 동안 얼음에 추가하여 세포를 들어 올립니다.</li>
	<li>얼음-차가운 유동 세포 분석 버퍼를 사용하여 세포를 두 번 세척하고 얼음에 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 0.5 mL로 세포를 고정시다.</li>
	<li>PBS를 사용하여 세포를 세척하여 결합되지 않은 바이러스를 제거한 다음, 1mL의 항 VP1 항체(1:2,000; 3% BSA를 함유하는 PBS에서 희석)로 세포를 1시간 동안 얼음위에 얼룩지게 한 다음, 이차 알렉사 488-컨쥬게이트 안티 마우스 IgG(1:250; 1 시간 동안 얼음에 3 % BSA를 포함하는 PBS에서 희석. 각 항체 처리 후 PBS 세차 (3 회)를 수행한다.</li>
	<li>얼음-차가운 유동 세포측정 버퍼의 0.5 mL에서 세포를 다시 중단하고 표준 절차를 사용하여 유동 세포측정계에서 유세포 분석 수행. 연관된 소프트웨어를 사용하여 히스토그램에 데이터를 표시하고 막대 그래프 표현을 위해 수량을 표시합니다.</li>
</ol>4. 바이러스 성 불활성화 분석
<ol><li>
앞서 설명한바와 같이 바이러스 성 불활성화 분석(12)을 수행하여 다음 조건을 사용한다: - CVA16의 106 PFU / mL의 시작 농도. - 2 x 105 셀 / 웰의 파종 밀도에서 12 웰 플레이트의 RD 셀 단층. - 50 PFU / well의 최종 바이러스 농도의 결과로 약물 화합물을 적정하기위한 50 배 희석. - PBS 1-2 mL을 사용하여 세척 단계. - 0.8% 메틸셀룰로오스를 함유하는 오버레이 미디어.</li>
	<li>위에서 설명한 바와 같이 바이러스 성 플라크 절차의 크리스탈 보라색 염색을 사용하여 바이러스 감염의 최종 판독을 수행합니다.</li>
</ol>5. 분자 도킹 분석
<ol><li>PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 테스트 화합물의 3D 분자를 다운로드하십시오. 분자가 업로드된 3D 구조가 없는 경우, 2D 구조를 다운로드하거나 SMILES 문자열 서열을 사용하여 분자 프로그램(예: CORINA)을 통해 3D 분자로 변환합니다.</li>
	<li>RCSB 단백질 데이터 뱅크(https://www.rcsb.org/)에서 바이러스 성 생물학적 조립 유닛을 다운로드하고 바이오 컴퓨팅 프로그램(예: UCSF 키메라)을 사용하여 바이러스 구조 모델을 준비합니다. 예를 들어, CVA16 성숙한 바이리온 결정 구조(PDB: 5C4W)의 경우3,PDB 파일에서 용매를 삭제하고, Dunbrach 2010 로타머 라이브러리의 데이터를 사용하여 불완전한 사이드 체인을 교체하고, 수소와 전하를 구조에 추가하는 경우 이전에 보고된 13. 도킹 표적은 생물학적 어셈블리 정보(Protein Data Bank)를 사용하여 의도된 분석을 위한 임의의 관련 바이러스 성 단백질일 수 있다.</li>
	<li>
예를 들어 UCSF 키메라를 사용하여 준비된 바이러스 유닛에 화합물을 도킹하고 시각화 소프트웨어(예: 오토독 비나, 파이몰)를 사용하여 출력 파일을 분석합니다.
	<ol>
<li>시험 화합물 파일을 UCSF 키메라에 '리간드'로 업로드하고 준비된 전체 바이러스 단백질을 '수용체'로 선택하여 블라인드 도킹을 수행한다. 컴퓨터 마우스 또는 트랙패드를 사용하여 검색 볼륨을 전체 '수용체'로 크기를 조정합니다. '고급 옵션'에서 바인딩 모드 수를 최대로 허용합니다. 도킹 프레임은 바인딩 에너지중 가장 높은 에너지에서 가장 낮은 에너지로 자동으로 순위가 매겨집니다.</li>
		<li>(선택 사항) 또한 블라인드 도킹에, 마우스 또는 트랙패드를 사용하여 다시 맹목적인 도킹 결과로부터 유래된 관심 부위의 바이러스 성 단백질 상에 도킹 부위를 제한하여 검색 량을 감소시이어(예를 들어, 100 Å x 100 Å x 100 Å). 이 단계는 블라인드 도킹 결과를 확인하고 특이성을 높이는 데 도움이 됩니다.</li>
		<li>분자 그래픽 시스템(예: PyMol)을 사용하여 도킹 파일을 업로드하여 바인딩 모드의 위치를 분석합니다. '리간드'를 선택하고 '어떤 원자에'옵션으로 극성 접촉을 식별하여 바이러스 성 단백질에 화합물에서 극성 접촉을 찾아; 결과를 검사합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A16+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

