Name: 유량 및 스트레치 하에서 생체 재료의 염증 및 재생 능력을 평가하는 다중 큐 생물 반응기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 배우세요 다중 큐 생물 반응기를 이용하여 전단 응력과 순환 신장을 분리 제어하고, 거대식세포와 근섬유아세포의 동적 공배양을 통해 혈관 이식편의 재생 능력을 평가하는 방법을.

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이 연구는 LSH 2Treat 프로그램 (436001003)과 네덜란드 신장 재단 (14a2d507)의 일환으로 ZonMw에 의해 재정적으로 지원됩니다. N.A.K.는 유럽 연구 위원회 (851960)의 지원을 인정합니다. 네덜란드 과학연구기구(024.003.013)가 후원한 중력프로그램 '재료 중심재생'을 감사하게 인정합니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

본 명세서에 기재된 생물반응기는 관내 반사성 스캐폴드에서 염증 및 조직 재생에 대한 전단 스트레스 및 순환 스트레칭의 개별 및 결합된 효과의 기여도를 체계적으로 평가할 수 있다. 또한 이 방법을 사용하면 대표적인 결과 섹션에서 예시된 바와 같이 혈관 구조에서 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 이러한 결과는 TEVG 구조의 성장과 리모델링 모두에 다양한 혈역학 적재 체제(즉, 전단및 스트레치의 다양한 조합)의 독특한 영향을 보여줍니다. 이 시험관 내 플랫폼을 통해 수집된 이러한 통찰력은 Situ TEVG에서 새로 개발된 스캐폴드 설계 파라미터의 최적화를 지원합니다. 적절한 실험 워크플로우를 보장하기 위해서는 중요한 단계와 이 프로토콜의 한계를 이해하는 것이 중요합니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 샘플에 스트레치 적용과 관련이 있습니다. 스트레치 어플리케이션의 경우 설치가 누출되지 않는 것이 필수적입니다. 시스템에는 두 가지 약점이 있습니다: 압력 도관에 전기 스펀 이식편을 ...

