파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

Thermobia domestica는 기초 곤충이기 때문에 이 종에 대한 유전학 연구는 동력 비행 및 변태와 같은 곤충의 주요 혁신 진화의 기저에 있는 메커니즘을 조명할 것입니다. 이 프로토콜은 배양 유지 관리에서 Thermobia를 실험실 모델 종으로 구현하기 위한 난자 미세 주입에 이르기까지 기본 기술을 다룹니다. 이 방법은 RNI 매개 유전자 녹다운(gene knockdown) 및 열비아(thermobia)의 형질전환(transgenesis)과 같은 다른 유전 도구의 적용에도 사용할 수 있습니다.

일반 인공 물고기 먹이가 담긴 큰 플라스틱 용기에 야생형과 돌연변이 개체군을 유지하고, 상단에 통풍구가 있는 플라스틱 컵에 담긴 물, 곤충을 숨기기 위한 접힌 종이, 알을 낳기 위한 겹겹이 쌓인 솜을 보관합니다. 모든 T.domestica 배양액을 섭씨 37도의 인큐베이터 안에 보관하고 각 용기 내부의 상대 습도를 60-80%로 설정합니다.알 채취 군체를 준비하기 위해 약 20명의 수컷과 20명의 암컷 성인을 음식, 물 공급, 접은 종이, 알을 낳을 수 있는 작은 목화가 있는 중간 크기의 용기로 옮깁니다. 짧은 시간 내에 많은 수의 단계적 배아를 얻기 위해 여러 군체를 설정합니다.

주입 당일에는 용기 내부의 면을 새 면으로 교체하십시오. 8시간 후 집게를 사용하여 층을 분리하여 겹겹이 쌓인 목화에서 난자를 수집합니다. 젖은 페인트 브러시를 사용하여 양면 테이프에 계란을 정렬하고 계란 사이에 2mm 거리를 유지합니다.

모든 계란은 계란의 세로축이 주입면을 향하도록 방향을 지정해야 합니다. 주사하는 동안 단단히 고정되도록 붓으로 계란을 부드럽게 누릅니다. 2마이크로리터의 gRNA CAS9 용액을 마이크로 로더가 있는 유리 주입 모세관에 로드합니다.

주입하기 전에 용액에 기포가 없는지 확인하십시오. 필요한 경우 바늘을 두드려 거품을 제거합니다. 바늘 끝을 집게로 약간 부러뜨려 바늘 끝을 최적화하여 막힘을 방지하고 일련의 주입을 통해 더 나은 내구성을 얻으십시오.

계란의 세로 축의 중간 지점에 바늘을 삽입하고 소량의 용액을 주입합니다. 바늘 끝의 모양에 따라 주입하는 동안 전자 마이크로 인젝터의 구성을 조정하십시오. 주입된 난자는 섭씨 37도에서 상대 습도 60-80%의 적절한 크기의 용기에 보관하십시오.

주입된 난자를 주기적으로 확인하고 손상된 난자는 곰팡이 증식을 방지하기 위해 폐기하십시오. 계란에서 너무 많은 곰팡이가 자라면 70% 에탄올로 계란 표면을 청소하십시오. 부화하기 전에 주입된 계란이 있는 유리 슬라이드를 활석 가루에 담궈 양면 테이프의 표면을 코팅합니다.

이렇게 하면 부화한 애벌레가 쌓이는 것을 방지할 수 있습니다. 분말 코팅된 유리 슬라이드를 음식, 물, 접힌 종이가 들어 있는 중간 크기의 용기에 옮깁니다. G1 애벌레를 흡인기 또는 페인트 브러시로 24개의 웰 플레이트로 분리합니다.

인공 일반 생선 식품의 공급을 유지하십시오. 24개의 우물 플레이트를 60-80%의 습도를 위한 물 공급이 가능한 더 큰 용기에 놓습니다핀치하고 집게를 사용하여 애벌레 또는 성인에게서 cercus를 당겨 50마이크로리터의 에탄올이 들어 있는 0.2ml 튜브에 수집합니다. 수집된 샘플은 장기 보관을 위해 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

뚜껑을 연 상태로 샘플 튜브를 섭씨 70도에서 15분 동안 열 블록에 올려 놓고 에탄올을 증발시킵니다. 알을 낳은 후 첫 8시간 이내에 배아에 gRNA CAS9 리보핵단백질 복합체를 주입하면 gRNA 표적 부위에 indels가 생성됩니다. 이것은 주입된 세대의 일부 세포에서 이중대립유전자 돌연변이를 일으키고 돌연변이 모자이크 표현형이 일반적으로 얻어집니다.

이 프로토콜이 백색 유전자를 표적으로 하도록 설계된 gRNA를 주입하는 데 사용되었을 때, G0 애벌레의 32.6%가 겹눈과 등쪽 부위에 부분적인 색소 침착 소실을 보였습니다. G0 성인과 돌연변이된 G1 개체의 생식세포 형질전환에 대한 평가는 게놈 PCR에 이어 이종 이중 이동성 분석으로 수행되었습니다. G1 샘플에서는 야생형과 돌연변이된 샘플 사이의 차등 밴드 패턴을 명확하게 구별할 수 있습니다.

Thermobia의 게놈 편집은 곤충의 조기 형질의 기저에 있는 유전적 메커니즘을 분석하기 위한 견고한 접근 방식을 제공합니다. 그들과 우리의 뛰어난 성공 뒤에 숨겨진 비밀을 탐구하는 데 도움이 됩니다.