유량 및 스트레치 하에서 생체 재료의 염증 및 재생 능력을 평가하는 다중 큐 생물 반응기

지금까지는 혈류역학과 혈관 조직 재생 사이의 인과 관계를 규명하는 것이 정말 어려웠습니다. 그리고 이것은 개별 기계적 부하를 제어하는 것이 어렵기 때문입니다. 이 생물 반응기를 통해 다양한 조직 공학 혈관 이식편의 재생 잠재력에 대한 순전한 스트레스와 주기적 스트레치의 개별적이고 결합된 효과를 기계적으로 조사할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 우리 그룹의 박사 과정 학생인 Suzanne Koch입니다. 그리고 우리 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Tamar Wissing. 전기 회전 스캐폴드를 실리콘 튜브에 장착하려면 4-0 프롤렌 봉합사를 실리콘 튜브 조각의 한쪽 끝에 끼우고 다른 쪽 끝에서 빼냅니다.

튜브의 양쪽에 작은 매듭을 만들고 양쪽 매듭에 약 10cm의 와이어를 남기고 두 매듭 위에 세 번째 매듭을 만듭니다. 봉합사 바늘을 제거한 후 실리콘 튜브의 가장자리를 삼각형 모양으로 자르고 두 개의 10cm 와이어 끝에 최종 매듭을 만듭니다. 전기 방적 골격을 30% 에탄올에 담그고 자유 봉합 와이어의 한쪽 끝에 골격을 놓습니다.

다음으로, 실리콘 튜브의 양쪽과 10cm 봉합사 매듭을 부드럽게 늘리고, 두 번째 연구원은 내부 팁이 부드러운 핀셋을 사용하여 전기 회전 스캐폴드를 튜브 위로 부드럽게 밀어 넣습니다. 실리콘 튜브의 스트레치를 천천히 해제하는 동시에 핀셋으로 전기 회전 스캐폴드를 매끄럽게 합니다. 그리고 비계와 실리콘 튜브를 초순수에 두 번 담그십시오.

하단 구획을 구성하고 O-링이 제대로 배치되었는지 확인하십시오. 하단 구획의 상단에 어댑터 부싱을 놓고 하단 구획을 통해 구멍이 있는 압력 도관을 배치합니다. 누출을 방지하기 위해 압력 도관의 하단에 실리콘 O-링을 묶습니다.

그리고 하단 구획의 아래쪽 부분을 하단 구획의 위쪽 부분에 나사로 고정하여 압력 도관을 고정합니다. 압력 도관의 아래쪽에 새겨진 홈이 하단 구획의 어댑터 부싱 가장자리에서 약 3-5mm 위에 있는지 확인하십시오. 전기 회전 스캐폴드가 있는 실리콘 튜브를 압력 도관 위로 당기고 고개를 끄덕이고 압력 도관에 새겨진 홈 위치에서 전기 스펀 스캐폴드 하단의 봉합 와이어를 만듭니다.

반대쪽에서 두 번째 고개를 끄덕여 전기 방적 이식편으로 실리콘 튜브를 단단히 고정합니다. 그리고 실리콘 튜브의 상단에 규칙이 있는 가위형 클램프를 놓고 가위형 클램프를 일관된 방식으로 위쪽으로 당기고 전기 스폰 스캐폴드를 부드럽게 당겨 주름을 제거합니다. 봉합사를 사용하여 압력 도관의 상부 새겨진 홈에 있는 비계의 양쪽 끝에 두 개의 매듭을 만듭니다.

두 매듭이 모두 만들어지면 가위 cl을 해제합니다.amp 칼을 사용하여 여분의 실리콘 튜브를 제거합니다. 동적으로 로드될 샘플에 대한 압력 도관의 나사산에 노즈 콘을 나사로 고정합니다. 압력 도관, 튜브 및 스캐폴드를 30% 에탄올에 한 번, 초순수에 두 번 담궈 설정을 미리 적십니다.

유리관을 압력 도관 위에 놓고 하단 구획을 부드럽게 눌러 유리관을 제자리에 고정합니다. 그런 다음 흐름 교정기, 실리콘 O-링 및 어댑터 부싱을 상단 구획에 놓습니다. 그리고 유리관의 열린 끝 부분에 구획을 고정합니다.