심혈관 조직 공학(TE)은 현재 사용되는 영구 심혈관 보철물(예를 들어, 혈관 이식, 심장 판막 교체)에 대한 대체 치료 옵션으로 추구되고 있으며, 이는 환자의 큰 코호트에 대해 최적이 아니다1,2,3,4. 많은 수요가 응용 프로그램은 조직 엔지니어링 혈관 이식편 (TEVGs)5,6 및 심장 판막 (TEHV)7,8을포함한다. 대부분의 경우, 심장 혈관 TE 방법론은 새로운 조직이 형성될 수 있는 유익한 발판역할을 하는 개역 가능한 생체 재료(천연 또는 합성)를 사용합니다. 새로운 조직의 형성은 체외에서 완전히 설계될 수 있으며, 세포와 함께 스캐폴드를 시드하고 이식 전에 생체 반응기에서 배양하여(체외TE)9,10,11,또는 직접 앉아서 합성 스캐폴드가 체내에서 직접 새로운 조직의 형성을 유도하기 위해 사전 배양없이 이식된다( 12) 1,12. 시험관 내 및 시투 심혈관 TE 접근법의 경우 성공적인 기능성 재생은 이식된 구조에 대한 숙주 면역 반응과 적절한 생체 기계적 적재모두에 크게 의존합니다.
심혈관 TE용 생체역학적 하중의 중요성은15. 심혈관 임플란트의 경우, 스캐폴드를 채우는 세포는 혈역학적 환경의 결과로 발생하는 순환 스트레칭및 전단 응력에 노출됩니다. 수많은 연구는 콜라겐16,17,18,19,글리코소미노글리산 (GAGs)20,및 엘라스틴(21,22)및 다양한 세포 유형에 의해 매트릭스 성분의 형성에 (순환) 스트레칭의 자극 효과를보고했다. 예를 들어, 황 외는 혈관생물반응기(23)를이용하여 체외 TEVG에서 콜라겐 및 엘라스틴의 증착 및 조직을 상승시키는 양축 스트레칭을 입증했다. 강조는 일반적으로 지배적 인 부하로 스트레칭에 놓여 있지만, 이러한 연구는 종종 샘플이 전단 흐름에 노출되는 흐름 중심의 생물 반응기를 사용합니다. 3D의 조직 형성과 염증에 대한 전단 응력의 고립 된 영향에 대해서는 상대적으로 거의 알려져 없지만 일부 데이터를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Hinderer 외. 및 Eoh 외. 전단 흐름, 3D 스캐폴드 미세 구조 이외에, 체외 모델시스템(24,25)에서인체 혈관 평활근 세포에 의한 성숙한 엘라스틴형성에 중요했다. 전부, 이 사실 인정은 심장 혈관 TE를 위한 순환 스트레칭 및 전단 긴장 둘 다의 관련성을 보여줍니다.
TE 임플란트의 성공 또는 실패에 대한 또 다른 중요한 결정요인은 이식된접목(26)에대한 호스트의 면역 반응이다. 이는 실제로 세포 유입 및 내인성 조직 형성 및 리모델링27의후속 과정을 킥스타트하기 위해 스캐폴드에 대한 급성 염증 반응에 의존하는 시투 TE 전략에서 물질 중심의 물질 중심의 물질 중심을 위해 특히 중요하다. 대식세포는 기능성 조직 재생의 중요한 시노레이터이며, 이는 다중 연구28,29,30에의해 나타났다. 상처 치유와 유사하게, 조직의 재생은 섬유아세포와 근섬유세포 와 같은 대식세포와 조직 생성 세포 사이의 파라크리노 신호에 의해 지배된다31,32,33. 새로운 조직 증착을 조정하는 것 외에도, 대식세포는이물질(34,35)의활성 재흡수에 관여한다. 이와 같이, 생체물질에 대한 체외 대식세포반응은임플란트(36,37,38)의생체 내 성공을 위한 예측 파라미터로서 확인되었다.
이식된 스캐폴드에 대한 대식대식 반응은 재료 조성 및미세구조(35,39,40)와같은 스캐폴드 설계 기능에 의존한다. 스캐폴드 특성 외에도 비계에 대한 대식대식 반응과 근섬유아세포와의 교차토크도 혈역학적 하중의 영향을 받았습니다. 예를 들어, 순환 스트레치는 대식세포 표현형41,42,43,44 및 사이토카인의 분비(43,44,45,46in 3D 일렉트로스펀 스캐폴드)의 중요한 변조기로 나타났다. 대식세포와 혈관 평활근 세포의 공동 배양 시스템을 사용하여, Battiston 등. 대식세포의 존재는 엘라스틴과 GAGs의 증가 수준으로 이어졌고 순환 스트레치 (1.07-1.10)의 적당한 수준이 콜라겐 I와 엘라스틴47의증착을 자극했다는 것을 입증했습니다. 전작에서는 전단 응력이 3D 전두엽 비계48,49로단백세포 모집을 위한 중요한 결정제이며, 전단 응력과 순환 스트레치 모두 인간 단세포와 중간엽 기질세포(50)사이의 파라크리온 신호에 영향을 미친다는 것을 입증하였다. Fahy 등은 전단 흐름이 인간단핵구(51)에의한 염증성 사이토카인의 분비를 증가시키는 것을 입증했다.
