Name: 라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하여 eIF4F 어셈블리 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하는 방법으로 eIF4F 복합체 역학을 평가하고 암 치료제 개발을 위한 단백질-단백질 상호 작용 억제제를 최적화하세요.

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이 작품은 p53lab (BMSI, A * STAR)과 JCO VIP 보조금 (A * STAR)의 핵심 예산에 의해 지원되었습니다.

HEK293 세포주 프로토콜에 사용되었고 덜벡코의 수정된 이글 배지에서 10% 태아 소 혈청, 2mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신으로 보충하였다. 세포는 가습 환경에서 5% CO2로 37°C에서 배양되었다.
1. eIF4E:eIF4G604-646 보완 분석등을 통한 eIF4F 복잡한 중단에 대한 정량적 평가
<ol><li>eIF4E:eIF4G604-646 보완 분석의 세포 배양 및 일시적인 연분<ol>
<li>모든 실험에 20개 미만의 구절을 사용하여 새로 해동된 세포를 사용하십시오. 1일째에는 표준 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 결정하고 Trypan blue 제외방법(13)을사용하여 실행 가능한 총 셀을 계산한다.</li>
		<li>종자 6웰 플레이트0.9 - 1.2 x 106 의 HEK 293 셀의 2 mL에서 표준 성장 배지. 참고: 위에 표시된 세포주 내에서 최상의 경질 효율을 달성하기 위해 도금 된 세포가 시드 후 하루에 70-90 % 응수되도록하십시오.</li>
		<li>2일 오전, SubA-eIF4E 및 eIF4G604-646-SubB플라스미드를 이용한 공동 트랜스펙트 세포는 지질계 형 질산성 트랜스포마이트 시약(재료표참조)을 사용한다.<ol>
<li>각 배설물및 실온에서 5분 동안 배양하는 페놀 레드 없이 125 μL의 감소된 혈청 배지를 함유한 튜브에 리포솜 기반 용액의 9μL을 희석시하십시오.</li>
			<li>각 피질 튜브에 대해 125 μL의 감소된 혈청 배지에 각 플라스미드의 3 μg를 희석하여 DNA의 마스터 믹스를 준비합니다.</li>
			<li>DNA 마스터 믹스 튜브에 증강 기시약 12 μL을 추가하고 잘 섞은 다음 DNA를 즉시 추가합니다: 증강 마스터 믹스는 희석된 리포좀의 각 튜브에 1:1비율로 혼합됩니다. 실온에서 15분 동안 배양하십시오.</li>
			<li>각 우물에 DNA 지질 복합체를 추가하고 24h에 대해 5 % CO2로 37 °C 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3일 아침, PBS 1mL로 각각 헹구는 다.</li>
		<li>PBS를 제거하고 37°C에서 5분 동안 트립신의 0.3mL로 각각 의 세포를 배양한다.</li>
		<li>각 우물에 0% FCS를 함유하는 페놀 레드 없이 감소된 혈청 배지의 2mL을 첨가하여 트립신을 중화시키고 15mL 튜브로 전염된 세포를 전달한다. 참고: 페놀 레드는 루시파아제 활동을 방해할 수 있습니다. 따라서, 세포는 페놀 레드 없이 매체에서 이 단계에서 부터 처리되어야 합니다.</li>
		<li>290 x g에서 5 분 동안 셀을 회전시키고 매체를 흡인시합니다. 0% FCS를 함유하는 페놀 레드 없이 감소된 혈청 배지의 2mL에서 세포를 다시 중단한다. 1.1 단계에서 설명된 대로 계산합니다.</li>
		<li>종자 0% FCS를 함유하지 않고 96개의 불투명 플레이트에서 90,000개의 세포밀도로 HEK 293 세포를 감염하였다. 3가지 상이한 화합물에 대해 동일한 실험 내에서 3개의 기술적 복제를 얻기 위해, 가장자리의 우물을 제외한 세포가 있는 플레이트의 60웰을 시드한다.</li>
		<li>감염된 세포를 파종한 직후 10μL의 10μL를 DMSO 화합물 용액을 추가합니다(1.2단계 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>복합 제제<ol>
<li>100% DMSO(v/v)로 관심 화합물을 용해시켜 1m 복합 스톡 솔루션을 준비한다. 각 화합물 적정에 대해 3개의 복제를 갖기 위해 1mM 복합 스톡 용액의 8μL을 사용하십시오. 참고 : 사용되는 1 mM 재고 화합물의 볼륨은 필요한 것보다 더 많은 것입니다. 이 작업은 피펫팅 오류를 고려하기 위해 수행됩니다.</li>
		<li>1m 스톡의 4μL을 각 적정점에 대해 100% DMSO의 4μL로 재고 화합물 용액의 2배 연속 희석을 수행한다. 참고: 완전한 복합 적정의 경우 시작 재고로부터 9개의 직렬 희석을 100% DMSO로 수행합니다. 여러 화합물을 테스트해야 하는 경우 이 단계와 후속 희석을 용이하게 하기 위해 96개의 웰 플레이트와 멀티채널 파이펫을 사용하십시오.</li>
		<li>2배 의 직렬 희석의 각 지점에 대해 36μL의 HPLC 급 멸균수를 추가하여 10% DMSO(v/v)에서 10배 작동 용액의 40μL을 준비합니다(즉, 100 μM ~ 0.39 μM ~ 0.39 μM 10% DMSO 스톡 시리즈는 0.039%에 10μMM의 최종 용액으로 이어질 때 0.039%의 최종 용액으로 이어질 것이다). 처리 제어는 HPLC 급 멸균 수에서 10% DMSO 전용 재고 용액을 준비합니다.</li>
		<li>10μL의 10μL을 96개의 잘 불투명한 플레이트에 추가하여 잔류 DMSO 농도가 1%(v/v)의 잔류 DMSO 농도를 100μL의 총 부피로 산출하고 5% v/v 대기 CO2로37°C에서 3시간 동안 배양한다.</li>
	</ol></li>
	<li>루시파아제 보완 및 생존 가능성 분석<ol>
<li>3h의 약물 섭취 후, 1부량의 기판과 희석 시약 19권의 희석 시약을 결합하여 루시파라기 기질 시약을 준비하기 시작한다(제조업체의 지침 참조). 참고: 루시파라제 분석은 시판되는 키트를 사용하여 수행됩니다(재료표참조).</li>
