Name: 대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 배우세요 CORALINA 방법으로 효소 소화를 이용해 대규모 gRNA 라이브러리를 제작하는 비용 효율적인 프로토콜입니다. 이 기술은 CRISPR 기반 스크리닝 연구에 필수적인 모든 가능한 가이드 RNA를 생성합니다.

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저자 교수 박사 스테판 벡과 교수 박사 막달레나 Goetz 그들의 입력에 대 한 감사, 도움말 및 지원에서 CORALINA 방법, 막시밀리안 Wiessbeck 도움이 의견에 대 한 발렌틴 바 우만 개발 하 고 싶습니다. 작품은 DFG (STR 1385/1-1)에 의해 지원 되었습니다.

<ol><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+profiles+to+function+in+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">From profiles to function in epigenomics.</a> Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).</li>
<li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+editing%3A+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li>
<li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORALINA%3A+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li>
<li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

CORALINA는 표적 DNA의 제어 nuclease 소화에 의해 대규모 gRNA 라이브러리를 생성 하 고 결과 이중 좌초 파편의 클로닝을 대량을 사용할 수 있습니다. 통계적 추론을 많은 10 이상7 개별 gRNA 시퀀스는 이미 성공적으로 복제 된 손9에서 프로토콜을 사용 하 여 나타냅니다. CORALINA는 여러 가지 방법으로 사용자 지정할 수 있습니다. 템플릿 DNA의 대상 지역 및 생성 된 라이브러리의 최대한 복잡성을 정의합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, CORALINA 이전 인간에서 생성 된 도서관과 마우스 게놈 DNA9. 여기에 제시 하는 대표적인 결과 순화 된 BAC DNA에서 CORALINA 라이브러리의 묘사. 추가 사용자 지정 gRNA 식 벡터 및 링커 시퀀스의 선택에 의해 얻을 수 있습니다. 이전 작은 변이 가진 깁슨 어셈블리 링커 길이의 3 개의 다른 쌍 효율9에서 테스트 했습니다.
소화는 대량 DNA에서 그들의 근원, 인 CORALINA gRNAs의 protospacer는 일반적으로 하지 정확히 20 길이, 그러나 쇼는 길이 분포에 따라 달라 집니다 의미와 bp는 절단의 크기 뿐만 아니라 MNase 소화의 매개 변수 페이지 젤에서 만든 s. 대표 예제 그림 2B 와 C, 19 및 27 혈압 사이의 평균 길이 가진 조각 묘사. 우리의 경험에서는, 파편의 길이 생성 된 gRNA protospacer9충실 하 게 유지 됩니다. 20 보다 짧은 조각 동안 혈압 결과 gRNAs의 높은 오프 대상 비율 때문에 피해 야 한다, 더 긴 파편은 그것 이후 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 문제가 훨씬 적은 증명 그 gRNAs와 protospacers 45 만큼 가능성이 혈압은 여전히 기능9.
CORALINA 프로토콜의 2 개의 가장 중요 한 단계는 MNase 소화 조각과 복제 단계의 크기 선택. 너무 짧은 조각의 세대 (예: 평균 18 아래 혈압) 또는 너무 많은 빈 gRNA 식 벡터의 라이브러리를 쓸모 없는 렌더링 것 이다. 따라서, MNase 소화 단계 (그림 2A)을 최적화, 모니터링 절단 (그림 2B, C), gRNA 벡터 등뼈의 완전 한 소화를 위한 확인 하 고 프로토콜을 통해 아무 조각 컨트롤 포함 하는 것이 중요 하다. 특별 한 주의 또한 보존 gRNA 라이브러리의 표현 주의가 있다. 라이브러리 생성에의 한 일반적인 병목은 일반적 확대를 위한 박테리아에 플라스 미드의 효율적인 전송입니다. 따라서, 우수한 역량을 가진 박테리아의 다량 및 많은 수의 개별 electroporation 이벤트는 gRNA 클론의 높은 숫자를 달성 하는 데 필요한.
GRNA 라이브러리 생산을 위한 새로운 전략 다음 년간 CRISPR 기반 심사 접근의 완전 한 잠재력을 수확 하는 데 필요한 것입니다. 심사 모델 시스템 및 다른 CRISPR 기반 엔지니어링 접근의 더 큰 수를 받을 수 있도록 필수 대규모 라이브러리를 생성 하기 위해 비용 효율적인 간단 하 고 사용자 정의 방법에 대 한 상당한 수요가 있다. CORALINA는이 위한 첫 걸음을 제공 하 고 있다. 잠재적인 사용 하는 매니폴드, 게놈의 종합 라이브러리를 생성 하는 특히, cDNA 파생 덜 일반적인 모델 시스템의 라이브러리, 고도로 집중된 라이브러리와는 다른 CRISPR 단백질 (다른 팸에에서 실험적인 체제 요구 사항) 조합에 사용 됩니다.
다른 메서드와 달리 CORALINA 입력 DNA에서에서 모든 가능한 gRNAs를 생성합니다. 그러나, 하나의 방법의 단점은 gRNAs 필요한 팸 시퀀스 부족도 라이브러리, gRNA 라이브러리 세대, CRISPR 식사 (표 1)에 대 한 두 번째 효소 방법으로 공유 하는 기능에에서 포함 됩니다. 이상적인 방법의 선택 gRNA 라이브러리 생성 계획된 심사의 사양에 따라 실험, 특히 자연 (genic, 규제, intergenic) 및 대상 지역 (단일 로커 스, 여러 지역, 게놈 넓은)의 크기. 우리가 볼 때 비 코딩의 많은 CORALINA를 사용 하 여 특별 한 거꾸로 또는 규제 지역 분석, 불완전 한 또는 신뢰할 수 없는 정보 라면 (이국적인 모델 시스템, 종 (예: microbiomes)의 혼합물 또는 실험적 입력 받음), 다른 CRISPR endonucleases 결합 또는 짧고 정의 된 장소 (예: BACs로 표현)에 수행 분석을 흠뻑 젖 게.