종합하면, 위의 증거는 혈역학 적재에 대한 적절한 이해와 제어가 심혈관 TE에 매우 중요하며 이를 달성하기 위해 염증 반응을 고려하는 것이 중요하다는 것을 보여줍니다. 수많은 생물 반응기는 이전에 시험관 내52,53,54,55, 56,57,57,58 또는 전 생체59,60,61 심혈관 조직의 문화를 위해 이전에 기술되었다. 그러나 이러한 모든 시스템은 가능한 한 생리적 혈역학 적재 조건을 모방하도록 설계되었습니다. 이것은 시험관 내에서 심장 혈관 조직을 만들거나 전 생체 문화를 유지하기위한 목적으로 매우 가치가 있지만, 이러한 시스템은 개별 단서의 개별 효과에 체계적인 연구를 허용하지 않습니다. 이는 이러한 생물 반응기에서 순환 스트레칭과 전단 응력의 적용이 본질적으로 연결되는 동일한 가압 흐름에 의해 구동되므로. 정확한 멀티큐 기계식 조작을 허용하는 마이크로시스템은 2D 기판62 또는 3D 하이드로겔 설정63,64에대해 설명되어 왔지만, 이러한 설정은 탄성액 3D 생물재료 스캐폴드의 통합을 허용하지 않는다.
여기에서, 우리는 유일하게 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게하고 기계적으로 그들의 개별및 결합된 효력을 조사하는 것을 돕는 관 생물 반응기 시스템의 응용을 제시합니다. 이 시스템은 조직 설계 혈관 이식의 광범위한 테스트를 허용 (예를 들어, 합성 또는 자연 기원, 다른 마이크로 아키텍처, 다양한 다공성). 전단 응력과 스트레치의 적용을 효과적으로 분리하기 위해, 생체 반응기에서 사용하는 주요 개념은 (1) 뚜렷한 펌프 시스템을 사용하여 전단 응력 및 스트레치 제어의 분리와 (2) 스캐폴드의 자극을 계산 구동 치수로 '내부 아웃'방식으로 분리하는 것이다. 흐름은 유동 펌프의 사용을 통해 관 비계의 외부 표면에 적용되는 반면, 스캐폴드의 일주 스트레칭은 별도의 스트레인 펌프를 사용하여 스캐폴드가 장착되는 실리콘 튜브를 확장하여 유도된다. 구성을 포함하는 실리콘 튜브및 유리 튜브의 치수는 스캐폴드(흐름에 의한) 및 외주 스트레치(튜브 팽창로 인한)의 전단 응력이 서로 크게 영향을 미치지 않도록 하기 위해 전산 유체 역학 시뮬레이션을 사용하여 신중하게 선택및 검증된다. 이 내부 아웃 디자인은 몇 가지 실용적인 근거가 있습니다. 발광 유체 압력(생리적 적재와 유사)에 의해 스트레치가 적용되는 경우, 본질적으로 샘플 설계가 누출되지 않습니다. 또한, 시료를 스트레칭하는 데 필요한 압력은 시료 강성에 의해 완전히 결정되며, 이는 시간이 지남에 따라 샘플과 샘플 내에서 다를 수 있어 스트레치를 제어하기가 어려워집니다. 이 생물 반응기는 실리콘 튜브 주위에 조직 설계 이식편을 장착하고 접목의 외벽에 벽 전단 응력 (WSS) 응용 프로그램을 허용하고 내부에서 접목을 가압합니다. 이러한 방식으로, 시간이 지남에 따라 샘플과 샘플 내의 동일한 하중 조건을 보장할 수 있으며, 또한, 다공성 혈관비계(19)에공통적으로 도공되는 바와 같이 시료가 새는 것을 허용한다. 이 내부 아웃 생물 반응기는 특히 전통적인 혈관 생물 반응기 설치가 더 적합한 시험관 내의 토착 혈관의 엔지니어링보다는 전단 및 / 또는 스트레치의 효과에 대한 체계적인 연구를 위한 것입니다. 생물 반응기 설계 도면에대한 그림 1A-B를 참조하고, 생체 반응기의 주요 구성 요소 뒤에 기능적 설명 및 근거에 대한 해당 표 1을 참조하십시오.
생물 반응기의 사용은 우리가 시상 심혈 관 조직19,43,44에대한 반사 전기 스프폴드에서 염증과 조직 형성에 전단 스트레스와 순환 스트레칭의 개인 및 결합 된 영향을 조사하는 우리 그룹에 의해 최근 연구의 시리즈에 기초하여 입증된다. 이를 위해, 우리는 인간 대식세포와 근섬유아세포를 모노 또는 공동 배양에서 사용하여 시투 재생 폭포의 다양한 단계를 시뮬레이션했습니다. 우리는 인간 대식세포에 의한 사이토카인 분비액이 이러한 비계에서 인간 근섬유세포에 의해 매트릭스 증착 및 조직에 영향을 미치는 순환 스트레치 및 전단 응력 모두에 의해 뚜렷하게 영향을 받는것을 입증했으며, 파라크리노 신호 및 직접 접촉19,43,44를통해. 특히, 이러한 연구는 전단 스트레스와 스트레칭의 결합 된 응용 프로그램의 경우, 조직 형성과 염증에 미치는 영향은 두 부하 중 하나에 의해 지배된다는 것을 밝혔다, 또는 두 부하의 시너지 효과가있다. 이러한 연구 결과는 TE 공정에서 기계적 환경의 기여를 더 잘 이해하기 위해 두 부하를 분리하는 관련성을 보여줍니다. 이러한 이해는 관련 혈역학 적재 기조에서 스캐폴드 설계 파라미터를 체계적으로 최적화하기 위해 적용될 수 있습니다. 또한, 이러한 잘 조절된 환경에서 의 기계형 데이터는 최근 TEVGs65 또는 TEHV66에대해 보고된 바와 같이, 시투 조직 리모델링 과정을 예측하기 위해 개발되고 있는 수치 모델에 대한 입력으로 작용할 수 있으며, 예측 능력을 더욱 향상시킨다.