		<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 기판 시약 25μL을 즉시 추가합니다.</li>
		<li>350 rpm에서 실온에서 궤도 셰이커에서 50 분 동안 접시를 흔들어보십시오.</li>
		<li>플레이트 판독기를 사용하여 발광을 평가합니다. 이렇게 하려면 미러 판독기를 발광 및 455에 방출 필터에 설정합니다. 측정 높이는 6.5mm로 측정 시간이 1s입니다.</li>
		<li>세포 생존가능성을 제고하기 위해 33μL의 생존가능성 분석 시약을 추가한 다음, 플레이트 판독기를 사용하여 실온에서 15분 후에 발광을 다시 측정합니다.</li>
		<li>600nm에 미러 판독기와 방출 필터를 설정하여 플레이트 판독기의 발광을 평가합니다. 측정 높이는 6.5mm로 측정 시간이 1s입니다. 참고: 생존능력은 제조업체 지침에 따라 세포 용해시에 따른 ATP의 세포내 수준을 측정하여 평가됩니다. 이 경우 생존 가능성 분석이 다른 방출 파장을 가진 다른 루시파라제를 사용하기 때문에 멀티플렉스가 가능합니다.</li>
		<li>데이터를 사용하여 데이터를 4파라미터 피팅 곡선 방정식에 맞게 곡선을 사용하여 각 화합물의 IC50 값을 결정합니다. Y = ((A-D)/(1+(x/C)^B)) + D 숫자 값 D와 A는 곡선 피팅 프로세스에서 구속되어야 합니다. eIF4E:4G 보완 분석에서 예상되는 최소한의 곡선 연삭 또는 최소한의 이론적 반응 수준에 대한 Y축의 발광 값. eIF4E:4G 보완 분석에서 예상되는 최대 곡선 연삭 또는 최대 이론적 레벨 응답에 대한 Y축의 발광 값입니다. 참고: 최소 응답에 대한 값은 1% DMSO(v/v) 대조군 처리로부터 파생되며 최대 반응의 값은 세포 생존에 영향을 미치지 않고 고원된 높은 친화성 mTOR 억제제의 최대 반응으로부터 파생된다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. eIF4E:eIF4G604-646 분석 억제와 eIF4F 복합 중단
<ol><li>분석에 의해 측정되는 신호가 화합물에 의한 eIF4E-eIF4G 상호작용의 물리적 중단에 대응하는지 확인하기 위해, 종자 세포는 1.1단계에서 설명된 바와 같이.</li>
	<li>다음날, 배지를 페놀 레드를 함유하지 않는 감소된 혈청 배지의 1mL로 교체하고 관심 있는 화합물로 4h에 대해 배양한다. 총 부피 1mL에서 잔류 DMSO 농도를 1%(v/v)로 보장합니다. 참고: 결과와의 상관관계를 쉽게 허용하기 위해 측정된 보완 분석 분석 곡의 시작점, 중간점 및 끝점에서 복합 농도를 사용한다.</li>
	<li>Lyse 세포 및 수행 m7GTP eIF4F 및 eIF4E:4EBP1 복합체를 격리 아래로 당겨. m7GTP 풀 다운 실험을 수행하는 방법에 대한 자세한 절차는 다른 곳에서 찾을 수 있습니다14.</li>
	<li>서쪽 블롯 분석에 의해 m7GTP 바운드 eIF4G, eIF4E 및 4EBP1 단백질 수준을 검출한 다음, 보완 분석 신호 억제와 eIF4F 복잡한 중단과 상관관계가 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanism+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li>
<li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+translation+machinery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li>
<li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex%3A+a+critical+nexus+for+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li>
<li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis%3A+the+role+of+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li>
<li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF4E%3A+A+retrospective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li>
<li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li>
<li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G%3A+comparison+with+eIF4E-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li>
<li>Grüner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li>
<li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).</li>
<li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1%3A+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li>
<li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Translation%22%5BJournal%5D)">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819(2013).</li>
<li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40(2019).</li>
<li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+protein-protein+interactions+%28PPIs%29%3A+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li>
</ol>

