유전적으로 재프로그래밍된 쥐 흑색종의 FFPE 검체를 분석하기 위한 DNA 바코드 기반 다중 면역형광 이미징

우리는 마우스 FFPE 조직을 연구하기 위한 다중 면역형광 패널을 개발 및 검증하기 위한 프로토콜을 제시하고 종양 미세 환경을 재프로그래밍하기 위한 면역학적 신호를 암호화하는 혈장 DNA를 전달하는 나노입자로 처리된 흑색종 모델의 샘플을 연구함으로써 그 유용성을 입증합니다. 이 분야에는 마우스 포르말린 고정 파라핀 포매 FFPE 조직과 호환되는 엄격하게 개발되고 검증된 다중 면역형광 프로토콜이 누락되었습니다.

포르말린 고정 파라핀 포베딩은 조직 형태를 장기적으로 보존하고 취급 및 보관이 용이하며 단일 슬라이드에서 여러 표본을 볼 수 있는 조직 마이크로어레이를 생성할 수 있습니다.

공간 단백질체학 이미징은 복잡한 종양 미세 환경의 시각화 및 분석을 향상시켜 궁극적으로 면역 반응 예측에 도움을 주어 더 나은 치료법 개발에 기여할 수 있습니다.

우리는 이 프로토콜을 사용하여 더 많은 종양 유형과 다양한 면역 기관에 걸쳐 마우스 종양 모델의 향상된 공간 프로파일링을 가능하게 할 것입니다.

