Isolamento fecale (micro) RNA

Presentiamo un protocollo per isolare l'RNA da campioni fecali per studiare i microRNA. Questo protocollo può essere utilizzato per isolare l'RNA dalle feci con alta qualità e quantità. Riduce al minimo gli RNA dei microbi viventi.

È importante sottolineare che il buffer di binding non viene utilizzato in questo protocollo. Questo protocollo è semplice e diretto. Iniziare risospendendo da 25 a 100 milligrammi di campioni fecali in 600 microlitri di 1X DPBS sterile in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.

Incubare la provetta contenente il campione a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi schiacciare il composto con un puntale di pipetta da un millilitro e agitare bene. Risospendere la miscela in un omogeneizzatore con un'impostazione per un ciclo a 4.000 rotazioni al minuto per 45 secondi per ottimizzare e aumentare la quantità e la qualità dell'RNA.

Aggiungere 600 microlitri di soluzione acida di cloroformio fenolico al campione e agitare la miscela per 60 secondi. In alternativa, per ottimizzare una maggiore quantità di RNA nella resa, mescolarlo con un omogeneizzatore. Centrifugare il campione per 15 minuti a 10.000 x g a temperatura ambiente per separare la fase acquosa da quella organica.

Ripetere la centrifugazione fino a quando l'interfaccia non sarà compatta. Trasferire con cura la fase acquosa superiore senza disturbare la fase inferiore in una nuova provetta da microcentrifuga da due millilitri con tappo a cerniera. Aggiungere etanolo al 100% di grado ACS a 1,25 volte il volume della fase acquosa acquisita e vorticare per tre secondi.

Posizionare la cartuccia filtrante nelle provette di raccolta. Caricare 600 microlitri di ciascuno dei campioni nella cartuccia filtrante fornita nel kit di isolamento dei microRNA. Centrifugare a 10.000 x g per 90 secondi per filtrare la miscela attraverso la cartuccia.

Quindi scartare il filtrato. Ripetere l'operazione fino a quando l'intero volume della miscela non viene filtrato attraverso la stessa membrana filtrante nelle applicazioni successive. Dopo tutto, il campione viene filtrato.

aggiungere 700 microlitri di soluzione di lavaggio microRNA 1 nella stessa cartuccia filtrante. Centrifugare per 60 secondi per filtrare la soluzione di lavaggio attraverso la cartuccia filtrante. Eliminare il filtrato e posizionare la cartuccia filtrante sullo stesso tubo di raccolta.

Lavare la cartuccia del filtro con 700 microlitri di soluzione di lavaggio 2/3 preparata in etanolo ACS grado 100% e centrifugare a 10.000 x g per un minuto. Scartare il filtrato ottenuto e inserire la cartuccia filtrante nello stesso tubo. Lavare la cartuccia del filtro con 500 microlitri di soluzione di lavaggio 2/3 e centrifugare a 10.000 x g per un minuto.

Scartare il filtrato ottenuto e posizionare la cartuccia filtrante nella stessa provetta di raccolta. Lavare la cartuccia del filtro con 250 microlitri di soluzione di lavaggio 2/3 preparata in ACS grado 100% etanolo e centrifugare a 10.000 x g per un minuto. Scartare il filtrato ottenuto e posizionare la cartuccia filtrante nella stessa provetta di raccolta.

Infine, trasferire la cartuccia del filtro in una nuova provetta di raccolta e far girare il gruppo per cinque minuti per rimuovere il fluido residuo. Trasferire la cartuccia del filtro in una nuova provetta di raccolta, quindi aggiungere 50 microlitri di acqua priva di nucleasi al centro del filtro e tappare il tubo. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 10 minuti.

Quindi centrifugare la provetta per cinque minuti a 8.000 x g per recuperare l'RNA in una nuova provetta di raccolta. Un saggio di elettroforesi dell'RNA basato su chip suggerisce che gli isolati di RNA rappresentativi delle feci di topo e umane sono bassi o privi di composizioni di rRNA 18S e 28S e che la dimensione degli isolati di RNA diminuisce nella regione del piccolo RNA. Un'ulteriore elettroforesi di piccoli RNA con l'elettroforesi basata su chip ha rivelato che gran parte degli RNA sono di dimensioni microRNA.

La purezza dell'RNA estratto era elevata, come indicato dal rapporto di assorbanza di 2,0 per lunghezze d'onda di 260 e 280 nanometri e dal valore del rapporto di 1,8 per l'assorbanza a 260 e 230 nanometri. Per garantire il successo dell'estrazione organica, assicurarsi che le facce siano evidenti e trasferire solo la fase acquosa superiore senza disturbare la fase inferiore, anche a costo di un volume ridotto della nostra fase acquosa.