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본 문서에 설명된 방법은 라이브 셀에서 eIF4G-eIF4E 상호작용의 직접 측정을 통해 eIF4F 복합 조립을 정량적으로 모니터링하기 위해 루시파라제 계 보완 분석법을 활용한다. eIF4E-eIF4G 보완 시스템의 사용에 대한 세부 정보를 제공하고 있으며, 또한 eIF4E-eIF4G 상호작용16의약물 유발 4EBP1 매개 해리를 측정하는 데 시스템이 매우 정확하다는 것을 보여주었습니다. 이 분석의 처리량을 용이하게하기 위해 이 문서에 설명된 실험 용 설정은 96 개의 마이크로 플레이트 형식 사용을 위해 설계되었습니다.
최적의 결과를 얻으려면 분석 작업을 수행할 때 두 가지 중요한 단계를 고려해야 합니다. 첫째, 실험 간의 전환 효율은 유사하게 유지되어야 합니다. 이것은 낮은 통로 수 세포의 사용을 통해 보장 될 수있다, 엄격하게 파종의 날에 세포를 계산하여. 세포 융합은 또한 DNA 형질이 수행되기 전에 평가되어야 하며, 세포 결합이 ...

유전자 발현의 제어는 성장 증식 및 분화와 같은 세포 프로그램의 올바른 실행에 중추적 인 역할을한다. 조절 제어 메커니즘은 유전자 전사 수준 또는 mRNA 번역 수준에서 발휘될 수 있다. 지난 10 년 동안, 그것은 점점 더 분명 해지고 있다 개시 과정의 변조에 의해 번역 제어 보다는 오히려 신장 및 종료의 후반 단계 보다는 생물학적 기능의 넓은 범위를 재생 하는 단백질의 특정 하위 집합의 합성을 미세 하 게 조절할 수 있습니다.
생존에 관여하는 mRNA의 증가된 번역, 반자율적 및 반세포 반응은 여러 암에 연루되어 왔으며 또한 비정상적인 활성화 또는 번역 개시 요인1의발현에 인과 관계가 있다.
eIF4F 컴플렉스는 번역 개시의 마스터 레귤레이터입니다. mRNAs의 5'끝에 캡 구조를 결합함으로써, eIF4F는 초기 mRNA-리보솜 모집을 구동하고 차례로 약하게 번역 진핵 mRNA2의mRNA 번역 효율을 증가시키고 있다. eIF4F는 RAS/MAPK 또는 AKT/TOR 경로의 비정상적인 활성화를 수용하는 많은 암 모델에 대해 암 관련 mRNAs의 번역을 중재하여 암세포가 eIF4F를 조절하여 자체 신생물 활성을 강화하는 것을 시사합니다. eIF4F 복합형성을 억제하여 이 피드 포워드 루프의 중단은 매우 유망한 치료 전략3,4이다.
eIF4F 복합체는 (i) eIF4E, mRNA의 5' UTR에서 발견되는 캡 결합 서브유닛, (ii) eIF4A, RNA 헬리케이스 및 (iii) eIF4G, eIF4A 와 상호 작용하는 비계 단백질로 구성되며 결국40개의서브보를 모집한다. eIF4E와 eIF4G 연결은 기능성 eIF4F 복합체의 조립을 위한 속도 제한 단계이며 eIF4E 결합 단백질(4EBP, 멤버 1, 2 및 3)에 의해 부정적으로 조절된다6. 4EBP는 표준 및 비정식 eIF4E 바인딩 시퀀스7,8,9(인간 eIF4E에 대한 aa 604-646에 걸친 영역)로 구성된 인터페이스를 통해 eIF4E에 eIF4E 결합을 결합하여 eIF4E 복합 형성을 적극적으로 방지하는 eIF4E의 풀을 감소시킵니다. 이러한 단백질 단백질 상호 작용의 상호 작용은 주로 4EBP의 라파마이신 (mTOR)의 포유 동물 표적에 의해 조절된다. 미토제닉 자극시, mTOR은 4E-BP 단백질 제품군의 구성원을 직접 인광하여 eIF4E와의 연관성을 감소시키고, 이에 따라 eIF4E-eIF4G 상호 작용 및 기능성 eIF4F 복합체의 형성을 촉진한다10.
eIF4F 복잡한 무결성을 대상으로 하는 화합물 개발에 큰 노력에도 불구하고, 라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용의 직접적인 중단을 측정하는 아세약의 부족은 세포 활성 히트 화합물에 대한 검색을 제한했다. 우리는 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 통해 eIF4F 무결성의 상태를 실시간으로 모니터링하기 위해 coelenterazine 아날로그 (예를 들어, 나노 루크 기반 보완 분석)에 따라 루시파라제 분석체를 적용했습니다. 루시파아제 보완 단백질 시스템은 최소 자기 연결 및안정성(11)에최적화된 18kDa 단백질 단편(SubA)과 11개의 아미노산 펩타이드 단편(SubB)으로 구성된다. 인간 전체 길이 eIF4E 및 eIF4E 상호작용 도메인을 인간 eiF4G1(aa 604-646)으로부터 융합 제품으로 발현하면, 두 개의 상호 작용 단백질은 SubA 및 SubB 단편을 서로 가까이에 가져오고, 세포 침투성 기판의 존재가 결국 1개의 발광을 생성하게된다는활성 루시파아제의 형성을 유도할 것이다. 우리는 다른 곳에서 eIF4E:eIF4G604-646 보완 시스템16의시공 및 검증을 보고했다.
여기서는 eIF4E:eIF4G604-646 상호 보완 시스템(요청 시 사용 가능)을 사용하여 라이브 셀에서 4EBP1 매개 eIF4E-eIF4G 중단을 정확하게 측정할 수 있는 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 잠재적인 암 치료 약으로 현재 임상 시험을 받고 있는 몇몇 mTOR 억제제의 효력을 측정해서 그것의 유용성을입증합니다 12. 오프 타겟 효과는 종종 약물 관련 활동을 마스크하기 때문에, 우리는 또한 eIF4E:eIF4G604-646 시스템 측정의 다재다능성을 고려하기 위해 세포 생존성의 직교 측정으로 확장 될 수있는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>293FT 세포</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 마이크로플레이트 96 well, F-Bottom</td><td>greiner bio-one</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>Cell titer Glo 2.0</td><td>PROMEGA</td><td>G9241</td><td></td></tr><tr><td>Envision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>not applcable</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 멀티채널 피펫 12채널 5-50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662050</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE6</td><td>PROMEGA</td><td>E2692</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI 스타터 시스템</td><td>PROMEGA</td><td>N2014</td><td></td></tr><tr><td>Optimem I 감소 혈청 중앙값, 페놀 레드 없음</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Eppendorf</td><td>적용 불가</td><td></td></tr><tr><td>&감마;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-155S</td><td></td></tr></tbody></table>