분자 타겟팅 도구 세균 CRISPR/Cas9 시스템의 적응 분자 생물학에 있는 가장 최근의 혁명을 발생합니다. 그것은 결코 전에 너무 쉽게 정의 된 genomic 위치에서 chromatin 조작 되었습니다. CRISPR의 일반적인 응용 프로그램에는 타겟된 유전자 돌연변이1, 게놈 엔지니어링2,3, transcriptional 활성화 및 유전자 침묵4편집 epigenome 포함 됩니다. 하나의 특정 CRISPR 시스템의 장점은 응용 프로그램 잘 공부 후보 사이트에 국한 되지 않습니다 gRNA 라이브러리 덜 편향된 스크린을 가능 하 게로. 이러한 사전 실험 지식 없이도 게놈에서 기능 loci의 발견을 촉진 한다. 그러나, gRNA 도서관 건설 현재 주로 기반으로 올리고 뉴클레오티드 종합과 인간의 하지 않은 gRNA 라이브러리를 구매 제한 옵션은 열거나 외부 원본 또는 대상 영역을 마우스 프레임을 읽고. 따라서, 비록 CRISPR 화면이 이미 엄청나게 강력한5,6,7,8, 입증 된 그들의 풍부한 잠재력은 하지 아직 되었습니다 악용.
극복 하기 위해 클래식 gRNA 세대 방법 두 가지 전략의 한계 최근에 개발 되었습니다. 둘 다 사용자 지정 oligonucleotide 합성에 의존 하는 것 보다는 표적 DNA의 효소 소화를 제어 기반으로 합니다. 제한 효소의 사용 CORALINA9 micrococcal nuclease만 현재 사용할 수 있는 다른 방법을 CRISPR 먹고10, 사용 하는 동안 (Hpa2 세, ScrFI, Bfa Mme와 나 나). 중요 한 것은, 두 기술은 어떤 입력된 DNA gRNA protospacer 시퀀스의 소스 역할에 적용할 수 있습니다. CRISPR 먹는 방법 누구의 대상 사이트는 필요한 S.pyogenes 팸 (protospacer 인접 한 동기)에 의해 준수 하지 복제 gRNAs의 수를 줄일 수 있도록 전략 고용, 하는 동안 그것에 대 한 모든 가능한 기능 gRNAs의 극히 일부에 생성 한 지정 된 지역입니다. CORALINA, 다른 한편으로, 소스 시퀀스에 대 한 모든 잠재적인 gRNAs를 생성할 수 하 그러나 또한 비 기능 가이드의 더 높은 부분을 통합 한다. gRNA 라이브러리 생성 제어 nuclease 활동을 통해 어떤 종족에 대 한 포괄적인 gRNA 라이브러리의 생산 수 있습니다 간단 하 고 비용 효율적인 방식으로 어떤 Cas9 단백질 또는-이펙터 시스템. 또한, CORALINA은 라이브러리 유형, 크기 및 콘텐츠를 정의 하는 적절 한 입력 및 벡터 선택 사용자 지정에. 여기, 상세한 프로토콜을 제시 세균 인공 염색체 (BACs) 또는 genomic DNA9를 포함 하 여 DNA (그림 1)의 다양 한 소스 로부터 포괄적인 gRNA 라이브러리의 생성에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 동반 하는 대표적인 결과 BAC dna CORALINA 프로토콜을 적용 하 여 파생 되었다.