<table><tbody><tr><td>고급 Dulbecco' s 변형된 EagleMedium(aDMEM)</td>섬유아세포용 <td>Gibco</td><td>12491-015</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>Aqua Stabil</td><td>Julabo</td><td>8940012</td><td>생물반응기-유압 저장소에서 미생물 성장 방지</td></tr><tr><td>소 피브리노겐</td><td>Sigma</td><td>F8630</td> 전기 방사 골격 소 트롬빈 Sigma T4648<td>에 세포를 파종하기 위한 피브리노겐 겔 준비</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>피브리노겐 젤을 준비하여 전기 스캐폴</td></tr>드 <tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td>를 스핀다운하고 컨디셔닝 배지</td></tr><tr><td>클램프 가위인 "켈리 집게"</td><td>Almedic</td><td>P-422</td><td>실리콘 튜브를 고정하고 스캐폴드에 사전 스트레치를 적용하여 스캐폴드가 새겨진 홈에 봉합될 수 있도록 합니다(1단계, 7단계에서 오토클레이브)</td></tr><tr><td>CO2 세포 배양 인큐베이터</td><td>Sanyo</td><td>MCO-170AIC-PE</td>, 세포 <td>배양을 위한</td></tr><tr><td>PE, 압축 공기 저장소</td>, <td>Festo</td><td>CRVZS-5</td>, <td>기압 변동을 완화하고 압력 상승을 위한 시간 지연을 생성</td></tr>, <tr><td>최대 스트레치를 계산하는 사용자 정의 Matlab 스크립트</td>, <td>Matlab</td><td>R2017. Mathworks, Natick, MA</td>는 <td>전기 방사 비계 데이터 수집 보드의 최소 및 최대 외경을 계산합니다</td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090</td><td>증폭기 시스템과 컴퓨터</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>사이의 데이터 처리 VWR</td><td>VWRK4096-9005</td><td>멸균 작업 조건을 유지하기 위해</td></tr> 태<tr><td>아 소 송아지 혈청 (FBS)</td> <td>Greiner</td><td>758087</td><td>세포 배양 배지 보충제; 혈청 보충</td></tr><tr><td>유동 배양 챔버 격실, 실리콘 튜브에 압력을 가하기 위해 새겨진 홈과 작은 구멍이있는 압력 도관, 나사산, 노즈 콘, 흐름 입구 및 하단 구획 흐름 배출구가있는 상단 구획, 어댑터 부싱</td><td>맞춤 제작, 의생명 공학과, 아인트호벤 공과 대학</td><td>n.a.flow</td> <td>배양 챔버 구획 (1 단계에서 오토 클레이브, 단계 7)</td></tr> <tr><td>유리제 파스퇴르 피펫</td><td>조수</td><td>HE40567002</td><td>electrospun 비계에 진공을 적용하십시오 (단계 1)</td></tr> <tr><td>교류 문화 약실의 유리관</td><td>의 유리관은 Custon 만드는, 장비 & ; 프로토 타입 센터, Eindhoven University of Technology</td><td>n.a.</td><td>유동 배양 챔버의 일부 (1 단계 및 7 단계에서 70 % 에탄올로 세척 및 보관)</td></tr> <tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>세포 배양 배지 아미노산 보충제, 암모니아 축적 최소화</td></tr><tr><td>고속 카메라</td><td>MotionScope</td><td>M-5</td><td>배양 중 스트레칭을 모니터링합니다. 골격의 타임랩스 사진은 30Hz의 주파수에서 6초 동안 캡처됩니다(즉, 3번의 스트레치 사이클)고속</td></tr> <tr><td>카메라 렌즈 - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - 렌즈</td><td>Nikon</td><td></td>은 <td>배양 중 스트레칭을 모니터링하기 위해 JAA616AB합니다. 스캐폴드의 타임랩스 사진은 30Hz의 주파수에서 6초 동안 캡처됩니다(즉, 3번의 스트레치 사이클)</td></tr><tr><td>호스 클립</td><td>ibidi GmbH</td><td>10821</td><td>블록 매체 흐름(1단계에서 오토클레이브, 7 단계)</td></tr> <tr><td>8 개의 흐름 배양 챔버에 8 개의 나사산이있는 유압 저장소</td><td>맞춤 제작, 의생명 공학과, 의생명 공학과,</td><td></td> <td>실리콘 장착 구조물에 압력을 가합니다 (70 % 에탄올이 함유 된 종이 티슈로 외부를 청소하고 70 % 에탄올로 헹굼 저장 탱크를 사용한 후 1 단계와 7 단계에서 데미 워터)</td></tr><tr><td>ibidi 펌프를 포함한 Ibidi 펌프 시스템(8x), PumpControl 소프트웨어, 유체 장치, 관류 세트(중간 튜빙), 공기 압력 튜빙, 유</td>동 배양 챔버의 흐름을 제어하는 데 사용되는 주황색 실리카 비드가 있는 <td>건조 병 ibidi GmbH</td><td>10902</td><td>설정. 참고 1: ibidi 펌프는 200mbar 용량을 사용할 수 있도록 제조업체에서 수정했습니다. 참고 2: 동일한 교류 체제가 적용될 수 있을 한, 다른 제조자의 펌프 체계에 의해 대체될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>나이프 (no.10 멸균 블레이드, 개별 호일 팩) 및 메스 손잡이 (스테인리스 스틸, 개별 포장)</td> <td>Swann Morton</td><td>0301; 0933</td><td>발판에 맞는 크기로 실리콘 튜브를 절단하고 봉합사 재료를 절단하기 위해</td></tr><tr><td>LabVIEW Software</td><td>National Instruments</td><td>버전 2018</td> 발<td>판에 적용되는 스트레치를 제어하기 위해</td></tr><tr><td>자외선이 있는 층류 생물 안전 캐비닛</td><td>Labconco</td><td>302310001</td><td>멸균 작업 조건을 보장합니다. UV는 오토클레이브 후 오토클레이브하거나 만질 수 없는 모든 것의 오염을 제거하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>멸균 작업 조건을 위한</td><td>크고 작은 페트리 접시</td><td>Greiner</td><td>664-160</td> L</tr><tr><td>-아스코르브산 2-인산염(비타민 C)</td><td>콜라</td>겐 생성에 중요한 Sigma <td>A8960</td><td>세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>LED 광 냉원 KL2500</td><td>Zeiss</td><td>Schott AG</td><td>스트레치</td></tr><tr><td>Luer (여성 및 남성) 잠금 장치 및 커넥터, 흰색 Luer Cap</td><td>ibidi GmbH</td> 다양한 모니터링 중 골격의 시간 경과에 대한 시각화를 돕기 위해 <td>(https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td> <td>생물 반응기 및 ibidi 펌프의 부품을 닫거나 연결하기 위해 (1 단계, 7 단계에서 오토 클레이브)</td></tr> <tr><td>측정 증폭기 (PICAS)</td><td>PEEKEL 기기 BV.