라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하여 eIF4F 어셈블리 모니터링

eIF4F 복합체 신호전달의 조절은 암 증식 및 생존에 관여하는 mRNA 하위 집합의 번역 증가와 관련이 있습니다. 여기에서는 살아있는 세포의 eIF4F 복합체 무결성에서 약물 유도 섭동을 평가할 수 있는 eIF4E-eIF4G 세포 기반 단백질-단백질 상호 작용 분석에 대해 설명합니다. 단백질-단백질 계면을 효율적으로 표적으로 하는 양식 개발에 대한 관심이 높아지고 있습니다.

우리는 eIF4E-eIF4G PPI 분석이 이러한 전략을 육성하고 검증하는 데 도움이 될 것으로 예상했습니다. 이 분석은 eIF4E-eIF4G 억제제의 최적화를 주도하기 위한 최적의 기본 계획을 제공할 것입니다. 세포를 올바르게 seeding하고 transfer transfection을 수행하는 것은 PPI 보고 시스템의 억제에 직접적으로 반영될 수 있기 때문에 이 제품의 가장 어려운 측면입니다.

세포를 해동하고 계수한 후 웰당 293ml의 표준 성장 배지를 사용하여 HEK 293 세포로 6웰 플레이트를 시딩합니다. 2일차 아침, 계획된 각 형질주입에 대해 페놀 레드가 없는 125마이크로리터의 환원된 혈청 배지가 들어 있는 튜브에 9마이크로리터의 리포솜 기반 용액을 희석합니다. 희석된 리포좀이 실온에서 5분 동안 배양하는 동안, 각 transfection tube에 대해 125마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 각 플라스미드 3μg을 희석하여 DNA의 마스터 믹스를 준비합니다.

DNA 마스터 믹스 2에 12마이크로리터의 인핸서 시약을 첨가한 후 잘 혼합합니다. 즉시 이 혼합물을 희석된 리포솜의 각 튜브에 1:1의 비율로 첨가합니다. 이 DNA 지질 복합체를 실온에서 15분 동안 배양한 후 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 복합체를 추가합니다.

섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 세포를 24시간 동안 배양합니다. 3일차 아침에 PBS 1ml로 각 웰을 헹구고 트립신 0.3ml를 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.

배양 후, 페놀 레드가 없는 환원된 혈청 배지의 각 웰에 2ml를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 형질주입된 세포를 15ml 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 290x G에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.

배지를 흡인하고 세포 펠릿을 환원된 혈청 배지 2ml에 다시 현탁시킵니다. 형질주입된 HEK 293 세포를 96웰 불투명 플레이트에 90마이크로리터의 배지에서 웰당 30, 000개의 세포 밀도로 파종합니다. 동일한 실험 내에서 3개의 서로 다른 화합물에 대한 3개의 기술적 재현을 얻으려면 60개의 웰을 파종합니다.

가장자리의 우물을 제외합니다. 형질주입된 세포를 파종한 직후, 각 웰에 10%DMSO 화합물 용액 10마이크로리터를 추가합니다. 관심 화합물을 각각 100% DMSO에 용해시켜 1 밀리몰 화합물 원액을 준비합니다.

각 화합물 적정에 대해 3회 반복하려면 8마이크로리터의 1밀리몰 복합 원액을 사용하십시오. 각 적정점에 대해 4마이크로리터의 1밀리몰 스톡을 4마이크로리터의 100% DMSO로 피펫팅하여 96웰 PCR 플레이트의 8웰에서 각 스톡 화합물 용액을 2배 연속 희석합니다. 2 배 연속 희석의 마지막 지점 이후에 초과 4 마이크로 리터를 폐기하십시오.

각 튜브에 36마이크로리터의 HPLC 등급 멸균수를 추가하여 10% DMSO에서 40마이크로리터의 10x 복합 직렬 희석 용액을 준비합니다. 또한 컨트롤을 준비합니다. 10%DMS는 HPLC 등급 멸균수에 있는 유일한 재고 용액입니다.

96웰 불투명 플레이트의 셀에 10x 작업 용액 10마이크로리터를 추가하여 잔류 DMSO 농도가 1%인 최종 농도를 산출합니다.섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 플레이트를 3시간 동안 배양합니다. 3시간 후, 1부피의 기질과 19부피의 희석 시약을 결합하여 루시퍼라제 기질 시약 준비를 시작합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 25마이크로리터의 기질 시약을 셀이 있는 96웰 플레이트의 각 웰에 즉시 추가합니다.

실온에서 350분 동안 350RPM의 오비탈 셰이커에서 플레이트를 흔듭니다. 발광을 평가하려면 플레이트 리더기에 플레이트를 놓습니다. 미러 리더를 발광으로 설정하고 방출 필터를 455로 설정합니다.

6.5mm의 측정 높이와 1초의 측정 시간을 사용합니다. 세포 생존율을 평가하기 위해 각 웰에 33마이크로리터의 생존도 분석 시약을 추가합니다. 실온에서 15분 후 미러 리더를 발광으로 설정하고 방출 필터를 600으로 설정하여 플레이트 리더로 발광을 평가합니다.

6.5mm의 측정 높이와 1초의 측정 시간을 사용합니다. 플레이트 리더의 데이터를 사용하여 원고에 설명된 4-파라미터 피팅 곡선 방정식에 데이터를 곡선 피팅하여 각 화합물의 IC 50 값을 결정합니다. HEK 293 세포를 eIF4E-eIF4G 보체 시스템으로 형질주입한 후 후퇴시키고 mTOR 억제제로 처리했습니다.

치료 4시간 후 발광을 평가했을 때, PP242와 라파마이신은 모두 신호의 용량 의존적 억제를 생성했습니다. PP242와 라파마이신 모두 세포 생존율을 현저히 감소시키지 않았으며, 이는 eIF4E-eIF4G 보체 시스템의 발광 감소가 비특이적 세포 사멸 때문이 아니라 EIF4E-4G 상호 작용의 중단에 기인함을 나타냅니다. m7GTP 풀다운 실험에 따른 웨스턴 블롯 분석은 내인성 eIF4E-eIF4G 상호 작용의 4EBP1 매개 중단이 측정된 eIF4E-eIF4G 분석 신호와 상관관계가 있음을 보여주었습니다.

PP242는 라파마이신보다 총 4EBP1 인산화를 더 강력하게 억제하는 약물이었습니다. 두 억제제 모두 라파마이신이 mTORC1 기질에 대해 더 활성화되고 PP242가 mTORC1과 mTORC2를 모두 표적으로 하는 등 mTOR 신호전달에 정상적으로 영향을 미쳤습니다. 이 제품의 가장 중요한 측면은 거래 당일 세포를 파종하고, 페놀 레드가 없는 배지에서 세포를 다시 파종하고, eIF4E-eIF4G 보체 분석의 발광을 평가하고, 동일한 플레이트에서 생존력 분석을 실행하는 것입니다.

2차 생존도 분석을 수행하여 표적 및 알려진 특정 효과의 약물을 평가할 수 있습니다.