Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

엔토모병원성 선충류를 유지하고 증폭시키기 위한 효율적인 프로토콜은 선충류 병원성 및 숙주 항선충류 면역의 분자 기초를 이해하는 데 필수적이다. 이 프로토콜을 통해 우리는 곤충 숙주 인 Galleria mellonella를 사용하여 많은 수의 공생 및 축압 이종 횡문염 박테리오포라 및 Steinernema carpocapsae IJ를 생산할 수 있습니다. 페트리 접시를 여과지로 덮고 약 10 ~ 15 마리의 갤러리아 멜로 넬라 유충을 첨가하십시오.

피펫을 사용하여 10 마이크로 리터의 현탁액 당 약 25 ~ 50 명의 감염성 청소년이 들어있는 2 밀리리터의 물을 왁스 웜에 분배하십시오. 그리고 페트리 접시를 실온에서 캐비닛에 보관하십시오. 여과지의 습기에 따라 이틀에 한 두 밀리리터의 물을 넣으십시오.

감염성 청소년에 감염된 왁스 웜은 대개 48 시간 이내에 사망합니다. 왁스 웜이 감염성 청소년에게 감염된 후 약 10 일 후에 White의 물 함정을 준비하십시오. 죽은 곤충을 여과지의 흠뻑 젖지 않은 부분으로 조심스럽게 옮기십시오.

수돗물을 사용하여 바닥 페트리 접시를 채우고 환기를위한 스페이서로 15 밀리리터 튜브의 캡을 놓습니다. 탈염수 또는 탈이온수 대신 수돗물을 사용하여 선충류가 응집되지 않도록하고 물 트랩의 수위가 페트리 접시의 높이의 약 절반에 도달하도록하십시오. 작은 페트리 접시의 물이 선충류로 인해 흐려지면 피펫을 사용하여 새로운 세대의 감염성 청소년을 T25 또는 T75 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.

나중에 수돗물을 최대 40 % 부피 또는 적절한 밀도에 도달 할 때까지 첨가하십시오. 선충류 혼잡을 피하기 위해 세포 배양 플라스크를 수평으로 저장한다. 감염성 청소년을 세포 배양 플라스크로 옮기고 감염성 청소년이 약 사흘에서 오일 내에 곤충 사체에서 출현하는 것을 멈출 때까지 물을 첨가하는 것을 반복하십시오.

접종 루프를 사용하여 Photorhabdus temperata Ret16의 얼어 붙은 배양물의 여러 조각을 MacConkey 플레이트에 긁어 내고 단일 콜로니에 대한 줄무늬를 긁어냅니다. 플레이트를 섭씨 28도에서 이틀에서 사흘 동안 배양한다. 배양 후, LB 배양액 10 밀리리터를 맥콘키 한천에 콜로니와 함께 50 밀리리터 튜브에 접종하고, 진탕 배양기에서 섭씨 28도에서 밤새 배양물을 배양한다.

인큐베이션 후, 밤새 배양된 100 마이크로리터를 50 밀리리터 튜브로부터 새로운 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 이어서 밤새 배양물을 원심주입에 의해 900 마이크로리터의 단일 강도 PBS로 100 마이크로리터로 세척하고, 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에서, 17, 900 배 g에서 세척한다. 상층액을 데칸트하십시오. 다음으로, 배양물을 단일 강도 PBS로 10회 희석하고 튜브를 얼음 위에 두었다.

이제 왁스 웜을 70 % 에탄올 용액에 담그십시오. 종이 타월로 곤충을 말린 후 50 밀리리터 튜브에 넣으십시오. 튜브를 얼음 위에 20 분 동안 올려 놓고 왁스 웜을 고정시킵니다.

여과지를 사용하여 페트리 접시의 위쪽과 아래쪽 절반을 덮으십시오. 여과지로 덮인 페트리 접시 뚜껑을 주사를위한 기본 지지대로 사용하십시오. 바닥 페트리 접시의 여과지에 촉촉하고 얼음에 옮겨 주입 된 왁스 웜이 회복되도록 도와줍니다.

파라필름 조각에 얼음 차가운 박테리아 50 마이크로리터를 피펫한 다음 22 게이지 정련제 바늘 주사기를 준비하고 플런저를 부드럽게 눌러 바늘 끝에서 공기를 제거하였다. 왁스 웜을 스테레오 스코프 아래 후부 끝에 가깝게 유지합니다. 흉부의 등쪽에 박테리아 배양을 주입하십시오.

바람직하게는 왁스 웜과 평행 한 큐티클 바로 아래의 두 세그먼트 사이의 접합부에서 내부 손상을 최소화하고 애벌레 몸체가 부풀어 오르기 시작하는 방법에주의를 기울이십시오. 다음으로, 주입 된 곤충을 회복 페트리 접시로 옮깁니다. 그리고 모든 곤충을 주입하고 회복 접시에 넣으면 페트리 접시를 어둠 속에 두십시오.

왁스 웜은 주사 후 이틀 후에 굴복하고 약 사흘에서 나흘 후에 벽돌 빨간색으로 나타납니다. 그러나 갈색의 곤충은 실패한 박테리아 감염을 나타냅니다. 감염 후 칠일 후, 특징적인 벽돌 - 붉은 색의 곤충을 페트리 접시가 늘어선 신선한 여과지에 옮기고 공생 선충류 감염성 청소년의 생산을 반복하십시오.

표면 살균을 시작하려면 원심분리를 통해 충분한 공생, 이종 횡문염 박테리오포라 및 후보 축삭 감염성 청소년을 수집하십시오. 1.5 밀리리터 원심분리 튜브에서 펠렛을 만들려면 500 마이크로 리터의 5 % 표백제를 각 마이크로 원심분리 튜브의 펠렛에 추가하고 튜브를 뒤집습니다. 10분 동안 배양한 후, 1분 동안 17, 900회 g에서 원심분리하여 상층액을 제거하였다.

그런 다음 펠렛을 한 밀리리터의 멸균수로 씻으십시오. 원심 분리하고, 상층액을 제거하고이 과정을 네 번 더 반복하십시오. 그래프는 축삭화를 거친 이종횡문염 박테리오포라 선충류의 상태를 평가한 결과를 보여준다.

스톡 배양물로부터의 이질횡문염 박테리오포라는 공생 광횡문부 발광 세포를 운반하였다. 그러나, 그들의 연관된 Photorhabdus luminescens 박테리아가 결여된 선충류는 축삭이었다. 실험의 재현성을 유지하려면 항상 신선한 식민지에서 박테리아 스톡 배양물을 갓 떼어내고 고정면에 도달하기 전에 하룻밤 동안 배양을 꺼냅니다.

벽돌 빨간색 갤러리아 왁스 웜을 화이트의 물 함정에만 사용하고 나머지는 버리십시오. 이 절차 후, 선충류는 곤충 면역 체계와의 상호 작용을 조사하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술은 연구자가 선충류 기생의 분자 기초를 탐구하고 항 선충류 면역을 숙주로 삼을 수있는 길을 열어줍니다.