라이브 셀에서 eif4e-eif4g 상호 작용을 측정하여 eif4f 어셈블리 모니터링

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

eIF4F 복합체의 형성은 종종 인간에서 온코겐성 활성화를 겪는 신호 경로의 수렴을 위한 핵심 다운스트림 노드로 나타났습니다. eIF4F는 변환 개시의 mRNA-리보솜 모집 단계에 관여하는 캡 결합 복합체이다. 암의 많은 세포 및 전임상 모델에서 eIF4F의 규제 완화는 암 증식 및 생존에 관여하는 특정 mRNA 하위 집합의 증가된 번역으로 이어집니다. eIF4F는 캡 결합 서브유닛 eIF4E, 헬리케이스 eIF4A 및 스캐폴딩 서브유닛 eIF4G로부터 제작된 이종트리메릭 복합체이다. 활성 eIF4F 복합체의 조립에 중요한 것은 eIF4E와 eIF4G 단백질 간의 단백질 단백질 상호 작용이다. 이 문서에서는 라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용 상태를 모니터링하는 eIF4F 어셈블리를 측정하는 프로토콜을 설명합니다. eIF4e:4G 세포 기반 단백질 단백질 상호 작용 분석법은 또한 eIF4F 복합 무결성의 약물 유도된 변화가 정확하고 안정적으로 평가될 수 있도록 합니다. 우리는 이 방법이 시판되는 화합물의 활성을 확인하거나 eIF4F 복합체의 형성을 효율적으로 방해하는 새로운 화합물 또는 양식의 추가 스크리닝을 위해 적용될 수 있다고 구상합니다.

eIF4E:eIF4G604-646 보편시스템의 감도를 검증하기 위해, eIF4F 복합 조립체의 4EBP1 중재 억제는 mTOR 억제제를 사용하여 평가되었다. 4EBP 단백질 제품군의 mTORC1 키나아제 의존형 인산화를 억제함으로써, mTOR 억제는 eIF4E에 4EBP1 연결을 강화하여, 따라서 eIF4F 분해15. mTOR 키나아제의 기계적으로 다른 억제제의 두 종류는 시험되었다: 라팔로그 (예를 들어, 라파마이신) 이는 mTORC1의 알로스터 억제제이지만 mTORC2 및 ATP 경쟁 기반 억제제 (예를 들어, PP242) mTORC1 과 mTORCa 양성 활성을 모두 억제하도록 특별히 설계되었습니다.
HEK293 세포는 1단계에서 설명된 바와 같이 eIF4E:eIF4G604-646</su...

여기서, 우리는 사용자가 선별 형식으로 eIF4F 복잡한 역학의 약물 유도 된 동요를 평가 할 수 있도록 살아있는 세포에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하는 프로토콜을 제시한다.