<table><tbody><tr><td>500 mM EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>1.4., Mnase</td></tr><tr><td>Novex 고밀도 TBE 시료 완충액</td>의 불활성화 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6678</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>노벡스&reg; TBE Gel, 20%, 10</td>웰 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6315BOX</td><td>2.1., 사전 제작된 20% PAGE 겔</td></tr><tr><td>O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1303</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>노벡스&reg; TBE 러닝 버퍼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6675</td><td>2.1., PAGE 젤 러닝 버퍼</td></tr><tr><td>일회용 메스, 멸균</td><td>VWR&nbsp;</td><td>233-5363&nbsp;</td><td>2.3., 다른 동등한 시약이 사용될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>SYBR Green I 핵산 염색 (DMSO에 1000x 농축액)</td><td>Sigma Aldrich</td><td> S9430</td><td>2.3. +2.5., Thermo Fisher Scientific (S7563)</td></tr><tr><td>UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593-031</td><td>3.6.1. + 4.3., 다른 등가 시약이 사용될 수</td></tr> 있습니다. <tr><td>Glycogen</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td>3.6.4., 다른 등가 시약이 사용될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>3M 아세트산 나트륨, pH5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; R1181</td><td>3.6.4., 다른 동등한 시약이 사용될 수 있습니다</td></tr><tr><td>.</td><td></td><td></td><td>3.6.4. + 9.1.8., 분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>빠른 둔화 키트&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>E1201</td><td>4.1.</td></tr><tr><td>암모뮴 아세테이트</td><td>Sigma</td><td> A1542</td><td>3.1., 다른 동등한 시약은</td></tr><tr><td>마그네슘 아세테이트</td><td>Sigma</td><td> M5661</td><td>3.1.을 사용할 수 있으며, 다른 동등한 시약은</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>VWR</td>을 사용할 수 있습니다<td>. MOLEM37465520 (또는 Promega V4231)</td><td>2.2. + 3.1., 다른 동등한 시약이 사용될 수 있습니다</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 비즈</td><td>Beckman coulter</td><td>A63881</td><td>5.3. + 6.5.</td></tr><tr><td>젤 추출 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>5.7.+ 7.1. +8.4., 다른 동등한 시약을 사용할 수 있습니다</td></tr>. 농축 <tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp; M0202T</td><td>6.1.+ 8.1.2.</td></tr><tr><td>롱 앰프 Taq 2X 마스터 믹스&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0287S</td><td>6.3.</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR 마스터 믹스와 HF 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>5.1. + 6.6., 다른 동등한 시약이 사용될 수 있습니다</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>5.4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>SacII</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0157S</td><td>5.4.2.</td></tr><tr><td>AgeI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0552S</td><td>8.2.1.</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>시그마</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>2M MgCl</td><td>시그마</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>N0446S</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigam</td><td> DTT-RO</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>페이지-8000&nbsp;</td><td>시그마</td><td> P5413</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>NAD</td><td>시그마</td><td> N6522</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>T5 엑소뉴클레아제</td><td>뉴잉글랜드 Biolabs</td><td>M0363S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Phusion DNA 중합효소&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0530S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Taq DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208L</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>rSAP</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0371S</td><td>8.3.1.</td></tr><tr><td>TG1 유능 세포</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td>9.1.</td></tr><tr><td>1mm 갭 전기천공법 큐벳&nbsp;</td><td>폭스바운드</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.Bio-Assay</td></tr> <tr><td>Dish (폴리스티렌, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DIS-988-010M&nbsp;</td><td>9.4.NaCl</td></tr> <tr><td></td><td>시그마</td><td>S7653&nbsp;</td><td>9.3.</td></tr> <tr><td>박토 트립톤</td><td>BD</td><td>211705</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD</td><td>212750</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>한천</td><td>시그마</td><td> A1296</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td> G5516</td><td>9.17.</td></tr><tr><td>MN세</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>1.1.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>전체 Micropulser</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>전기천공법 큐벳</td><td>Biorad</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.250ml</td></tr> <tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>9.1-9.9.</td></tr></tbody></table>

