血管化複合同種移植のための 生体外 灌流ベースのバイオリアクターを用いたラット後肢の調達と脱細胞化

四肢の脱細胞化のための小動物モデルを確立しました。これは、血管新生複合組織の脱細胞化および再細胞化に関する概念実証研究を促進するのに役立ちます。免疫抑制レジメンは、血管新生複合同種移植における主な制限の1つです。

組織免疫原性は、脱細胞化を用いて低下させることができる。まず、鼠径靭帯に沿って10番の手術用ブレードを使用して皮膚を切開し、周囲の皮膚をアドソン鉗子で保持しながら、外側から内側に移動します。下にある脂肪が露出したら、鈍的解剖を使用して脂肪を注意深く解剖し、上腹部血管を見つけます。

マイクロハサミを使用して、近位に解剖し、下にある大腿神経、動脈、および静脈を鼠径靭帯レベルで露出させます。解剖顕微鏡下で大腿血管を特定し、動脈網の分岐点から十分な長さを得るために細かい鉗子を使用して動脈と静脈を近位に解剖します。次に、6-0縫合糸を使用して大腿静脈と動脈を別々に結紮します。

次に、結紮した大腿骨血管を乱さずに後肢の残りの部分を中心に円周方向の解剖を行い、ボーンカッターを使用して大腿骨を中央の長さに横断します。後肢を完全に隔離するには、マイクロハサミを使用して結紮した大腿血管を結紮糸の遠位に横断し、解剖顕微鏡下で24ゲージの血管カテーテルを使用して大腿動脈をカニューレ挿入します。その後、大腿静脈から明らかな流出が観察されるまで、ヘパリン化生理食塩水で洗い流します。

カニューレ自体の周りの遠位にある別の縫合糸でカニューレ血管の周りに1つの縫合糸を結び、分岐点を塞がないようにカニューレが近位に配置されるようにして、カニューレを固定します。その後、調達した後肢とPBSを脱細胞化まで沈める。バイオリアクターを構築するには、滅菌チャンバーを配置し、入口、出口、および補充ラインに3つの使い捨て3方向活栓をねじ込み、補充ポートの活栓が漏れを防ぐために残りの2つのポートでキャップされていることを確認します。

以前に作成したシリコンチューブを入口ラインと出口ラインの活栓に取り付けます。次に、蠕動チューブをシリコンチューブに接続します。カセットを蠕動チューブに固定した後、蠕動ポンプに置きます。

次に、シリコンチューブの1つを、上記の手順の出口ラインの蠕動チューブの端に接続します。もう一方の端に、1ミリリットルの血清学的ピペットを接続し、血清学的ピペットで取り付けられた端部を廃液貯留フラスコに再懸濁する。次に、血清学的ピペットに取り付けられたチューブの端部を界面活性剤リザーバーに吊り下げ、直ちに界面活性剤リザーバーフラスコの開口部をパラフィルムで密封した。

1リットルのガラス瓶から0.25%SDSを中間レベルのバイオリアクターチャンバーに追加します。次に、アドソン鉗子を使用して調達した後肢を取り、バイオリアクターチャンバーに慎重に吊り下げます。2対のアドソン鉗子を使用して、1対の鉗子でカニューレを保持しながら、後肢のカニューレ部分を入口ラインに導きます。

もう一方の鉗子を使用して、入口ラインをねじってカニューレに固定します。固定したら、1リットルのガラス瓶から0.25%SDSを追加して、必要に応じて手足を完全に水没させ、出口ポートもバイオリアクターリザーバーに沈め、一貫した流出が維持されるようにします。次に、バイオリアクターチャンバーの蓋の換気口に使い捨てシリンジフィルターを取り付け、バイオリアクターの蓋を固定して、チャンバーがすべての側面から密閉されていることを確認します。

チューブから空気を除去し、灌流回路をプライミングするには、新しい使い捨て10ミリリットルシリンジを使用して、入口ラインの3方向活栓を使用して洗剤リザーバーから洗剤を引き出します。描画したら、同じ液体を使用して、出口ラインの三方活栓に挿入します。次に、カセットを押し下げてチューブで蠕動ポンプに固定します。

次に、電源ボタンを使用して蠕動ポンプをオンにします。蠕動ポンプ画面で、矢印キーを使用して2番目のタブに進み、入力流量を送達モードとして最初のチャネルの灌流速度を設定し、灌流速度を毎分1ミリリットルに設定して、装置のセットアップに従って流れの方向が正しいことを確認します。蠕動ポンプを校正して、入口ラインを介して供給される流体、および/または出口ラインから取り出される流体の量が2つの間で一貫して流れるようにし、チューブIDが1.85ミリメートルに設定されていることを確認します。

キーパッドの電源ボタンを押して、入口ラインと出口ラインの両方で毎分1ミリリットルで機械灌流による脱細胞化を開始します。流れが入口ラインと出口ラインの両方で進行中であることを監視および確認します。1リットルの0.25%STSを使用して、必要に応じて補充ポートからバイオリアクターリザーバーを補充します。

次に、ラットの後肢の脱細胞化を示す、5日目までに現れる組織の白い半透明の外観を探します。脱細胞化の確認後、界面活性剤リザーバーをPBSおよび1%抗生物質-抗真菌リザーバーに交換し、フラスコの開口部をパラフィルムで密封します。PBSと1%抗生物質-抗真菌剤灌流を毎分1ミリリットルで開始し、2日間続けます。.

PBSと1%抗生物質-抗真菌リザーバーを200ミリリットルの0.1%寄生酸、4%エタノールリザーバーと交換し、毎分1ミリリットルで2時間灌流を開始します。バイオセーフティキャビネットの下で、2対の滅菌アドソン鉗子を使用して後肢を入口ラインから切り離し、1対の鉗子で入口ラインをねじり、もう1対がカニューレを保持し、カニューレが引っ張られないようにして脱カニュレーションを防ぎます。さらに使用するまで、PBSと1%抗生物質-抗真菌薬が入った4ミリリットルのガラス瓶に手足を保管します。.

脱細胞化大腿動脈と静脈の両方が、本来の血管に存在する青色に染色された核がないことを考えると、すべての層と周囲の結合組織にわたって核含有量の損失を示しました。大腿静脈と動脈の両方の中膜内膜と外膜は、脱細胞化血管で維持されました。大腿神経は神経内膜を含む組織構造の保存を示した。

骨は、骨細胞の染色核の喪失、および脱細胞化後の周囲の骨内膜および骨膜層からの全体的な構造保持を示しました。皮膚は表皮および真皮からの細胞の喪失を示した。真皮は、天然の皮膚組織と同様のコラーゲン線維を保持していた。

最後に、骨格筋の横方向の図は、そうでなければ筋内膜の周辺に位置する核の喪失を示した。筋原線維含有量は、脱細胞化後もそれぞれの束内に保持されたままであった。PicoGreenを使用したDNA定量も行われ、大腿血管、神経、皮膚、筋肉、骨全体でDNA含有量が大幅に減少しました。

このプロトコルに従って、脱細胞化された肢をさらに特徴付けることができる。これには、組織学的方法と生化学的方法の両方を使用して細胞外マトリックスを調べ、イメージングを使用して血管を評価することが含まれます。脱細胞化されたステムは、組織特異的細胞を用いて再細胞化することもできる。