라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하여 eIF4F 어셈블리 모니터링

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

eIF4F 복합체 신호전달의 조절은 암 증식 및 생존에 관여하는 mRNA 하위 집합의 번역 증가와 관련이 있습니다. 여기에서는 살아있는 세포의 eIF4F 복합체 무결성에서 약물 유도 섭동을 평가할 수 있는 eIF4E-eIF4G 세포 기반 단백질-단백질 상호 작용 분석에 대해 설명합니다. 단백질-단백질 계면을 효율적으로 표적으로 하는 양식 개발에 대한 관심이 높아지고 있습니다.우리는 eIF4E-eIF4G PPI 분석이 이러한 전략을 육성하고 검증하는 데 도움이 될 것으로 예상했습니다. 이 분석은 eIF4E-eIF4G 억제제의 최적화를 주도하기 위한 최적의 기본 계획을 제공할 것입니다. 세포를 올바르게 seeding하고 transfer transfection을 수행하는 것은 PPI 보고 시스템의 억제에 직접적으로 반영될 수 있기 때문에 이 제품의 가장 어려운 측면입니다.세포를 해동하고 계수한 후 웰당 293ml의 표준 성장 배지를 사용하여 HEK 293 세포로 6웰 플레이트를 시딩합니다. 2일차 아침, 계획된 각 형질주입에 대해 페놀 레드가 없는 125마이크로리터의 환원된 혈청 배지가 들어 있는 튜브에 9마이크로리터의 리포솜 기반 용액을 희석합니다. 희석된 리포좀이 실온에서 5분 동안 배양하는 동안, 각 transfection tube에 대해 125마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 각 플라스미드 3μg을 희석하여 DNA의 마스터 믹스를 준비합니다.DNA 마스터 믹스 2에 12마이크로리터의 인핸서 시약을 첨가한 후 잘 혼합합니다. 즉시 이 혼합물을 희석된 리포솜의 각 튜브에 1:1의 비율로 첨가합니다. 이 DNA 지질 복합체를 실온에서 15분 동안 배양한 후 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 복합체를 추가합니다.섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 세포를 24시간 동안 배양합니다. 3일차 아침에 PBS 1ml로 각 웰을 헹구고 트립신 0.3ml를 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.배양 후, 페놀 레드가 없는 환원된 혈청 배지의 각 웰에 2ml를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 형질주입된 세포를 15ml 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 290x G에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.배지를 흡인하고 세포 펠릿을 환원된 혈청 배지 2ml에 다시 현탁시킵니다. 형질주입된 HEK 293 세포를 96웰 불투명 플레이트에 90마이크로리터의 배지에서 웰당 30, 000개의 세포 밀도로 파종합니다. 동일한 실험 내에서 3개의 서로 다른 화합물에 대한 3개의 기술적 재현을 얻으려면 60개의 웰을 파종합니다.가장자리의 우물을 제외합니다. 형질주입된 세포를 파종한 직후, 각 웰에 10%DMSO 화합물 용액 10마이크로리터를 추가합니다. 관심 화합물을 각각 100% DMSO에 용해시켜 1 밀리몰 화합물 원액을 준비합니다.