대규모 grna dna 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

게놈과 epigenome 엔지니어링에 대 한 CRISPR/Cas9 시스템의 인기는 그것의 간명 및 적응성에서 유래한 다. (Cas9 nuclease 또는 nuclease 죽은 dCas9 융합 단백질)는 이펙터 가이드 RNA, 또는 gRNA로 알려진 작은 합성 RNA 게놈에 있는 특정 사이트에 대상 이다. CRISPR 시스템의이 분 자연 플라스 미드 라이브러리 포함 식 카세트 개별 gRNAs의 수천의 단일 실험에서 많은 다른 사이트가 사용할 수 있습니다 이후 접근 차단에 그것의 사용을 수 있습니다.
날짜 하려면, 라이브러리의 건설에 대 한 gRNA 시퀀스는 oligonucleotide 종합 라이브러리에서 시퀀스의 달성 복잡성을 제한 하 고 상대적으로 비용 많이 사용에 의해 거의 독점적으로 생성 된 것. 여기, CORALINA (제어 nuclease 활동을 통해 포괄적인 gRNA 라이브러리 세대)에 대 한 상세한 프로토콜 간단 하 고 매우 복잡 한 gRNA 라이브러리의 생성에 대 한 비용 효율적인 방법을 입력 DNA의 효소 소화에 기반, 설명. DNA의 모든 소스에서 CORALINA 라이브러리를 생성할 수 있습니다, 이후 사용자 지정에 대 한 옵션을 많이 존재, CRISPR 기반 스크린의 큰 다양성을 사용 한다.

