대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

이 방법의 전반적인 목표는 모든 출처의 정제된 DNA로부터 포괄적인 가이드 RNA 라이브러리를 구축하는 것입니다.gRNA 라이브러리는 CRISPR 기반 스크리닝에 사용되는 플라스미드 컬렉션입니다. CORALINA 방법은 정제된 DNA의 효소 분해를 사용하여 생성된 단편을 가이드 RNA 라이브러리 백본으로 복제합니다.

이 기술의 주요 장점은 입력 염기서열에서 가능한 모든 가이드 RNA를 생성하고 매우 비용 효율적이라는 것입니다. 이 비디오는 박테리아 인공 염색체로부터 CORALINA 라이브러리를 보호하는 방법을 보여주지만, 이 방법은 원칙적으로 모든 유기체의 모든 유형의 입력 DNA에 적용할 수 있습니다. 소코코카 뉴클레아제 분해의 최적화는 소코코 뉴클레아제의 새로운 배치마다 수행해야 합니다.

각 반응에 대해 다음을 설정합니다. 10x micrococcal nuclease buffer, 1x 소 혈청 알부민 1μm, 표적 DNA 1μg, micrococcal nuclease 1μl 및 물 10μl. 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

즉시 1마이크로리터의 500밀리몰 EGTA를 첨가하여 효소를 비활성화합니다. DNA 샘플에 젤 로딩 염료가 포함된 샘플 버퍼를 추가하고 20% 폴리아크릴아미드 겔에 웰당 1마이크로그램의 DNA를 로드합니다. 크기 조정을 위해 적절한 DNA ladder를 로드합니다.

약 150시간 동안 또는 하단 염료 전면이 젤의 하단에 도달할 때까지 150볼트의 버퍼를 실행하는 1x TBE 실행 버퍼에서 젤을 실행합니다. 초고감도 핵산 염색제를 사용하여 겔을 염색하고 자외선 아래에서 시각화합니다. 이 예에서, DNA를 20 내지 30 염기쌍 크기로 소화하기 위한 마이크로코커스 뉴클레아제의 최적 농도는 10 단위였다.

이 최적 농도의 micrococcal nuclease를 사용하여 최적화 반응에 대해 입증된 것과 동일한 방식으로 10-12 microg의 표적 DNA를 소화합니다. PAGE로 DNA 단편을 분리한 후 멸균 메스를 사용하여 마커 레인 옆의 겔을 자르고 래더가 포함된 겔의 일부만 초고감도 핵산 염색이 포함된 새로운 1x TBE 러닝 버퍼로 염색합니다. DNA 사다리를 시각화하고 면도날을 사용하여 약 18-30 염기쌍 사이의 크기 범위에서 소구균 뉴클레아제로 분해된 DNA 단편을 절제합니다.

겔 슬라이스를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 앞서 보여준 것처럼 핵산 얼룩으로 젤의 나머지 부분을 염색합니다. 겔을 자외선에 노출시키고 겔 절제 단계의 기록으로 이미지를 획득합니다.

멸균 피펫 팁을 사용하여 절제된 젤 슬라이스를 마이크로 원심분리기 튜브의 벽에 부수어 이 절차를 시작합니다. 두 가지 부피의 PAGE 가용화 완충액을 넣고 섭씨 37도의 회전 플랫폼에서 16시간 동안 배양합니다. 다음 날, 마이크로 원심분리기에서 샘플을 최대 속도로 1분 동안 원심분리합니다.

상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 분쇄된 젤 조각이 옮겨지지 않도록 주의합니다. 0.5 부피의 PAGE 가용화 완충액을 겔 펠렛에 추가하고 와류를 일으키고 원심분리를 반복합니다. 상층액을 결합하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표준 페놀-클로로포름 추출 방법을 사용하여 DNA 단편을 추출합니다.

DNA 단편의 분리와 병행하여 표준 PCR을 사용하여 guide RNA 발현 벡터에서 linker를 증폭합니다. 방향성 클로닝을 보장하기 위해, 링커는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적절한 제한 효소로 절단됩니다. 링커의 제한 효소 분해물을 1% 아가로스 젤에 실행합니다.

올바른 밴드를 절제하고 겔 추출 키트를 사용하여 절제된 겔 조각에서 DNA를 정제합니다. DNA 무뎌지는 장비는 말단 수선 반응을 위해 사용됩니다. 마이크로분리관에 다음을 추가합니다.