</td><td></td><td>압력 센서의 신호를 증폭하고 LabView</td></tr><tr><td>매체 저장소 (대형 주사기 60 mL) 및 저장소 홀더</td><td>ibidi GmbH</td><td>10974</td><td>중간 저장소 (1 단계, 7 단계에서 오토 클레이브)</td></tr><tr><td>4.25 mm 외경 및 1 mm 내경의 중간 튜브</td><td>고무 BV</td><td>1805</td><td>더 큰 유속을 허용하기 위해 더 큰 직경의 IBIDI 미디엄 튜빙이 사용됩니다. 참고: 유체 장치 밸브를 통해 안내되는 매체 튜빙의 일부는 기본 ibidi 매체 튜빙</td></tr><tr><td>Motion Studio 소프트웨어</td><td>Idtvision</td><td>2.15.00</td>과 동일하여 <td>스트레치 모니터링을 위한 고속 타임랩스 이미지를 만듭니다</td></tr><tr><td>. 니들(19G)</td><td>BD Microlance</td><td>301700</td>은 <td>기포를 추가하지 않고 유압 저장소를 초순수로 채우는 데 사용되는 얇고 유연한 튜브와 함께</td></tr><tr><td>니들 드라이버</td><td></td><td></td><td>실리콘 튜브를 통해 나일론 봉합사의 바늘을 처리하는 Adson 2429218(1단계, 7단계에서 오토클레이브)70</td></tr><tr><td>% 에탄올로 장비 청소를 위한</td>종이 <td>티슈</td><td>Kleenex</td><td></td></tr><tr><td>38044001 누출</td> 발생 시 <td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>빠른 수정</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(P/S)</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>세포 배양 배지 보충제, 박테리아 방지 오염</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td>보관 및 세척 단계용 <td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>(1단계에서 오토클레이브)</td></tr><tr><td>빨간색 나사 캡이 있는 플라스틱 용기(60mL)</td><td>피브리노겐 용액 준비를 위한</td><td>Greiner</td><td>206202</td></tr> 공압 <tr><td>실린더</td><td>Festo</td><td>AEVC-20-10-I-P</td><td>(1단계 및 7단계에서 70% 에탄올이 함유된 종이 티슈로 세척)</td></tr><tr><td>폴리카프로락톤 비수레아(PCL-BU) 관형 골격(3mm 내경, 200 &마이크로; m 벽 두께, 길이 20mm)</td><td>SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands</td><td>n.a.15</td><td>%(w/w) 클로로포름(시그마, 372978) 폴리머 용액에서 전기 방사를 사용하여 생산합니다. 자세한 내용은 Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018)를 참조하십시오</td></tr>.<tr><td>구멍이 없는 압력 도관(정전기 제어용)</td><td>맞춤 제작, 의생명공학과, Eindhoven University of Technology</td><td>n.a.</td><td>실리콘 튜브에 전기 방사 튜브를 장착하려면(1단계, 7단계에서 오토클레이브)</td></tr><tr><td>압력 센서 및 변환기</td><td>BD</td><td>TC-XX 및 P 10 EZ</td><td>공압 작동 펌프로 가는 공기 압력은 설정 압력에 도달할 때까지 상승합니다</td></tr><tr><td>비례 공기 압력 제어 밸브 및 압력 센서</td><td>Festo</td><td>MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td><td>공압 작동 펌프에 압축 공기를 제공합니다</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td></td><td>단핵구/대식세포용 A1049101 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>Safe lock Eppendorf tubes(1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>다양한 응용 분야(1단계에서 오토클레이브)</td></tr><tr><td>나트륨 도데실 설페이트 용액 20%</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>0.1% 농도의 재료 세척에 사용됩니다. &nbsp;</td></tr><tr>누출 방지를 위한 <td>실리콘 O-링</td><td>Technirub</td><td>1250S</td><td>(1단계, 7단계에서 오토클레이브)</td></tr><tr><td>실리콘 튜브(외경 2.8mm, 벽 두께 400um)</td><td>압력 도관에 전기방사관을 장착하기 위한 고무 BV 1805(1단계에서 오토클레이브)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균관(15mL)</td><td>다양한 용도로</td>사용할 <td>352095</td><td>수 있는 Falcon</td></tr><tr><td>봉합사, 테이퍼 포인트 니들이 미리 부착된 5-0 프롤렌</td><td>에티콘, 존슨& Johnson</td><td>EH7404H</td><td>Prolene 봉합사 와이어 5-0 (길이 75cm, TF 테이퍼 포인트 바늘, 1/2 원, 바늘 길이 13mm)</td></tr><tr><td>주사기 (24 mL)</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>2057932</td><td>초순수 또는 매체를 유압 저장소 또는 유동 배양 챔버에 첨가</td></tr> 주<tr><td>사기 필터 (0.2 &micro; m)</td> <td>Satorius</td><td>17597-K</td><td>피브리노겐 용액</td></tr><tr><td>T150 세포 배양 플라스크 필터 캡 Nunc</td><td></td><td>178983</td><td>가스 제거 배양 배지</td></tr><tr><td>T75 필터 캡 세포 배양 플라스크</td><td>Nunc</td><td>156499</td><td>정전기 제어 샘플을 배양하기 위해</td></tr> 테<tr><td>프론 벨로우즈</td><td>맞춤 제작, 아인트호벤 공과 대학교 생물 의학 공학과</td><td>n.a.</td><td>유압 저장 용기 적재(1단계 및 7단계에서 에탄올 70%가 함유된 종이 티슈로 외부 세척)트레이</td></tr><tr><td>(스테인리스 스틸)</td><td>PolarWare</td><td>15-248</td><td>인큐베이터에서 층류 캐비닛 및 후면으로 유체 배양 챔버 및 바이오리액터를 쉽게 운반(사용 전후에 에탄올 70%가 함유된 종이 티슈로 세척)핀</td></tr><tr><td>셋</td><td>Wironit</td><td>4910</td><td>개별 부품의 멸균 처리(1단계 및 7단계에서 오토클레이브)</td></tr><tr><td>초순수</td><td>Stakpure</td><td>Omniapure UV 18200002</td><td>매체 증발을 보정하고 아쿠아 스타빌과 혼합하여 유압 유체로 사용합니다. (1단계에서 오토클레이브 초순수)</td></tr><tr><td>자외선</td><td>Philips</td><td>TUV 30W/G30 T8</td><td>파종 전 이식편 및 생물반응기 부품 오염 제거</td></tr></tbody></table>