가까이는 프로토콜을 사용 하 여, CORALINA gRNA 라이브러리와 마우스 게놈 DNA9 인간과 BAC DNA (그림 1)에서 생성 된 것. GRNA 식 벡터에 클로닝을 위한 적합 한 입력된 DNA의 파편을 생성, 제어 nuclease 소화에 대 한 최적의 조건을 결정 해야 합니다. Micrococcal nuclease 소화의 최적화에 대 한 일반적인 결과 그림 2A에서 묘사 된다. 부족 한 양의 nuclease (0.1, 2, 3, 4, 4.5 또는 5 단위) 생산 필요한 크기 범위 (10-100 bp)에서 눈에 띄는 제품 및 5.5-7.5 단위는 여전히 생산 한다 너무 긴 평균에 있는 조각. 더 많은 양의 효소 (50 단위) 10 분 후 입력 DNA의 과도 한 저하를 발생할. 따라서, 중간 금액 (10 단위)를 선택 했습니다. 다이제스트 충분히 생산 이후 정화 및 (그림 2B) 복제에 대 한 조각 소화 조절 했다. 맹목적으로 크기에 의해 DNA 파편을 선택 하 여 DNA 파편의 자외선에 노출을 최소화 하는 방향에 대 한 DNA 사다리에만 의존 하는 것이 좋습니다, 그러나 젤 소화와 절단의 품질 관리에 대 한 나중 얼룩이 될 수 있다. 그림 2B 는 DNA에서 20, 30 bp 사이 조각 excised 되었습니다 페이지 젤의 대표적인 예를 보여 줍니다. 젤 정화 MNase 조각 성공적인 크기 선택 및 MNase 소화 조각 (그림 2C)의 정화를 페이지 젤 20%에 로드 된. 프로토콜에 선택의 gRNA 식 벡터에 MNase 소화 파편을 수 있도록 사용자 지정 된 링커 시퀀스의 사용와 호환 됩니다. 여기, gRNA-PLKO9 백본으로 사용 되었다. 링커는 표준 PCR를 사용 하 여 gRNA 표정 벡터에서 증폭 된다. 그림 2D 증폭된 링커 순서 없는 추가, 잘못 된 또는 없음 템플릿 amplicons의 대표적인 예를 보여 줍니다. 다음, 링커 amplicons 링커 올바른 방향에서 MNase 소화 조각에 출혈은 되도록 금지 효소로 소화 된다. 예측된 637 및 295 링커의 완전 한 소화를 나타내는 그림 2D 표시 5'과 3' 링커의 agarose 젤 뒷 다리III와 SacII 소화 전후 각각 혈압. 젤 이미지의 오른쪽 부분에는 소화 링커 파편의 절단 문서. 다음 젤 소화 링커의 추출, 프로토콜의 다음 단계는 최종 수리 MNase 소화 파편에 링커의 결 찰. 링커 시퀀스 unphosphorylated 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 생성 되므로, 링커의 각자 결 찰 발생 하지 합니다. 최종 수리 MNase 소화 DNA 파편만 결 찰에 필요한 인산 염 그룹을 제공합니다. 닉 번역에 따라 결 찰 제품은 PCR에 의해 증폭 된다. 라이브러리에서 gRNA 시퀀스의 표현을 왜곡 수 있는 과도 한 PCR 증폭 바이어스를 방지 하기 위해 증폭 총에서 20 사이클 제한 됩니다. PCR, 다음 증폭 제품은 agarose 젤에 시각화 하기가 어렵습니다. 32 주기와 별도 제어 PCRs는 (하지만) 라이브러리 준비를 위해 사용 되지 않습니다 따라서 제품 검색을 수행. 