이 보고서에서, 우리는 특히 비 포위 된 CVA16에 대하여 바이러스 입력을 표적으로 하는 항 바이러스 후보의 식별에 유용한 프로토콜을 기술했습니다. 이 실험은 바이러스 진입 중에 초기 이벤트를 해부하는 방법으로 설계되었으며, 이는 시험에이전트의 항바이러스 활성의 작용 메커니즘과 잠재적 표적(들)을 명확히 하는 데 도움이 된다. '약물 첨가 시간'은 시험 화합물의 잠재적 표적, 예를 들어 감염되지 않은 숙주 세포(전처리 분석), 바이러스 입자 또는 숙주 세포 표면과의 상호작용(공동 첨가 분석)을 광범위하게 결정할 수 있도록 허용한다. ) 또는 바이러스-감염 된 숙주 세포 바이러스 복제 단계 동안 (감염 후 분석). 이러한 분석법만으로도 본 프로토콜에 기재된 후속 분석법(예를 들어, 바이러스 불활성화 분석 및 결합 분석)을 유도하는 화합물(예를 들어, 공동 첨가)으로부터의 상호작용 방법을 결정할 수 있다. 세척 단계는 검사된 처리 방법이 분석된 치료법에 특정한지 확인하는 데 중요합니다. '유세포분석계 결합 분석'의 사용은 숙주 세...