[해설자] 시작하려면 FFPE 티슈 슬라이드를 섭씨 60도에서 밤새 굽습니다. 다음날 슬라이드를 실온에서 10분 동안 식힌 후 탈파라핀화 및 재수화를 시작합니다. 다음으로, 슬라이드를 자일렌 용액에 각각 5분 동안 두 번 배양하여 파라핀을 제거한 다음 슬라이드를 100% 에탄올을 통해 각각 5분 동안 두 번 움직여 조직을 재수화합니다. 슬라이드를 90%, 70%, 50% 및 30% 에탄올 용액에 각각 5분 동안 순차적으로 넣습니다. 슬라이드를 증류수로 각각 5분 동안 두 번 씻습니다. 항원 회수를 수행한 다음 항체 염색을 수행하기 전에 신선한 표백액을 사용하여 45분 간격으로 조직을 두 번 표백합니다. 다음으로, 플라스틱 챔버를 사용하여 섭씨 4도에서 밤새 항체 염색을 수행합니다. 염색 후 플라스틱 챔버를 제거하고 이전에 적용한 항체 칵테일을 수집합니다. 슬라이드를 염색 완충액에서 각각 2분 동안 두 번 세척합니다. 40밀리리터의 염색 후 고정 용액이 들어 있는 염색 용기에서 슬라이드를 10분 동안 배양한 다음 PBS로 각각 2분 동안 세 번 헹굽니다. 이제 슬라이드를 얼음처럼 차가운 메탄올에 5분 동안 옮긴 후 PBS로 헹굽니다. 습도 챔버 아래의 각 슬라이드에 200마이크로리터의 최종 고정 용액을 도포합니다. 실온에서 20분 동안 배양한 후, 슬라이드를 PBS에서 각각 2분씩 3주기 동안 다시 세척합니다. 즉시 이미징하는 경우 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 조직 주위의 슬라이드를 닦으십시오. 플로우 셀 조립 장비를 사용하여 플로우 셀을 30초 동안 누릅니다. 나중에 이미징하는 경우 플로우 셀을 적용하지 않고 슬라이드를 섭씨 4도의 저장 버퍼에 보관합니다. 이미징할 준비가 되면 플로우 셀을 적용하기 전에 10분 동안 슬라이드를 저장 버퍼에서 PBS로 옮깁니다. 다음으로, 원하는 이미징 주기에 따라 실행용 DMSO 버퍼를 준비합니다. 총 이미징 주기 수에 필요한 리포터 스톡 용액을 준비합니다. 250마이크로리터의 리포터 원액과 각 리포터의 5마이크로리터를 라벨이 붙은 검은색 또는 호박색 1밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 용액을 검은색 96웰 플레이트에 옮기고 접착 호일로 밀봉합니다. 이제 이미징 장치를 시작하고 기기 관리자를 사용하여 매개변수와 노출 시간을 설정합니다. 리포터 플레이트를 장치에 놓은 다음 슬라이드를 현미경 홀더에 놓아 이미징을 시작합니다. 염색된 조직의 이미지를 획득합니다. 최신 버전의 디지털 병리 분석 소프트웨어를 설치합니다. 프로젝트 작성을 클릭하고 프로젝트 공간의 대상 폴더를 선택하십시오. 그런 다음 이미지 추가를 클릭한 다음 파일 선택을 클릭합니다. 그런 다음 다중 면역형광 이미징에서 생성된 QuP TIFF 파일로 이동합니다. 이미지 유형을 형광으로 설정하고 기본 설정을 유지한 다음 가져오기를 클릭합니다. QuPath를 사용하는 경우 새 이미지를 두 번 클릭하여 작업 공간을 연 다음 파일 및 저장을 주기적으로 눌러 프로젝트 변경 사항을 추적합니다. 도구 모음의 밝기 및 대비 도구를 사용하여 마커 가시성 및 보기 설정을 전환합니다. 브러시 또는 지팡이 도구를 사용하여 전체 조직 섹션 주위에 주석을 그립니다. 이 주석을 전체 조직으로 정의하고 분석해서는 안 되는 위에 있는 피부 또는 영역을 제외합니다. ALT 키를 누른 상태에서 음수 주석을 만들거나 경계를 축소합니다. 이제 주석 탭을 클릭하고 객체를 누른 다음 주석을 누른 다음 선택한 주석 복제를 클릭하여 주석을 선택합니다. SOX 10 채널을 켠 다음 복제된 주석을 축소하여 ALT + 브러시/지팡이 도구를 사용하여 종양 영역을 정의합니다. 이제 전체 조직 주석을 선택합니다. 그런 다음 Objects(개체)로 이동한 다음 Annotations(주석) 및 Expand Annotations(주석 확장)로 이동합니다. 확장 반경을 1마이크로미터로 설정하고 실행을 클릭합니다. 이 새 주석의 이름을 전체 조직 확장으로 바꿉니다. 종양 주석을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 계층에 삽입을 선택합니다. 종양 주석을 다시 선택한 다음 개체, 주석으로 이동한 다음 이제 반전 만들기를 클릭합니다. 이 새 주석을 Troma로 정의하고 모든 조직 섹션에 대해 반복합니다. 셀 분할을 실행하려면 이미지 탭을 클릭하여 픽셀 너비와 이미지 높이를 찾습니다. GitHub에서 StarDist 확장을 다운로드합니다. QuPath 확장 StarDist.jar 파일을 QuPath로 가져옵니다. 또한 GitHub에서 StarDist 그루비 스크립트 파일 및 모델 파일을 다운로드합니다. 각 조직 절편에 대해 종양 및 간질 주석을 모두 선택합니다. 설정 표시줄에서 자동화를 클릭한 다음 스크립트 편집기를 클릭하여 스크립트 인터페이스를 엽니다. 이미지 픽셀 크기에 해당하는 적절한 StarDist 셀 분할 스크립트를 엽니다. 메시지가 표시되면 셀 분할을 위해 StarDistcellsegmodel.pb를 선택합니다. 셀 분할 후 이미지를 저장한 다음 측정, 측정 내보내기를 순차적으로 클릭하고 해당 이미지를 선택한 다음 내보내기 유형을 셀로, 구분 기호를 .csv로 설정합니다. 출력 파일 위치를 선택한 다음 채우기를 클릭하여 관련 지표를 포함합니다. 클러스터링 또는 표현형 분석에 사용할 각 계통 마커에 대해 내보낼 평균값을 하나 선택합니다. 단백질체 데이터의 정규화를 위해 내보낸 CSV 파일을 열고 열 머리글을 잘라 마커 이름만 유지합니다. 최신 버전의 R & R Studio를 설치한 후 GitHub에서 마커 정규화 .r 스크립트를 다운로드하고 실행하여 핵 크기에 따라 셀을 필터링합니다. 각 마커에 대해 최소/최대 정규화를 수행합니다. 완료되면 정규화된 데이터와 함께 새 CSV 파일을 저장합니다. 항체 DNA 바코드 접합은 단백질 겔 전기영동에 의해 확인되었으며, 중쇄 영역에서 추가 밴드를 나타냈습니다. 4-1BBL/IL-12 나노입자 및 전신 항-PD1로 치료한 B16-F10 옆구리 종양의 다중 면역형광 영상은 종양 절편 전반에 걸쳐 뚜렷한 면역 마커 발현을 보여주었습니다. FlowSOM 클러스터링은 Seurat 표현형 분석에 비해 더 넓은 범위의 마커 발현 강도를 확인했으며 최대 강도 차이는 약 0.7 대 0.5였습니다. FlowSOM 표현형 분석은 또한 더 많은 수의 대식세포를 M1 및 M2 하위 유형으로 분류했습니다. 대식세포 밀도의 정량화에 따르면 FlowSOM은 Seurat에 비해 M1 및 M2 대식세포의 밀도가 더 높은 반면 Seurat는 더 많은 대식세포를 기타로 분류했습니다. 공간 분석 결과 M2 대식세포와 자연 살해 세포는 치료 후 평균 최소 거리가 가장 높았고 M1 대식세포는 CD8 T 세포 주변에서 더 널리 퍼져 있는 것으로 나타났습니다.