이 컨트롤에서 결과 PCR 그림 2E에 표시 됩니다. 이로써 결 찰 반응을 최적화 하 고 되도록 반응 "조각 제어"에서 가끔 발생 하는 PCR 유물 없는 (NFC). 그림 2E 보여줍니다 원하는 amplicon (5' 링커 DNA 조각 + 3' 링커, 길이: 869 bp) 조각과 링커 시퀀스 간의 아데닌 (1:1) 비율을 사용 하 여 결 찰 반응의 증폭을 다음과 같은.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> 그림 1 : GRNA 라이브러리를 준비 하기 위한 일정을 제안 했다. CORALINA는 어떤 유기 체에서 다른 DNA 소스의 과다에서 포괄적인 gRNA 라이브러리의 생성에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 전략을 제공합니다. 프로토콜에 완료 한 작업 주 동안에 주어질 수 있다. 링커 세대 DNA 끝-수리와 병렬로 수행할 수 있습니다. Electrocompetent 박테리아의 준비 2 일 하룻밤 성장 단계를 포함 하 고 따라서 어셈블리 반응 설정 하기 전에 시작 해야 합니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> 그림 2 : 프로토콜 중 중요 한 단계. BAC DNA의 (A) 제어 소화 수 세대의 다양 한 크기의 조각. 여기에 표시 된 MNase 소화의 최적화가입니다. 순화 된 BAC DNA의 원하는 길이 (20-30 bp) DNA 파편을 생성 하는 MNase의 10 분 10 U에 대 한 MNase의 다른 금액으로 대우 되었다. (B) 20, 30 bp polyacrylamide 젤에서 절단을 사용 하 여 사이 조각의 선택 크기. 순화 된 BAC DNA MNase 10 분의 10 U로 대우 되었다. 이미지는 절단에 다음과 같은 기록 했다. (C)의 젤 정화 조각 품질 제어. 젤-정화, 후 1/6th 순화 MNase의 조각 로드 20%에 성공적인 크기 선택 및 정화 확인 페이지 젤. 방향 복제 되도록 링커의 조립 및 금지 효소 소화에 대 한 링커 시퀀스의의 (D) 증폭 5'과 3' 링커 증폭 되었고 각각 HindIII 와 SacII, 잘라. 아니-템플릿 컨트롤 (NTC) PCR 인공 물 및 DNA 오염에 대 한 제어를 포함 했다. 왼쪽: 분석 샘플 응용 프로그램; 오른쪽: 대리점 샘플 응용 프로그램. 이미지는 젤 절단 후 기록 되었다. 성공적인 결 찰 (E) 링커 DNA 파편을 PCR를 사용 하 여 PCR 주기 (32)의 증가 수 및 H2O (NTC)에 아무 템플릿 컨트롤을 수행 하거나 이전 닉 번역 단계에서 NTC를 사용 하 여 제어 분석 될 수 있다 으로 입력 (NTC NT)). 그것은 아무 조각 컨트롤 (NFC), 결 찰 및 있는 MNase 조각 생략 되었다 닉 번역 반응에서 증폭은을 포함 하는 것이 중요. MNase에서 조각 링커 DNA와 결합 되어 샘플 생산 예상된 amplicon만 (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