손, 발 및 구강 질환(HFMD)은 어린 아이들의 콕사키바이러스 A16(CVA16) 및 엔테로바이러스 71(EV71)에 의해 가장 흔하게 발생하는 질환이다. 최근 아시아 태평양 지역에서 CVA16 유도 HFMD에 상당한 상승세가 있었습니다. 현상이 온화할 수 있는 동안, 가혹한 합병증은 잠재적인치명적인 1,2와함께 두뇌와 심혼에 영향을 미치는 생길 수 있습니다. 현재 CVA16에 사용할 수있는 허가 된 항 바이러스 요법이나 예방 접종은 없으므로 향후 발병 및 관련 합병증을 억제하기위한 항 바이러스 전략을 개발할 필요성이 절실히 필요합니다.
CVA16은 각각 VP1, VP2, VP3 및 VP4와 같은 4개의 구조 단백질을 포함하는 펜타머에서 조립된 이코사헤드랄 캡시드가 있는 비봉투 바이러스입니다. 펜타머에서 각 5 배 축을 둘러싸는 것은 우울증으로 표시하고 수용체 결합 3에서의역할로 지적되는 '협곡'영역입니다. 이 협곡의 하단에는 스핑고신(SPH)이라는 천연 지방 리간드가 들어 있는 VP1 부위에 소수성 포켓이 있습니다. 인간 P 셀렉틴 당단백질 리간드 1(PSGL-1) 및 스캐빈저 수용체 클래스 B 부재 2(SCARB2)와 같은 세포 수용체는 캡시드및 캡시드에 대한 형태 적 변화를 초래하는 이 리간드를 대체함으로써 바이러스 결합에 역할을 하는 것으로 제안되었다. 호스트 세포로 바이러스 게놈의후속 배출 4,5,6. 바이러스 진입 과정에서 연속적인 사건을 차단하는 가능한 억제제를 식별하면 CVA16 감염에 대한 잠재적 인 치료 전략을 제공 할 수 있습니다.
바이러스 수명 주기의 단계는 모드 특정 항 바이러스 제를 식별하는 데 도움이되는 표적으로 실험적 접근을 통해 해부 될 수 있습니다. 약물 첨가 시간 분석은 사전 진입(바이러스 감염 이전에 추가), 항목(바이러스 감염에 동시 추가), 및 사후 진입(다음에 추가됨)을 포함하여 바이러스 감염 중 다른 시간에 약물 치료 효과를 검사합니다. 바이러스 감염)7. 충격은 각각의 처리 조건에서 형성된 바이러스 성 플라크의 수를 정량화함으로써 표준 플라크 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 유세포분석기반 바이러스 결합 분석법은 약물이 숙주 세포에 대한 바이러스 부착을 방지하는지 여부를 결정한다. 이는 대부분의 인간 바이러스 감염이 발생하는 37°C에서 4°C로 온도를 이동시킴으로써 달성되며, 여기서 비리온은 숙주 세포 표면에 결합할수 있지만 세포 7에 들어갈 수 없다. 세포막 결합된 바이러스 입자는 그 때 바이러스 성 항원에 대하여 면역 염색을 통해 정량화되고 유세포 측정에 의해 평가됩니다. 한편 바이러스 성 불활성화 분석은 비활성 을 렌더링 하는 응집 또는 구성 변화를 일으키는 무료 바이러스 입자와 약물의 잠재적인 물리적 상호 작용을 평가 하는 데 도움이, 차폐 또는 중화, 또는 그들을 비활성 렌더링 하는 조직 변화 감염 동안 호스트 세포 표면과후속 상호 작용 8,9. 본 실험에서, 바이러스 성 접종은 숙주 세포 단층을 감염시키고 표준 플라크 분석8을수행하기 전에 약물을 적정하기 위해 희석되기 전에 약물을 먼저 배양할 수 있다. 마지막으로, 분자 도킹은 비봉투 바이러스의 바이러스 성 당단백질과 비봉투 바이러스의 바이러스 캡시드 단백질을 포함하여 비리온 표면의 잠재적인 약물 상호 작용 부위를 예측하는 강력한 도구입니다. 알고리즘. 이것은 기계론적으로 약물의 행동 모드의 표적을 찾아내고 다운스트림 검아에 의해 추가로 검증될 수 있는 유용한 정보를 제공하는 것을 돕습니다.
우리는 최근에 비 봉투 CVA16 9에 의해 감염을 효율적으로 차단하는 항바이러스 화합물을 식별하기 위해 전술 한 방법을 채택했다. 본 명세서에서, 사용된 상세한 프로토콜들이 기술되고 논의된다.

<table><tbody><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Sigma</td><td>AL-158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VP1 항체</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB979</td><td>Anti-Enterovirus 71 항체, Coxsackie A16, 클론 422-8D-4C-4D</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Cytometer와 교차 반응</td><td>벡크만 쿨터</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Corina</td><td>Molecular Networks GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛</td><td>시그마</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>시그마</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>In vitro toxicology assay kit, XTT 기반</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>Sigma</td><td>M0512-100G</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PyMol</td><td>슈르&ouml; dinger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UCSF 키메라</td><td>캘리포니아 대학교, 샌프란시스코</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