흐름 배출구에서 수 루어 플러그를 제거하고 멸균 층류 캐비닛에서 작업하십시오. 흰색 루어 캡을 열고 흐름 배출구 앞에 에탄올 담그기 티슈를 놓습니다. 상부 격실이 있는 유리관을 분리하여 유동 배양실을 분해합니다.

진공 방초 파이프를 놓고 전기 방적 스캐폴드에 추가하여 가능한 한 많은 매체를 제거합니다. 그리고 피브리노겐 용액을 트롬빈이 보충된 세포 현탁액과 1:1 비율로 첨가합니다. 용액을 위아래로 한 번 피펫팅하고 즉시 골격의 전체 길이에 용액을 떨어뜨립니다.

모든 세포가 전달되면 골격을 왼쪽에서 오른쪽으로, 위아래로 천천히 움직여 세포가 고르게 분포되도록 합니다. 골격의 양쪽에 파종이 완료되면 유리관과 상단 구획을 다시 넣어 유동 배양 챔버를 조심스럽게 재구성합니다. 그리고 유동 배양 챔버를 인큐베이터에 넣어 섬유가 응고되도록 합니다.

바이오리액터를 펌프 시스템에 연결하려면 바이오리액터 베이스에 있는 8개의 나사산 중 하나에 유동 배양 챔버를 배치합니다. 그리고 중간 튜브에 호스트 클립을 놓습니다. 유동 배양 챔버의 상단 구획의 흐름 입구를 덮고 있는 흰색 루어 캡을 제거하고 매체 튜브의 암 루어 커플러를 제거합니다.

매체 튜브를 상단 구획에 있는 흐름 입구의 한쪽 면에 연결합니다. 그리고 하단 구획에 흐름 배출구가 있는 다른 쪽. laminar flow cabinet에서 incubator로 전체 설정을 옮깁니다.

그리고 유체 장치와 생물 반응기 베이스를 공기 압력 튜브와 전기 케이블에 연결합니다. 소프트웨어를 시작하고 펌프를 초기화합니다. 샘플에 대한 매체 흐름을 하나씩 시작합니다.

그런 다음 스트레인 펌프 매개변수를 원하는 설정으로 변경하고 스트레인을 시작합니다. 격일로 골격에 적용되는 스트레칭을 모니터링합니다. 장기간의 배양 기간 동안 신축 및 벽 전단 응력을 모니터링한 결과, 이러한 값이 최대 20일 동안 비교적 일정한 수준으로 유지될 수 있음을 알 수 있습니다.

3일간의 혈역학적 로딩 후, 면역형광 염색을 통해 골격 전체에 걸쳐 단핵구 유래 대식세포와 근섬유아세포의 균일한 분포를 확인할 수 있습니다. 20일간의 공동 배양 후, 주기적 스트레칭은 더 많고 두꺼운 콜라겐 유형 1 섬유의 침착을 초래합니다. 결합된 혈역학적 부하 그룹에서는 순환 스트레치 효과가 순전한 응력에 의해 무효화되어 덜 뚜렷한 콜라겐 유형 1 침착

대식세포 단일배양 8일 후, 모든 혈역학적 로딩 체제에서 섬유 침식 및 섬유 절단이 관찰되며, 정적 그룹에서 가장 뚜렷한 흡수가 관찰되고 순전한 스트레스 그룹에서 가장 뚜렷한 흡수가 관찰됩니다. 주기적인 스트레칭과 순전한 스트레스는 모두 공동 배양 설정의 사이토카인 분비 프로필에 영향을 미칩니다. 흥미롭게도, 두 하중의 결합된 효과는 두 하중 중 하나의 우세 또는 두 하중의 시너지 효과를 보여줍니다.

공동 배양 실험은 또한 기계적 환경과 그에 따른 하중 의존적 염증 환경이 근섬유아세포의 표현형을 조절한다는 것을 보여줍니다. 또한, 수축성 마커 알파 평활근 액틴의 유전자 발현 패턴은 단백질 합성과 상관관계가 있습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 가장 중요한 것은 스트레치를 적용하는 것이며 설정이 누출되지 않는 것이 중요합니다.