각 화합물 적정에 대해 3회 반복하려면 8마이크로리터의 1밀리몰 복합 원액을 사용하십시오. 각 적정점에 대해 4마이크로리터의 1밀리몰 스톡을 4마이크로리터의 100% DMSO로 피펫팅하여 96웰 PCR 플레이트의 8웰에서 각 스톡 화합물 용액을 2배 연속 희석합니다. 2 배 연속 희석의 마지막 지점 이후에 초과 4 마이크로 리터를 폐기하십시오.각 튜브에 36마이크로리터의 HPLC 등급 멸균수를 추가하여 10% DMSO에서 40마이크로리터의 10x 복합 직렬 희석 용액을 준비합니다. 또한 컨트롤을 준비합니다. 10%DMS는 HPLC 등급 멸균수에 있는 유일한 재고 용액입니다.96웰 불투명 플레이트의 셀에 10x 작업 용액 10마이크로리터를 추가하여 잔류 DMSO 농도가 1%인 최종 농도를 산출합니다.섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 플레이트를 3시간 동안 배양합니다. 3시간 후, 1부피의 기질과 19부피의 희석 시약을 결합하여 루시퍼라제 기질 시약 준비를 시작합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 25마이크로리터의 기질 시약을 셀이 있는 96웰 플레이트의 각 웰에 즉시 추가합니다.실온에서 350분 동안 350RPM의 오비탈 셰이커에서 플레이트를 흔듭니다. 발광을 평가하려면 플레이트 리더기에 플레이트를 놓습니다. 미러 리더를 발광으로 설정하고 방출 필터를 455로 설정합니다.6.5mm의 측정 높이와 1초의 측정 시간을 사용합니다. 세포 생존율을 평가하기 위해 각 웰에 33마이크로리터의 생존도 분석 시약을 추가합니다. 실온에서 15분 후 미러 리더를 발광으로 설정하고 방출 필터를 600으로 설정하여 플레이트 리더로 발광을 평가합니다.6.5mm의 측정 높이와 1초의 측정 시간을 사용합니다. 플레이트 리더의 데이터를 사용하여 원고에 설명된 4-파라미터 피팅 곡선 방정식에 데이터를 곡선 피팅하여 각 화합물의 IC 50 값을 결정합니다. HEK 293 세포를 eIF4E-eIF4G 보체 시스템으로 형질주입한 후 후퇴시키고 mTOR 억제제로 처리했습니다.치료 4시간 후 발광을 평가했을 때, PP242와 라파마이신은 모두 신호의 용량 의존적 억제를 생성했습니다. PP242와 라파마이신 모두 세포 생존율을 현저히 감소시키지 않았으며, 이는 eIF4E-eIF4G 보체 시스템의 발광 감소가 비특이적 세포 사멸 때문이 아니라 EIF4E-4G 상호 작용의 중단에 기인함을 나타냅니다. m7GTP 풀다운 실험에 따른 웨스턴 블롯 분석은 내인성 eIF4E-eIF4G 상호 작용의 4EBP1 매개 중단이 측정된 eIF4E-eIF4G 분석 신호와 상관관계가 있음을 보여주었습니다.PP242는 라파마이신보다 총 4EBP1 인산화를 더 강력하게 억제하는 약물이었습니다. 두 억제제 모두 라파마이신이 mTORC1 기질에 대해 더 활성화되고 PP242가 mTORC1과 mTORC2를 모두 표적으로 하는 등 mTOR 신호전달에 정상적으로 영향을 미쳤습니다. 이 제품의 가장 중요한 측면은 거래 당일 세포를 파종하고, 페놀 레드가 없는 배지에서 세포를 다시 파종하고, eIF4E-eIF4G 보체 분석의 발광을 평가하고, 동일한 플레이트에서 생존력 분석을 실행하는 것입니다.2차 생존도 분석을 수행하여 표적 및 알려진 특정 효과의 약물을 평가할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