coxsackievirus a16에 대하여 항바이러스 후보의 확인을 위한 바이러스 성 입력 분석 및 분자 도킹 분석의 사용

Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

기계론적으로 바이러스 진입을 검사하는 항바이러스 분석제는 평가된 에이전트가 가장 효과적인 단계를 분별하는 것과 관련이 있으며, 후보 바이러스 진입 억제제의 식별을 허용한다. 여기서, 우리는 초기 바이러스 진입에서 바이러스 입자 또는 특정 단계를 표적으로 하여 비봉투콕사키바이러스 A16(CVA16)에 의한 감염을 차단할 수 있는 소분자의 식별을 위한 실험접근법을 제시한다. 분석법은 약물 첨가 시간 분석, 유세포분석계 바이러스 결합 분석, 및 바이러스 불활성화 분석기를 포함한다. 우리는 또한 항 바이러스 화합물에 의해 표적으로 한 잠재적인 잔류물을 예측하기 위하여 바이러스 capsid 단백질을 이용하는 분자 도킹 프로토콜을 제시합니다. 이 해법은 바이러스 성 진입에 작용하는 후보 항 바이러스 에이전트의 확인에 도움이 될 것입니다. 미래의 방향은 추가 약물 개발을 위한 이러한 가능한 억제제들을 탐구할 수 있다.

약물 첨가 시술은 도 1에 도시되어 CVA16 감염에 대한 소분자 CHLA 및 PUG를 이용한 치료로부터의 영향을 예-바이러스 입력(pre-addition) 또는 바이러스 후 진입(co-addition) 또는 후바이러스 항목( 감염 후). 두 소분자 모두 바이러스 감염 전의 숙주 세포의 전처리 여부에 관계없이 CVA16 감염에 대한 한계 영향을 발생시켰다(도1A)또는 감염 후 치료(도1C). 대조적으로, CHLA 및 PUG는 공동 첨가 처리에서 CVA16 감염을 &gt;80%까지 효율적으로 폐지하였다(도1B). 이 관측은 그러므로 2개의 화합물이 감염 도중 호스트 세포 표면에 바이러스 입자와 동시에 존재할 때 가장 효과적이다는 것을 건의합니다.
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프로토콜의 목적은 후보 바이러스 진입 억제제를 식별하는 데 사용될 수 있는 바이러스 입력과 관련된 상이한 분석방법을 설명하는 것이다.