간단 하 고 효율적인 비용 효율적인 대규모 gRNA 라이브러리를 생성 하기 위한 방법 이어야 한다. 우리는 표적 DNA의 효소 소화에 따라 gRNA 라이브러리의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드를 CORALINA (제어 nuclease 활동을 통해 포괄적인 gRNA 라이브러리 세대) 비용이 많이 드는 사용자 지정 oligonucleotide 종합에 대안을 선물 한다.

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

이 방법의 전반적인 목표는 모든 소스에서 정제된 DNA를 사용하여 포괄적인 가이드 RNA 라이브러리를 구축하는 것입니다. gRNA 라이브러리는 CRISPR 기반 스크리닝에 사용되는 플라스미드 컬렉션입니다. CORALINA 방법은 정제된 DNA를 효소로 분해하여 생성된 단편들을 가이드 RNA 라이브러리 백본에 클로닝하는 방식을 사용합니다.이 기술의 주요 장점은 입력 서열로부터 가능한 모든 가이드 RNA를 생성하며 매우 비용 효율적이라는 점입니다. 이 영상에서는 박테리아 인공 염색체로부터 CORALINA 라이브러리를 보호하는 과정을 보여주지만, 이 방법은 원칙적으로 모든 생물체의 모든 유형의 입력 DNA에 적용될 수 있습니다. 새로운 배치의 micrococcal nuclease를 사용할 때마다 micrococcal nuclease 소화 과정의 최적화가 반드시 수행되어야 합니다.각 반응에 대해 다음과 같이 준비합니다. 10x micrococcal nuclease buffer 1 µL, 1x bovine serum albumin, 표적 DNA 1 µg, micrococcal nuclease 1 µL를 넣고 물을 추가하여 최종 부피를 10 µL로 맞춥니다. 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.500 millimolar EGTA 1 µL를 첨가하여 효소를 즉시 불활성화합니다. DNA 시료에 겔 로딩 다이(gel loading dye)가 포함된 시료 버퍼를 첨가하고, 20% polyacrylamide 겔의 각 웰(well)당 1 µg의 DNA를 로딩합니다. 크기 측정을 위해 적절한 DNA 래더(ladder)를 로딩합니다.1x TBE 전개 완충액에서 150V로 약 1.5시간 동안 또는 하단 염료 전선이 겔의 끝단에 도달할 때까지 겔 전기영동을 수행합니다. 초고감도 핵산 염색 시약을 사용하여 겔을 염색하고 UV 광원 하에서 시각화합니다. 본 예시에서 DNA를 20~30 base pair 크기로 분해하기 위한 micrococcal nuclease의 최적 농도는 10 unit이었습니다.최적화 반응에서 시연한 것과 동일한 방식으로, 최적 농도의 micrococcal nuclease를 사용하여 10 내지 12 µg의 표적 DNA를 소화시킵니다. PAGE로 DNA 단편을 분리한 후, 멸균된 메스를 사용하여 마커 레인 옆의 겔을 절단하고, 초고감도 핵산 염색약이 포함된 신선한 1x TBE 전기영동 버퍼로 래더가 포함된 겔 부분만 염색합니다. DNA 래더를 시각화하고 면도날을 사용하여 약 18 내지 30 bp 크기 범위의 micrococcal nuclease 소화 DNA 단편을 절취합니다.젤 조각을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 젤의 나머지 부분은 앞서 설명한 대로 핵산 염색약으로 염색합니다. 젤을 UV 광선에 노출시켜 젤 절단 단계의 기록으로 이미지를 획득합니다.멸균된 피펫 팁을 사용하여 절제된 겔 조각을 마이크로원심분리 튜브 벽면에 대고 으깨어 이 절차를 시작합니다. 겔 부피의 2배에 해당하는 PAGE 가용화 완충액을 첨가하고, 회전 플랫폼 위에서 37 °C로 16시간 동안 배양합니다. 다음 날, 마이크로원심분리기를 사용하여 샘플을 최대 속도로 1분 동안 원심분리합니다.으깨진 겔 조각이 섞여 들어가지 않도록 주의하며 상층액을 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 겔 펠릿에 0.5 부피의 PAGE 가용화 완충액을 첨가하고, 볼텍싱 후 원심분리를 반복합니다. 상층액을 합친 후, 텍스트 프로토콜에 기술된 표준 페놀-클로로포름 추출법을 사용하여 DNA 단편을 추출합니다.DNA 단편의 분리와 병행하여, 표준 PCR을 사용하여 guide RNA 발현 벡터로부터 링커를 증폭합니다. 방향성 클로닝을 보장하기 위해, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적절한 제한 효소로 링커를 처리합니다. 제한 효소로 처리된 링커를 1% 아가로스 겔에서 전기영동합니다.올바른 밴드를 절단하고 겔 추출 키트를 사용하여 절단된 겔 조각에서 DNA를 정제합니다. 말단 수선 반응에는 DNA blunting 키트가 사용됩니다. 마이크로 원심분리 튜브에 다음을 첨가하십시오.정제된 DNA 10 µL, 10x blunting buffer 1.5 µL, 1 mM dNTP mix 1.5 µL, 물 1.4 µL 및 blunting enzyme 0.6 µL를 혼합합니다. 22 °C에서 30분 동안 배양한 후, 70 °C에서 10분 동안 배양하여 효소를 가열 및 활성화합니다. 