정제된 DNA 10마이크로리터, 10x 블런팅 버퍼 1.5마이크로리터, 1밀리몰 dNTP 믹스 1.5마이크로리터, 물 1.4마이크로리터 및 블런팅 효소 0.6마이크로리터. 섭씨 22도에서 30분 동안 배양한 다음 섭씨 70도에서 10분 동안 배양하여 가열하고 효소를 활성화합니다. 85마이크로리터의 물을 추가하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반응 정화를 수행합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 동일한 몰량의 소코ccal nuclease, 분해 및 복구된 단편 및 링커 서열을 사용하여 14μlit ligation 반응을 설정합니다. 흠집 번역 후, 결찰 산물은 PCR에 의해 증폭됩니다. 올바르게 부착된 5 프라임 링커와 3 프라임 링커가 있는 마이크로코ccal 뉴클레아제 단편을 2개의 5 프라임 링커 또는 2개의 3 프라임 링커가 있는 단편과 분리하려면 15 사이클 PCR 반응을 모두 결합하고 DNA 로딩 염료를 첨가한 후 0.8% 아가로스 겔에서 실행합니다.

869 염기쌍에서 두드러진 밴드를 절제하고 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다. 분광 광도계를 사용하여 DNA의 양을 정량화합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 Gibson 어셈블리에 의해 PCR 증폭된 단편을 guide RNA 발현 벡터로 클로닝합니다.

이 절차를 시작하려면 분취 정제 벡터 구조체를 멸균 및 사전 냉각된 PCR 튜브에 삽입하고 얼음 위에 보관합니다. 얼음 위에서 1mm 간격의 전기천공(electroporation) 큐벳을 식힙니다. 25마이크로리터의 갓 준비된 TG1 세포를 DNA 분취액 1개에 직접 첨가하고 혼합물을 즉시 전기천공법 큐벳으로 옮깁니다.

큐벳을 튕기거나 두드려 세포와 DNA 혼합물이 갇힌 공기나 기포 없이 큐벳 챔버의 길이를 따라 분포되도록 합니다. 큐벳을 슬라이드 챔버에 놓고 적절한 전기천공법 프로그램을 시작합니다. 즉시 475마이크로리터의 실온 2TY를 큐벳에 추가합니다.

전기천공된 박테리아를 50ml 튜브로 옮깁니다. 개별 electroporations를 반복하고, 하나의 라이브러리로 형질전환된 모든 세포를 하나의 50ml 튜브에 모으고 총 부피를 문서화합니다. 전체 라이브러리에 대한 총 콜로니 수를 추정하기 위해 라이브러리와 함께 형질전환된 정의된 소량의 박테리아를 적절한 항생제 선택과 함께 10cm 한천 플레이트에 플레이트화합니다.

나머지 박테리아의 부피를 줄이려면 약 4, 000g에서 10분 동안 또는 눈에 보이는 팔레트가 형성되고 상등액이 투명하게 나타날 때까지 원심분리합니다. 몇 밀리리터의 상층액을 제외한 모든 것을 제거하고 세포를 다시 현탁시킵니다. 적절한 항생제를 선택하여 2TY 한천으로 코팅된 생물 검정 접시에 박테리아를 플레이트로 만듭니다.

적절한 양의 pUC19 control electroporation 반응을 적절한 양의 한천 접시에 적절한 양의 10cm 한천 접시에 바르십시오. 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 통제된 플레이트의 콜로니 수를 계산하여 박테리아의 DNA 마이크로그램당 콜로니 형성 단위와 라이브러리 복잡성을 추정합니다.

마지막으로, 플라스미드 DNA 추출을 위해 플레이트에서 박테리아를 긁어냅니다. 겔 정제 후, 정제된 마이크로코커스 뉴클레아제 단편의 1/6을 20%PAGE 겔에 로드하여 성공적인 크기 선택 및 정제를 확인했습니다. 링커 앰플리콘은 링커가 소세포 뉴클레아제로 절단된 단편에 올바른 방향으로 연결되도록 하기 위해 제한 효소로 절단되었습니다.

이 대표적인 겔 이미지의 왼쪽은 각각 HindIII 및 SacII로 분해하기 전과 후에 5개의 프라임 링커와 3개의 프라임 링커를 보여주며, 이는 예측 637 염기쌍 및 295 염기쌍에 대한 링커의 완전한 분해를 나타냅니다. 겔 이미지의 오른쪽은 절단된 링커 단편의 절제를 문서화합니다. DNA 단편에 대한 링커의 성공적인 접합은 PCR 주기 수를 증가시킨 PCR을 사용하여 분석되었습니다.

포함된 대조군은 이전 nick translation 단계의 무 템플릿 대조군을 입력으로 사용하는 무 템플릿 대조군과 무 미세구균 뉴클레아제 단편 대조군이었습니다. 소구균 뉴클레아제 단편이 링커 DNA와 결합된 샘플에서만 869개의 염기쌍으로 구성된 예상 앰플리콘이 생성되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 5일 안에 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 라이브러리의 복잡성을 유지하고 다른 제어 반응을 수행하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 DNA를 작은 조각으로 자르고 이를 라이브러리 벡터 백본에 클로닝하여 CRISPR 기반 스크리닝을 위한 가이드 RNA 라이브러리를 생성하는 방법을 잘 이해하게 되었을 것입니다.