Coxsackievirus A16에 대하여 항바이러스 후보의 확인을 위한 바이러스 성 입력 분석 및 분자 도킹 분석의 사용

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

이 프로토콜은 메커니즘 중심의 접근 방식을 통해 잠재적 인 항 바이러스 소 분자의 발견에 도움이 될 수 있습니다. 추가 분석의 시간은 소분자가 항바이러스 활성을 나타내는 감염의 어느 단계를 결정한다. 분자 도킹은 소분자와 바이러스 성 단백질 사이의 상호 작용을 예측합니다.바이러스 감염 전에 숙주 세포에 대한 약물의 영향을 평가하기 위해, 12웰 플레이트에서 12웰 플레이트에서 잘 도금 밀도당 다섯 번째 세포에 10번 종자 RD 세포. 하룻밤 사이에 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 다음 날 아침, RD 단층의 각 우물을 관심 있는 시험 화합물로 치료하여, 삼중항에, 1~4시간 동안 기저 배지의 1밀리리터에서 무독성 농도로 치료한다.치료 인큐베이션이 끝나면 15 분마다 흔들리면서 1 시간 동안 잘 기초 매체 의 300 마이크로 리터에 50 개의 플라크 형성 유닛을 추가하기 전에 PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻으면 됩니다. 감염 인큐베이션의 끝에서, PBS로 세포를 세척하고 0.8 %의 메틸 셀룰로오스를 포함하는 신선한 기저 배지의 1 밀리리터로 세포를 오버레이. 세포 배양 인큐베이터에서 72 시간 후, PBS의 두 밀리리터로 각각 잘 씻고 15 분 동안 잘 37 %의 37 %의 포름알데히드의 0.5 밀리리터로 세포를 고정하십시오.고정의 끝에서, PBS로 우물을 세척하고 우물 당 0.5 %의 0.5 밀리리터로 세포를 얼룩. 2분 후, 우물을 부드러운 물 줄기로 씻고 접시가 건조하게 하십시오. 그런 다음 계산을 위해 백색광 상자에 접시를 놓고 수식에 따라 coxsackievirus 감염된 세포의 백분율을 계산합니다.분자 도킹 분석을 위해 PubChem에서 테스트 화합물의 3D 분자를 다운로드하십시오. 분자가 업로드된 3D 구조가 없는 경우, 2D 구조를 다운로드하거나 SMILE 문자열 서열을 사용하여 적절한 분자 프로그램을 통해 구조를 3D 분자로 변환한다. 다음으로 RCSB 단백질 데이터 뱅크에서 바이러스 성 생물학적 조립 장치를 다운로드하십시오.적절한 바이오 컴퓨팅 프로그램을 사용하여 단백질 데이터 뱅크 파일에서 용매를 삭제하고, 던브랙 2010 로타머 라이브러리의 데이터를 사용하여 불완전한 측면 체인을 교체하고 이전에 보고된 대로 구조에 수소와 충전을 추가합니다. 시험 화합물을 준비된 바이러스 장치에 도킹하려면, 캘리포니아 샌프란시스코 키메라 대학에 시험 화합물 파일을 리간드로 업로드하고 블라인드 도킹을 수행하기 위해 수용체로서 준비된 전체 바이러스 단백질을 선택한다. 추가 도킹의 경우, 도킹 부위를 검색량을 더욱 감소시킴으로써 맹목적인 도킹 결과로부터 파생된 관심 영역으로 바이러스 성 단백질에 제한한다.그런 다음 도킹 파일을 적절한 분자 그래픽 시스템에 업로드하여 바인딩 모드 위치를 분석합니다. 리간드를 선택하여 화합물에서 바이러스 성 단백질까지 극성 접접촉을 찾아 원자 옵션과의 극성 접접촉을 식별합니다. 이 대표적인 실험에서 시험된 두 개의 작은 분자는, 바이러스 감염 전 또는 감염 후 처리에서 숙주 세포의 전처리에서 든 coxsackievirus A16 감염성에 대하여 한계 충격을 생성했습니다.대조적으로, 분자는 공동 추가 처리에서 80% 이상 에 의하여 감염을 효율적으로 제거했습니다, 2개의 화합물이 감염 도중 호스트 세포 표면에 바이러스 입자와 동시에 존재할 때 가장 효과적이다는 것을 건의합니다. 유동 세포측정 기반 결합 분석은 두 탄닌이 숙주 세포에 바이러스 입자 결합을 방지함으로써 coxsackievirus A16 감염성 진입을 방지함을 확인합니다. 탄닌의 분자 도킹은 둘 다 포켓 팩터를 잡고 coxsackievirus 바인딩 및 호스트 세포로의 입력을 중재하는 중요한 역할을 하는 포켓 입구 바로 위에 coxsackievirus pentamer의 협곡 지역에 결합할 것으로 예상된다는 것을 나타냅니다.이러한 표면 투영에서, 포켓 입구 주변의 소분자의 극성 접촉으로부터 예측된 독특한 잔류물은 아스파라진-85, 리신-257 및 아스파라진-417을 두 탄닌 사이에 공통적으로 관찰할 수 있다. 분자 도킹의 경우, 결합 프레임을 순위를 매일 때 바이러스 성 단백질의 토폴로지가 고려되어야합니다. 추가 실험은 재조합 바이러스에 화합물의 항 바이러스 활성을 테스트 포함 될 수 있습니다., 아미노산에 돌연변이 약물의 효능에 그들의 중요성을 확인 하기 위해 발견.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 바이러스 불활성화 분석을 보여주며, 바이러스 입자에 대한 항바이러스제의 영향 평가를 보여줍니다.

바이러스 불활성화 분석을 통한 항바이러스 테스트 화합물의 효과 평가

이 비디오는 항바이러스 화합물을 스크리닝하기 위한 바이러스 부착 분석을 보여줍니다. 유전자 변형 C형 간염 바이러스와 루시페라아제를 사용하여 바이러스만 처리한 웰에 비해 공동 처리된 웰에서 낮은 광 강도로 알 수 있듯이 바이러스 부착에 대한 억제 효과를 평가합니다.