유량 및 스트레치 하에서 생체 재료의 염증 및 재생 능력을 평가하는 다중 큐 생물 반응기

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

신체에서 직접 재생을 유도하는 재생을 유도하는 재생 가능한 생체 재료의 사용은 번역 관점에서 매력적인 전략입니다. 이러한 물질은 이식 시 염증 반응을 유도하며, 이는 물질의 후속 흡수와 새로운 조직의 재생의 원동력이다. 이 전략, 또한 시투 조직 공학에서 로 알려진, 조직 설계 혈관 이식 등 심장 혈관 교체를 얻기 위해 추구. 염증 및 재생 공정 은 스캐폴드 (즉, 스트레치 및 전단 응력)에 대한 국소 생체 역학 적 단서에 의해 결정됩니다. 여기서는 관 비계에서 스트레치및 전단 응력을 분리할 수 있는 맞춤형 생물 반응기의 사용을 자세히 설명합니다. 이를 통해 인간 대식세포와 근섬유아세포아제를 이용한 역동적인 공동배양 실험에 기초하여 입증되는 잘 조절된 기계적 하중의 영향으로 관 비계의 염증및 재생 능력의 체계적이고 표준화된 평가를 가능하게 한다. 바이오 반응기의 구성 및 설정, 비계 및 세포 파종의 준비, 스트레치 및 전단 흐름의 적용 및 유지 보수, 분석을 위한 샘플 수확 등 이 접근법의 주요 실용적인 단계는 자세히 설명합니다.

이 생물 반응기는 혈관 조직 성장에 전단 스트레스와 순환 스트레칭의 개별적이고 결합 된 효과를 연구하고 3D 생체 물질 스캐폴드에서 리모델링하기 위해 개발되었다. 생물 반응기의 설계는 다양한 적재 조건하에서 최대 8개의 혈관 구조를 배양할 수 있게한다(도 1A). 혈관 구조는 둘레 스트레치와 WSS가 독립적으로 제어될 수 있는 유량 배양챔버(도 1B)에위치한다. 유동 배양 챔버의 상부 구획은 비교적 짧은 정착 길이(도1C)에서흐름을 안정화하기 위해 유동 스트레이트너를 보유한다. 유동 스트레이트너의 직접 하류, 코 콘은 환상 채널(도 1D)를통해 균등하게 흐름을 분배한다. 프로토콜의 모든 단계가 올바른 방식으로 수행될 때, 유동 배양 챔버내의 혈관 비계는 스캐폴드와 유리 벽 사이의 환상 채널을 통해 연속단방향 흐름을 실...

이 프로토콜의 목표는 관형 전기 스캐폴드에서 인간 대식세포와 근섬유세포의 동적 공동 배양을 실행하여 재료 중심 조직 재생을 조사하는 것이며, 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게 하는 생체 반응기를 사용하는 것입니다.