안달 기반 기자 점점 라이브 세포 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 여기 대상 인산화에서 세포주기 종속 변화를 평가하기 위해 안달 기반의 기자를 사용하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 기자 등 다양한 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 강력한 기술이다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법을 실험을 안달을 위해 사용하는 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

단백질 상호 작용 : SILAC의 면역 실험은 새로운 단백질을 발견하기위한 강력한 수단을 나타냅니다. 있도록하여 제어 및 시험 샘플, 진정한 상호 작용 모두에서 단백질 풍부 정확한 상대적 정량화 간단 실험 오염물 구별 될 수 있고, 선호도가 낮은 상호 작용은 덜 엄격한 버퍼 조건의 사용을 통해 유지.

SILAC - 면역 정량 프로테오믹스를 사용하여 포유 동물 세포에있는 단백질 상호 작용 파트너의 식별

단백질 합성 조절은 주로 번역 시작 단계에서 발생하며, 결핍은 다양한 장애와 관련이 있습니다. 이들의 병인을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 여기에서 번역 시작 인자 eIF4G1의 돌연변이가 있는 상태에서 mos 전사체의 번역을 평가하는 Xenopus laevis 난모세포를 사용하는 프로토콜에 대해 설명했습니다.

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

여기에서는 IRF3 전사 인자의 인산화 의존적 활성화에 대한 자세한 분석을 허용하는 절차를 설명합니다. 이는 여러 인특이성 항체를 사용하여 면역블롯에 결합된 고분해능 SDS-PAGE와 native-PAGE의 조합을 통해 달성됩니다.

고해상도 방법 IRF3의 인산화에 의존 활성화를 모니터링하려면

여기에서는 생리학적 산소 상태에서 mRNA의 5' 캡을 결합하는 번역 시작 인자를 분석하기 위한 인간 세포 배양 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 아가로스 연결 m7GTP 캡 아날로그를 사용하며 캡 결합 인자 및 이들의 상호 작용 파트너를 조사하는 데 적합합니다.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

여기에서는 살아있는 HepG2 세포에서 Akt 활성화 및 인산화의 시공간 역학을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. Förster 공명 에너지 전달(FRET) 이미징은 암세포의 인슐린 신호 전달 경로 및 대사 조절에 대한 귀중한 통찰력을 제공하는 강력한 도구입니다.

HepG2 세포에서 대사적으로 조절되는 Akt 활성화 역학의 Live-Cell Förster Resonance Energy Transfer Imaging

배우세요 라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하는 방법으로 eIF4F 복합체 역학을 평가하고 암 치료제 개발을 위한 단백질-단백질 상호 작용 억제제를 최적화하세요.

라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하여 eIF4F 어셈블리 모니터링

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