항바이러스 화합물 스크리닝을 위한 바이러스 부착 분석

이 비디오는 바이러스가 숙주 세포로 진입하고 엔도솜과 융합하는 특정 단계를 표적으로 하는 항바이러스제를 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 세포는 저온에서 배양된 다음 HCV에 감염됩니다. 낮은 온도는 숙주 세포에 대한 바이러스 결합을 허용하지만 내포작용(endocytosis)을 통한 내재화를 억제합니다. 테스트 항바이러스 화합물을 첨가하고 세포를 생리학적 온도에서 배양합니다. 이러한 더 높은 온도로의 이동은 바이러스 진입을 용이하게 하고 엔도솜과의 바이러스 외피 융합에 대한 테스트 화합물의 영향을 평가할 수 있습니다.

숙주 세포의 바이러스 진입 및 융합에 대한 테스트 화합물의 효과를 평가하기 위한 분석

세포 변성 효과 (CPE) 기반의 분석, 용량 - 반응 분석 및 시간 - 중 - 추가 TOA () 분석 등의 세 가지 분석은 물론, 개발, 최적화, 검증 및 Bluetongue 바이러스에 대한 새로운 항 바이러스제 (BTV)를 식별하기 위해 사용 된 새로 확인 된 항 바이러스제에 사용할 수있는 기계 장치의 액션 (대학교 미술관)을 결정하기로.

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

여기에서는 새로운 항바이러스제를 식별하고 평가하기 위해 바이러스 진입의 특정 단계를 검사하는 프로토콜을 제시합니다.

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

아레나바이러스 수명 주기의 첫 번째 단계는 바이러스 입자를 숙주 세포에 부착하는 것입니다. 아레나바이러스 부착 이벤트의 초고감도 검출 및 정량화를 위한 정량적 (q)RT-PCR 기반 분석을 보고합니다.

Arenavirus 셀 첨부 파일의 측정을위한 고감도 분석

여기, 선물이 arbovirus 복제 및 arbovirus 복제를 제한 하는 2) 진 핵 호스트 요인 1) 바이러스 인코딩된 immunomodulators 식별 프로토콜. 이러한 형광 및 발광 기반 방법을 빠르게 낮은 신호 대 잡음 비율 단순한 분석에 arbovirus 복제의 양적 정보를 연구 수 있습니다.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

우리는 바이러스성 다단백질에 내장된 상동 호스트 병원체 단백질 서열(SSHHPS)의 짧은 스트레칭을 확인하기 위한 일반적인 프로토콜을 제시한다. SSHHPS는 바이러스 성 프로테아제에 의해 인식되고 여러 그룹 IV 바이러스에 의해 특정 숙주 단백질의 표적 파괴를 지시한다.

시험관 내 및 실리코 방법을 사용한 그룹 IV 바이러스 성 SSHHPS 분석

본 프로토콜은 HA, S 당단백질, 관련 하이브리드형 글리칸 및 고만노스 올리고당에 대한 CV-N 결합을 검사하기 위한 SPR 결합 분석을 위한 새로운 도구를 설명합니다. SPR은 이량체 또는 단량체 CV-N을 이들 글리칸에 결합시키기 위한KD 를 결정하기 위해 사용된다.

표면 플라즈몬 공명을 통한 항바이러스제 엔지니어링

이 글에서는 루시퍼레이스 리포터 시스템을 이용한 SARS-CoV-2 의사형 입자를 생성하는 방법론과 이를 이용해 진입 억제제를 식별하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 재조합 인간 ACE2-Fc 융합 단백질과 소분자 화합물 아르비돌이라는 두 가지 다른 진입 억제제를 사용하여 입증되었습니다.

MLV 기반 가성바이러스를 이용한 SARS-CoV-2 진입 억제제를 잠재적 항바이러스제로 식별하는 절차

학습하세요 Coxsackievirus A16 바이러스 성 입력 억제제 후보를 확인하는 방법을 배우세요. 시간별 추가 분석과 분자 도킹 기법을 활용하여 항바이러스 소분자 물질을 발견하는 체계적인 접근법을 익히세요.

Coxsackievirus A16에 대하여 항바이러스 후보의 확인을 위한 바이러스 성 입력 분석 및 분자 도킹 분석의 사용

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