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

지금까지는 혈류역학과 혈관 조직 재생 사이의 인과 관계를 규명하는 것이 정말 어려웠습니다. 그리고 이것은 개별 기계적 부하를 제어하는 것이 어렵기 때문입니다. 이 생물 반응기를 통해 다양한 조직 공학 혈관 이식편의 재생 잠재력에 대한 순전한 스트레스와 주기적 스트레치의 개별적이고 결합된 효과를 기계적으로 조사할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 사람은 우리 그룹의 박사 과정 학생인 Suzanne Koch입니다. 그리고 우리 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Tamar Wissing. 전기 회전 스캐폴드를 실리콘 튜브에 장착하려면 4-0 프롤렌 봉합사를 실리콘 튜브 조각의 한쪽 끝에 끼우고 다른 쪽 끝에서 빼냅니다.튜브의 양쪽에 작은 매듭을 만들고 양쪽 매듭에 약 10cm의 와이어를 남기고 두 매듭 위에 세 번째 매듭을 만듭니다. 봉합사 바늘을 제거한 후 실리콘 튜브의 가장자리를 삼각형 모양으로 자르고 두 개의 10cm 와이어 끝에 최종 매듭을 만듭니다. 전기 방적 골격을 30% 에탄올에 담그고 자유 봉합 와이어의 한쪽 끝에 골격을 놓습니다.다음으로, 실리콘 튜브의 양쪽과 10cm 봉합사 매듭을 부드럽게 늘리고, 두 번째 연구원은 내부 팁이 부드러운 핀셋을 사용하여 전기 회전 스캐폴드를 튜브 위로 부드럽게 밀어 넣습니다. 실리콘 튜브의 스트레치를 천천히 해제하는 동시에 핀셋으로 전기 회전 스캐폴드를 매끄럽게 합니다. 그리고 비계와 실리콘 튜브를 초순수에 두 번 담그십시오.하단 구획을 구성하고 O-링이 제대로 배치되었는지 확인하십시오. 하단 구획의 상단에 어댑터 부싱을 놓고 하단 구획을 통해 구멍이 있는 압력 도관을 배치합니다. 누출을 방지하기 위해 압력 도관의 하단에 실리콘 O-링을 묶습니다.그리고 하단 구획의 아래쪽 부분을 하단 구획의 위쪽 부분에 나사로 고정하여 압력 도관을 고정합니다. 압력 도관의 아래쪽에 새겨진 홈이 하단 구획의 어댑터 부싱 가장자리에서 약 3-5mm 위에 있는지 확인하십시오. 전기 회전 스캐폴드가 있는 실리콘 튜브를 압력 도관 위로 당기고 고개를 끄덕이고 압력 도관에 새겨진 홈 위치에서 전기 스펀 스캐폴드 하단의 봉합 와이어를 만듭니다.반대쪽에서 두 번째 고개를 끄덕여 전기 방적 이식편으로 실리콘 튜브를 단단히 고정합니다. 그리고 실리콘 튜브의 상단에 규칙이 있는 가위형 클램프를 놓고 가위형 클램프를 일관된 방식으로 위쪽으로 당기고 전기 스폰 스캐폴드를 부드럽게 당겨 주름을 제거합니다. 봉합사를 사용하여 압력 도관의 상부 새겨진 홈에 있는 비계의 양쪽 끝에 두 개의 매듭을 만듭니다.두 매듭이 모두 만들어지면 가위 cl을 해제합니다.amp 칼을 사용하여 여분의 실리콘 튜브를 제거합니다. 동적으로 로드될 샘플에 대한 압력 도관의 나사산에 노즈 콘을 나사로 고정합니다. 압력 도관, 튜브 및 스캐폴드를 30% 에탄올에 한 번, 초순수에 두 번 담궈 설정을 미리 적십니다.유리관을 압력 도관 위에 놓고 하단 구획을 부드럽게 눌러 유리관을 제자리에 고정합니다. 그런 다음 흐름 교정기, 실리콘 O-링 및 어댑터 부싱을 상단 구획에 놓습니다. 그리고 유리관의 열린 끝 부분에 구획을 고정합니다.흐름 배출구에서 수 루어 플러그를 제거하고 멸균 층류 캐비닛에서 작업하십시오. 흰색 루어 캡을 열고 흐름 배출구 앞에 에탄올 담그기 티슈를 놓습니다. 상부 격실이 있는 유리관을 분리하여 유동 배양실을 분해합니다.진공 방초 파이프를 놓고 전기 방적 스캐폴드에 추가하여 가능한 한 많은 매체를 제거합니다. 그리고 피브리노겐 용액을 트롬빈이 보충된 세포 현탁액과 1:1 비율로 첨가합니다. 용액을 위아래로 한 번 피펫팅하고 즉시 골격의 전체 길이에 용액을 떨어뜨립니다.모든 세포가 전달되면 골격을 왼쪽에서 오른쪽으로, 위아래로 천천히 움직여 세포가 고르게 분포되도록 합니다. 골격의 양쪽에 파종이 완료되면 유리관과 상단 구획을 다시 넣어 유동 배양 챔버를 조심스럽게 재구성합니다. 그리고 유동 배양 챔버를 인큐베이터에 넣어 섬유가 응고되도록 합니다.바이오리액터를 펌프 시스템에 연결하려면 바이오리액터 베이스에 있는 8개의 나사산 중 하나에 유동 배양 챔버를 배치합니다. 그리고 중간 튜브에 호스트 클립을 놓습니다. 유동 배양 챔버의 상단 구획의 흐름 입구를 덮고 있는 흰색 루어 캡을 제거하고 매체 튜브의 암 루어 커플러를 제거합니다.매체 튜브를 상단 구획에 있는 흐름 입구의 한쪽 면에 연결합니다. 그리고 하단 구획에 흐름 배출구가 있는 다른 쪽. laminar flow cabinet에서 incubator로 전체 설정을 옮깁니다.그리고 유체 장치와 생물 반응기 베이스를 공기 압력 튜브와 전기 케이블에 연결합니다. 소프트웨어를 시작하고 펌프를 초기화합니다. 샘플에 대한 매체 흐름을 하나씩 시작합니다.그런 다음 스트레인 펌프 매개변수를 원하는 설정으로 변경하고 스트레인을 시작합니다. 격일로 골격에 적용되는 스트레칭을 모니터링합니다. 장기간의 배양 기간 동안 신축 및 벽 전단 응력을 모니터링한 결과, 이러한 값이 최대 20일 동안 비교적 일정한 수준으로 유지될 수 있음을 알 수 있습니다.3일간의 혈역학적 로딩 후, 면역형광 염색을 통해 골격 전체에 걸쳐 단핵구 유래 대식세포와 근섬유아세포의 균일한 분포를 확인할 수 있습니다. 20일간의 공동 배양 후, 주기적 스트레칭은 더 많고 두꺼운 콜라겐 유형 1 섬유의 침착을 초래합니다. 결합된 혈역학적 부하 그룹에서는 순환 스트레치 효과가 순전한 응력에 의해 무효화되어 덜 뚜렷한 콜라겐 유형 1 침착이 발생합니다.대식세포 단일배양 8일 후, 모든 혈역학적 로딩 체제에서 섬유 침식 및 섬유 절단이 관찰되며, 정적 그룹에서 가장 뚜렷한 흡수가 관찰되고 순전한 스트레스 그룹에서 가장 뚜렷한 흡수가 관찰됩니다. 주기적인 스트레칭과 순전한 스트레스는 모두 공동 배양 설정의 사이토카인 분비 프로필에 영향을 미칩니다. 흥미롭게도, 두 하중의 결합된 효과는 두 하중 중 하나의 우세 또는 두 하중의 시너지 효과를 보여줍니다.공동 배양 실험은 또한 기계적 환경과 그에 따른 하중 의존적 염증 환경이 근섬유아세포의 표현형을 조절한다는 것을 보여줍니다. 또한, 수축성 마커 알파 평활근 액틴의 유전자 발현 패턴은 단백질 합성과 상관관계가 있습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 가장 중요한 것은 스트레치를 적용하는 것이며 설정이 누출되지 않는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

