바이러스 불활성화 분석을 통한 항바이러스 테스트 화합물의 효과 평가

조합 C형 간염 바이러스 또는 분비된 루시페라아제 리포터를 암호화하는 RNA를 포함하는 HCV 현탁액이 포함된 튜브를 복용하십시오.

항바이러스 테스트 화합물과 용매를 테스트 및 음성 대조군 튜브에 추가합니다.

테스트 화합물은 HCV 당단백질에 결합하여 바이러스를 비활성화합니다.

배양 후, 후속 단계에서 화합물-세포 상호작용을 방지하기 위해 혼합물을 희석합니다.

이러한 희석된 혼합물을 HCV 복제 지원 간암 단층에 첨가하십시오. 인큐베이트.

화합물 비활성화 HCV는 특정 세포 표면 수용체에 부착할 수 없는 반면, 활성 HCV 당단백질은 이러한 수용체에 결합하여 세포 부착을 촉진합니다.

흡착되지 않은 HCV를 제거합니다. 완충액으로 세척하고 배지를 추가합니다. 장기간 배양하십시오.

결합된 HCV는 내재화되어 바이러스 RNA를 방출하고 세포에서 분비되는 바이러스 단백질 및 루시페라아제 합성을 유도합니다.

루시페라아제 함유 배양 상청액을 수집합니다. 원심분리하고 루시페라아제 기질을 상청액에 첨가합니다.

루시페라제는 기질을 산화시켜 빛을 방출합니다.

테스트보다 대조군 웰의 발광이 높으면 화합물에 의한 바이러스 비활성화를 나타냅니다.

바이러스 비활성화 분석을 시작하려면 먼저 96웰 플레이트에서 웰당 네 번째 세포에 10배 10배 플레이트합니다. 부착을 위해 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 밤새 배양합니다. 감염의 경우, 텍스트 프로토콜에서 참조한 대로 Gaussia luciferase 리포터 태그가 있는 C형 간염 바이러스 또는 HCV 입자를 준비합니다.

멸균 튜브에서 100마이크로몰 CHLA 또는 PUG 100마이크로리터와 100마이크로리터 10을 HCV의 네 번째 초점 형성 장치 또는 FFU에 혼합합니다. 양성 대조군의 경우 HCV와 헤파린을 밀리리터당 1,000마이크로그램의 최종 농도로 혼합합니다. 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다.

3시간 후, 바이러스 화합물 혼합물을 실온에서 9.8밀리리터의 기초 배지로 50배 희석합니다. 그런 다음 새로운 바이러스 화합물 혼합물을 준비하고 이 혼합물을 즉시 기초 배지에서 희석하여 0시간 배양 샘플을 만듭니다. 세포에서 배양 배지를 제거한 후, 웰당 100마이크로리터의 희석된 바이러스 약물 용액을 3회에 걸쳐 첨가합니다.

용액에는 웰당 10개에서 두 번째 FFU가 포함되어 있습니다. 세포의 바이러스 감염을 허용하기 위해 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 3시간 동안 배양합니다. 배양 후, 웰에서 바이러스 현탁액을 제거하고 200마이크로리터의 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다.

바이러스 복제 및 루시페라아제 리포터의 상청액 방출을 위해 100마이크로리터의 기초 배지에서 72시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 배양액에서 상청액을 마이크로튜브에 수집하고 섭씨 4도에서 5분 동안 17,000배 g으로 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 각 상청액 20마이크로리터를 가우시아 루시페라제 분석 시약 50마이크로리터와 혼합하고 루미노미터에서 루시페라아제 리포터 활성의 발광을 측정합니다.