물 85 µL를 추가하고 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 반응 정제 과정을 수행합니다.텍스트 프로토콜에 기술된 대로, micrococcal nuclease로 소화 및 수선된 단편과 링커 서열을 동일 몰수로 사용하여 14 µL ligation 반응을 설정합니다. 닉 번역(nick translation) 후, ligation 산물을 PCR로 증폭합니다. 5' 및 3' 링커가 올바르게 결합된 micrococcal nuclease 단편을 두 개의 5' 또는 두 개의 3' 링커가 결합된 단편과 분리하기 위해, 모든 15 사이클 PCR 반응물을 혼합하고 DNA 로딩 염료를 추가하여 0.8% agarose 겔에서 전기영동합니다.869 base pairs의 뚜렷한 밴드를 절단하고 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다. 분광광도계를 사용하여 DNA 양을 정량합니다. 이어서 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 Gibson assembly를 통해 PCR 증폭된 단편을 guide RNA 발현 벡터에 클로닝합니다.본 절차를 시작하려면, 정제된 벡터 삽입 구조물을 멸균되어 미리 냉각된 PCR 튜브에 분주하고 얼음에 보관하십시오. 1 mm 간격의 전기천공 큐벳을 얼음 위에서 냉각하십시오. 갓 준비한 TG1 세포 25 µL를 DNA 분주액 하나에 직접 첨가하고, 혼합물을 즉시 전기천공 큐벳으로 옮기십시오.큐벳을 가볍게 튕기거나 탭하여 세포와 DNA 혼합물이 기포나 갇힌 공기 없이 큐벳 챔버 전체에 고르게 분포되도록 합니다. 큐벳을 슬라이드 챔버에 넣고 적절한 전기천공 프로그램을 시작합니다. 즉시 실온의 2TY 475 µL를 큐벳에 첨가합니다.전기천공된 박테리아를 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 개별 전기천공 과정을 반복하고, 하나의 라이브러리로 형질전환된 모든 세포를 하나의 50 milliliter 튜브에 수집한 뒤 총 부피를 기록합니다. 전체 라이브러리의 총 콜로니 수를 추정하기 위해, 라이브러리로 형질전환된 박테리아의 일정 소량을 적절한 항생제 선택 배지가 포함된 10 centimeter 아가 플레이트에 도말합니다.남은 박테리아의 부피를 줄이기 위해, 가시적인 펠렛(palette)이 형성되고 상층액이 투명해질 때까지 약 4,000 g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 몇 밀리리터만 남기고 모두 제거한 후 세포를 재현탁합니다. 적절한 항생제 선택제가 포함된 2TY agar 코팅 바이오에세이 디쉬에 박테리아를 도말합니다.적절한 항생제 선택제가 포함된 별도의 10cm 아가 플레이트에 pUC19 대조군 전기천공 반응액의 적정 부피를 도말합니다. 아가 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 대조군 플레이트의 콜로니 수를 측정하여 박테리아의 DNA µg당 콜로니 형성 단위(CFU)와 라이브러리 복잡성을 추정합니다.마지막으로, 플라스미드 DNA 추출을 위해 플레이트에서 박테리아를 긁어냅니다. 겔 정제 후, 정제된 micrococcal nuclease 단편의 1/6을 20% PAGE 겔에 로딩하여 크기 선택 및 정제가 성공적으로 이루어졌는지 확인했습니다. 링커 앰플리콘을 제한 효소로 절단하여 링커가 micrococcal nuclease로 절단된 단편에 올바른 방향으로 결합되었는지 확인했습니다.이 대표적인 젤 이미지의 왼쪽은 HindIII 및 SacII로 각각 소화하기 전과 후의 5' 및 3' 링커를 보여주며, 이는 링커가 예측된 637 bp 및 295 bp로 완전히 소화되었음을 나타냅니다. 젤 이미지의 오른쪽은 소화된 링커 단편의 절단을 기록한 것입니다. DNA 단편에 대한 링커의 성공적인 결합은 PCR 사이클 수를 늘려 PCR을 통해 분석하였습니다.포함된 대조군은 이전 닉 번역(nick translation) 단계의 무템플릿 대조군을 입력물로 사용한 무템플릿 대조군과 마이크로코칼 뉴클레이즈(micrococcal nuclease) 절편 대조군이었습니다. 마이크로코칼 뉴클레이즈 절편과 링커 DNA가 결합된 샘플에서만 869 base pairs의 예상 증폭산물이 생성되었습니다. 숙달되면, 이 기술은 적절히 수행될 경우 5일 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 라이브러리의 복잡성을 유지하고 다른 대조군 반응을 함께 수행하는 것이 중요합니다. 본 영상을 시청함으로써, DNA를 작은 조각으로 절단하고 이를 라이브러리 벡터 백본에 클로닝하여 CRISPR 기반 스크리닝을 위한 guide RNA 라이브러리를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.

a-universal-protocol-for-large-scale-grna-library-production-from-any

Research

연구

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Genetics

유전학

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