우리 그룹은 심장 혈관 시스템의 생리 타악기의 스트레스가 implantable 작은 직경 혈관 이식을 다시 생성하기 위해 일일 생물 반응기 문화 시스템을 개발했습니다.

타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

생리학 및 병리 학적 압력 조건에 심장 밸브 조직을 쓰는 수있는 순환 압력 생물 반응기는 설계되었습니다. LabVIEW 프로그램은 사용자가 압력 크기, 진폭 및 주파수를 제어할 수 있습니다. 이 장치는 심장 밸브 조직이나 격리 세포의 mechanobiology을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

우리는 관절 연골 결손에 이전의 이식 연골의 BioComposite을 일축 또는 이축 기계적 변형을 적용 할 수 있습니다 소설 기계적 하중 생물 반응기를 설계했습니다.

조직 공학을위한 이축 기계 로딩 생물 반응기의 설계

여기에서는 최대 28일 동안 미세유체 다기관 칩에서 일차 세포, 조직 모델 및 펀치 생검을 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 인간 피부 미세혈관 내피 세포, 간 응집체 및 피부 생검이 공통 매체 순환에서 성공적으로 결합되었습니다.

멀티 장기 칩 - 장기 멀티 조직 공 배양을위한 미세 유체 플랫폼

우리는 macroporous microcarriers에 셀 확장 프로토콜 및 decellularized 조직 매트릭스를 시드하 관류 생물에서 배달 시스템으로 그들의 사용을 제안 합니다. 우리는 또한 세포 증식 및 microcarriers에 경작 하는 세포의 생존 능력을 결정 하기 위해 다른 기술을 포함 합니다. 또한, 생물 반응 기 배양 후 세포의 기능을 설명합니다.

재조합 콜라겐 나 세포 확장과 생물에 셀 납품 시스템으로 그들의 잠재적인 사용에 대 한 펩 티 드 Microcarriers 모델

이 문서에서는 연골 세포 압축을 위한 공압 작동 미세 유체 장치를 제조하고 특성화하기 위한 자세한 방법을 제공합니다.

동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼

이 논문은 세포 과정에서 용질의 분비 및 흡수 속도의 역학을 측정하기 위한 저비용의 다채널 관류 세포 배양 시스템을 구축하고 운영하는 방법을 제시한다. 시스템은 또한 세포를 동적 자극 프로파일에 노출시킬 수 있다.

동적 세포 배양을 위한 출구 분별과 통합된 다중 스트림 관류 생물반응기

줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 생체 공학적으로 설계된 3차원 심장 조직은 건강한 심근과 병든 인간 심근 을 체외 에서 연구하는 동시에 천연 심장 틈새 시장의 주요 측면을 요약하기 위한 유망한 모델로 부상했습니다. 이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포에서 생성된 high-content engineered 심장 조직을 제작하고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

공학적 심장 조직의 데이터 수집 및 모델 처리량을 개선하기 위한 바이오리액터 설계

전단 셀은 전단 속도 - 속도 구배 평면에서 소각 중성자 산란 측정을 위해 개발되고 복잡한 유체를 특성화하기 위해 사용된다. 속도 구배 방향으로 공간 분해 측정 전단 밴딩 물질을 연구 할 수 있습니다. 응용 프로그램은 콜로이드 분산의 조사, 폴리머 솔루션, 자기 조립 구조를 포함한다.

1-2 평면 흐름 - 작은 각 중성자 산란을 이용하여 재료 미세 조직에서 유량을 측정

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