Fecal (micro) RNA Isolation

Fyonn H. Dhang; Howard L. Weiner; Shirong Liu

doi:10.3791/61908

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Immunology and Infection

Fecal (micro) RNA Isolation

분변(마이크로) RNA 분리

Full Text

5,272 Views

05:35 min

October 28, 2020

DOI: 10.3791/61908-v

Fyonn H. Dhang^1,2, Howard L. Weiner^1,2, Shirong Liu^1,2

¹Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center,Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, ²Evergrande Center for Immunologic Diseases,Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

이 프로토콜은 동물 및 인간 피험자의 배설물 샘플에서 고품질 총 RNA를 분리합니다. 상용 miRNA 분리 키트는 최적화된 양과 품질로 순수 RNA를 분리하기 위해 상당한 적응과 함께 사용됩니다. RNA 분리물은 염기서열분석, 마이크로 어레이 및 RT-PCR과 같은 대부분의 다운스트림 RNA 분석에 적합합니다.

microRNA를 연구하기 위해 분변 샘플에서 RNA를 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 높은 품질과 양으로 대변에서 RNA를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 살아있는 미생물로부터 RNA를 최소화합니다.

이 프로토콜에서

바인딩 버퍼가 사용되지 않는다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 간단하고 간단합니다. 먼저 25-100mg의 대변 샘플을 600마이크로리터의 멸균 1X DPBS에 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 재현탁시키는 것으로 시작합니다.

샘플이 들어있는 튜브를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 1 밀리리터 피펫 팁과 와류로 혼합물을 으깬다. RNA의 양 그리고 질을 낙관하고 증가시키기 위하여 45 초 동안 분 당 000 교체에 1개의 주기에 대한 조정을 가진 균질화기에 있는 혼합물을 재suspend

600마이크로리터의 산성 페놀 클로로포름 용액을 샘플에 넣고 혼합물을 60초 동안 와류로 가열합니다. 또는 수율에서 증가된 RNA 양을 최적화하려면 균질기와 혼합합니다. 수성 및 유기 상을 분리하기 위하여 실내 온도에 10, 000 x g에 15 분 동안 표본을 분리기로 만드십시오.

인터페이스가 컴팩트해질 때까지 원심분리를 반복합니다. 상부 수성상을 하부상을 방해하지 않고 힌지 캡이 있는 새로운 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. ACS 등급 100% 에탄올을 획득된 수성 위상 부피의 1.25배에서 3초 동안 첨가합니다.

필터 카트리지를 수집 튜브에 넣습니다. microRNA 분리 키트에 제공된 필터 카트리지에 각 샘플의 600마이크로리터를 로드합니다. 10, 000 x g에서 90초 동안 원심분리기를 사용하여 카트리지를 통해 혼합물을 여과합니다.

그런 다음 여과액을 버리십시오. 연속적인 적용에서 혼합물의 전체 부피가 동일한 필터 멤브레인을 통해 여과될 때까지 이 작업을 반복합니다. 결국 샘플이 필터링됩니다.

700마이크로리터의 microRNA 세척 용액 1을 동일한 필터 카트리지에 추가합니다. 필터 카트리지를 통해 세척 용액을 걸러내기 위해 60초 동안 원심분리기를 사용합니다. 여과액을 버리고 동일한 수집 튜브에 필터 카트리지를 놓습니다.

10, 000 x g에 ACS 급료 100%ethanol 및 분리기에서 준비된 세척 해결책 2/3의 700 마이크로리터를 가진 필터 카트리지를 1분 동안 x g 세척하십시오. 얻은 여과액을 버리고 필터 카트리지를 동일한 튜브에 넣습니다. 500 마이크로리터의 세척 용액 2/3 및 10, 000 x g에서 1분 동안 원심분리기로 필터 카트리지를 세척합니다.

얻어진 여과액을 버리고 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다. 10, 000 x g에 ACS 급료 100%ethanol 그리고 분리기에서 준비된 세척 해결책 2/3의 250 마이크로리터를 가진 필터 카트리지를 10, 000 x g 분 동안 세척하십시오. 얻어진 여과액을 버리고 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다.

마지막으로, 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 옮기고 어셈블리를 5분 동안 회전시켜 잔류 유체를 제거합니다. 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 옮긴 다음 필터 중앙에 뉴클레아제가 없는 물 50마이크로리터를 추가하고 튜브를 덮습니다. 튜브를 실온에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 8, 000 x g에서 5분 동안 튜브를 돌려 RNA를 새로운 수집 튜브로 회수합니다. RNA의 칩 기반 전기영동 분석법은 마우스 및 인간 배설물에서 분리된 대표적인 RNA가 18S 및 28S rRNA 조성이 낮거나 부족하고 RNA 분리물의 크기가 작은 RNA 영역에 속한다는 것을 시사합니다. 칩 기반 전기영동을 사용한 또 다른 작은 RNA 전기영동은 RNA의 상당 부분이 microRNA 크기임을 밝혔습니다.

추출된 RNA의 순도는 260 및 280 나노미터 파장에 대해 2.0의 흡광도비와 260 및 230 나노미터에서 흡광도에 대한 1.8 비율 값으로 표시된 바와 같이 높았습니다. 유기 추출의 성공을 보장하려면 면이 분명한지 확인하고 수성의 부피가 감소하더라도 하부상을 방해하지 않고 상부 수성상만 전달해야 합니다.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos